A modified CTAB protocol (Murray and Thompson, 1980) was used
to extract total genomic DNA from expanded young leaves of the
regenerated plants in all the treatments and controls. PCR
amplification was performed by using SSR markers pdc1 (F- 5’CCC
ATC TCA CCA GAC CA3’; R-5’CTG TTG GCA GCC GAG A3’)
linked to pdc1gene (Hossain 1996). The primers were from comercially
available primer kit (Sigma Genosys, California, USA). Individual
PCR amplifications for each primer were performed using the
EP gradient 96 V programmable master cycler (Eppendorf AG,
Hamburg, Germany.).The PCR protocol involved a total volume of
10μl reaction mixture containing 35 ng of genomic DNA, 1X PCR
buffer (pH 8.3), 200μM dNTP mix, 5 pmol of each of the forward
and reverse primers, 2 mM of MgCl2 and 1 U of Taq (Thermophilus
aquaticus) DNA polymerase (Biotools). The basic PCR program to
amplify DNA was as follows: an initial hot start and denaturing step
at 94°C for 5 min followed by 35 cycles of a 2 min denaturation at
94°C, a 1 min annealing at 50°C, and a 1 min primer elongation at
72°C. A final extension step at 72°C for 5 min was performed.
โปรโตคอลที่ได้รับการแก้ไข ctab (คุณ Murray และธอมป์สัน 1980 )เป็น
ซึ่งจะช่วยในการสกัดนำมาใช้ดีเอ็นเอ genomic ทั้งหมดจากใบหนุ่มขยายของพันธุ์ไม้
ซึ่งจะช่วยในการควบคุม คุณภาพ และการบำบัดทั้งหมด pcr
ใช้การขยายเสียงได้ดำเนินการโดยใช้ SSR ประกบสองตัวให้ตรงกันโดย PDC 1 ( F - 5 ' CCC
ATC tca cca ( GAC )ไม่ 3 '; R 5 ' ctg ttg GCA ,เฉพาะ GCC ปิดปากที่ 3 ')
เชื่อมโยงกับให้ตรงกันโดย PDC 1 ยีน( hossain 1996 ) primers มาจาก comercially
ตามมาตรฐานชุดเชื้อปะทุพร้อมใช้งาน( Six Sigma genosys ,แคลิฟอร์เนีย,สหรัฐอเมริกา) แต่ละคน
pcr amplifications สำหรับแต่ละ Primer มาดำเนินการโดยใช้
EP การไล่ระดับสี 96 V สามารถตั้งโปรแกรมได้นาย cycler ( eppendorf แอนติกาและบาร์บูดา,
ฮัมบูร์ก,เยอรมนี).ที่เกี่ยวข้องกับโปรโตคอลที่ pcr จำนวน 10 μl
ซึ่งจะช่วยในการตอบสนองการผสมผสานประกอบด้วย 35 ไนจีเรียของ genomic ดีเอ็นเอ, 1 x pcr
Buffer ( PH 8.3 ), 200 μ m dntp ผสมให้เข้ากัน, 5 pmol ของแต่ละ
ซึ่งจะช่วยส่งต่อและย้อนกลับ primers ,2 ม.ม.ของ mgcl 2 และ 1 U ของ taq ( aquaticus thermophilus
) polymerase ดีเอ็นเอ( biotools ) จะ pcr พื้นฐาน
ซึ่งจะช่วยเพิ่มขีดความสามารถให้กับโปรแกรมในดีเอ็นเอเป็นดังนี้ที่เริ่มต้นความร้อนเริ่ม( Start )และ denaturing ขั้นตอน
ที่ 94 ° C สำหรับ 5 นาทีตามด้วย 35 รอบใน 2 นาที denaturation ที่
94 ° C ,ที่ 1 นาที annealing ที่ 50 ° C ,และที่ 1 นาทีเชื้อปะทุ elongation ที่
72 ° C ขั้นตอนที่ขยายเวลาครั้งสุดท้ายในนาทีที่ 72 ° C สำหรับ 5 ได้ดำเนินการ
การแปล กรุณารอสักครู่..