2. Materials and methods2.1. Phyllo

2. Materials and methods
2.1. Phyllody isolates and nucleic acid extraction

Ten phyllody disease affected black pepper samples collected from Kozhikode District of Kerala state, India were used in this study. Spikes collected from asymptomatic black pepper plants from Kannur District of Kerala state, India were used as healthy control. Total DNAs were extracted from healthy and malformed black pepper spikes using DNA Plant kit (Macherey-Nagel, Duren, Germany). Total DNAs extracted from a known phytoplasma (periwinkle little leaf) was used as positive control. Water control (without template DNA) was also included in all the PCR reaction to check for contamination if any.

2.2. Nested PCR

The total genomic DNA was subjected to nested PCR using universal primers designed to amplify a specific sequence within the 16S rDNA of phytoplasmas (Gundersen and Lee, 1996). Primers P6 (5′ CGGTAGGGATCACTTGTTACGACTTA 3′) (Deng and Hiruki, 1991) and SN910601 (5′ CGAAAAAACCTTACCAGGTCTTTG 3′) (Namba et al., 1993) were used for the first round amplification of the 16S rDNAs. For the second round, to amplify an internal fragment of the 16S rDNA, primers R16F2n (5′ GAAACGACTGCTAAGACTGG 3′) corresponding to bases 144–163 and R16R2 (5′ TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 3′) corresponding to bases 1365–1386 (Lee et al., 1993) were used. The PCR reaction (100 μl) contained 200 ng each of the primers, 2.5 units Taq Polymerase 1× PCR buffer, 1.25 mM MgCl2 and 10 μM each of the dNTPs. PCR mix (27 μl) containing the above components was added to the tubes containing the template DNA (73 μl) resulting in a final reaction volume of 100 μl. Amplification was performed in an automated thermal cycler (Eppendorf Master Cycler Gradient) programmed for one cycle of 94 °C for 3 min followed by 35 cycle reaction profile involving 30 s of denaturation at 94 °C, 60 s of annealing at 53 °C and 90 s of extension at 72 °C and single cycle of final extension at 72 °C for 10 min for the first round amplification. The reaction product (1 μl) of first round amplification was used as template for the second round of amplification with similar reaction profile except for the annealing step, which was carried out at 56 °C (instead of 53 °C).

2.3. Cloning of PCR product and sequencing

Following PCR, reaction products were analysed by 1% agarose gel electrophoresis in Tris–acetate EDTA (TAE) buffer containing ethidium bromide (0.4 μg/ml). DNA was visualized and photographed using a UV transilluminator and a gel documentation apparatus (Alpha Innotech Corporation, CA, USA). 500 bp ladder was used as a size standard. The PCR product was purified using Strata Prep PCR purification kit (Stratagene, LaJolla, CA, USA) followed by polishing the purified PCR product using Pfu DNA Polymerase (Stratagene, LaJolla, CA, USA) and dNTP mix. The resultant product was then cloned into pPCR Script Amp SK (+) cloning vector using pPCR Script Amp SK (+) cloning vector kit (Stratagene, LaJolla, CA, USA) and competent Escherichia coli (strain DH5α) were transformed by following standard molecular biology procedures ( Sambrook and Russell, 2001). Recombinant clones were identified by restriction endonuclease digestion, and selected clones were sequenced with automated sequencing of Applied Biosystems (ABI prism) following dideoxy chain terminator sequencing protocol (Perkin-Elmer).

2.4. Sequence analyses

Sequence data were compiled using Seqaid Version 3.6 (Rhoads and Roufa, 1985). Multiple sequence alignments were made using Clustal W (Thompson et al., 1994). Phylogenetic tree was constructed by Neighborhood Joining Bootstrap method (Bootstrap analysis with 1000 replicates) in Clustal X (1.81) and rooted tree was generated using TREEVIEW software (Win 32) (Page, 1996). The 16S rDNA nucleotide sequences of other phytoplasma isolates used for comparison (Table 1) were obtained from GenBank (Benson et al., 1999). The BLAST programme (Altschul et al., 1997) was used to identify related sequences available from the GenBank database.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. phyllody แยกและสกัดกรดนิวคลีอิกตัวอย่างพริกได้รับผลกระทบโรค phyllody สิบที่รวบรวมจากอำเภอกอซิโกดเกรละรัฐ อินเดียถูกใช้ในการศึกษานี้ Spikes ที่รวบรวมจากพริกไทยดำแสดงอาการที่ใช้เป็นอาหารเสริมเพื่อสุขภาพควบคุมพืชจากอำเภอ Kannur เกรละรัฐ อินเดีย รวม DNAs ถูกสกัดจากพริกไทยมีสุขภาพดี และมี spikes ใช้ชุดดีเอ็นเอพืช (Macherey Nagel, Duren เยอรมนี) รวมสกัดจาก phytoplasma รู้จัก DNAs (periwinkle น้อยใบ) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมค่าบวก ควบคุมน้ำ (ไม่ มีแม่แบบดีเอ็นเอ) นอกจากนี้ยังรวมอยู่ในปฏิกิริยา PCR เพื่อตรวจสอบถ้ามีการปนเปื้อน2.2 การซ้อน PCRThe total genomic DNA was subjected to nested PCR using universal primers designed to amplify a specific sequence within the 16S rDNA of phytoplasmas (Gundersen and Lee, 1996). Primers P6 (5′ CGGTAGGGATCACTTGTTACGACTTA 3′) (Deng and Hiruki, 1991) and SN910601 (5′ CGAAAAAACCTTACCAGGTCTTTG 3′) (Namba et al., 1993) were used for the first round amplification of the 16S rDNAs. For the second round, to amplify an internal fragment of the 16S rDNA, primers R16F2n (5′ GAAACGACTGCTAAGACTGG 3′) corresponding to bases 144–163 and R16R2 (5′ TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 3′) corresponding to bases 1365–1386 (Lee et al., 1993) were used. The PCR reaction (100 μl) contained 200 ng each of the primers, 2.5 units Taq Polymerase 1× PCR buffer, 1.25 mM MgCl2 and 10 μM each of the dNTPs. PCR mix (27 μl) containing the above components was added to the tubes containing the template DNA (73 μl) resulting in a final reaction volume of 100 μl. Amplification was performed in an automated thermal cycler (Eppendorf Master Cycler Gradient) programmed for one cycle of 94 °C for 3 min followed by 35 cycle reaction profile involving 30 s of denaturation at 94 °C, 60 s of annealing at 53 °C and 90 s of extension at 72 °C and single cycle of final extension at 72 °C for 10 min for the first round amplification. The reaction product (1 μl) of first round amplification was used as template for the second round of amplification with similar reaction profile except for the annealing step, which was carried out at 56 °C (instead of 53 °C).
2.3. Cloning of PCR product and sequencing

Following PCR, reaction products were analysed by 1% agarose gel electrophoresis in Tris–acetate EDTA (TAE) buffer containing ethidium bromide (0.4 μg/ml). DNA was visualized and photographed using a UV transilluminator and a gel documentation apparatus (Alpha Innotech Corporation, CA, USA). 500 bp ladder was used as a size standard. The PCR product was purified using Strata Prep PCR purification kit (Stratagene, LaJolla, CA, USA) followed by polishing the purified PCR product using Pfu DNA Polymerase (Stratagene, LaJolla, CA, USA) and dNTP mix. The resultant product was then cloned into pPCR Script Amp SK (+) cloning vector using pPCR Script Amp SK (+) cloning vector kit (Stratagene, LaJolla, CA, USA) and competent Escherichia coli (strain DH5α) were transformed by following standard molecular biology procedures ( Sambrook and Russell, 2001). Recombinant clones were identified by restriction endonuclease digestion, and selected clones were sequenced with automated sequencing of Applied Biosystems (ABI prism) following dideoxy chain terminator sequencing protocol (Perkin-Elmer).

2.4. Sequence analyses

Sequence data were compiled using Seqaid Version 3.6 (Rhoads and Roufa, 1985). Multiple sequence alignments were made using Clustal W (Thompson et al., 1994). Phylogenetic tree was constructed by Neighborhood Joining Bootstrap method (Bootstrap analysis with 1000 replicates) in Clustal X (1.81) and rooted tree was generated using TREEVIEW software (Win 32) (Page, 1996). The 16S rDNA nucleotide sequences of other phytoplasma isolates used for comparison (Table 1) were obtained from GenBank (Benson et al., 1999). The BLAST programme (Altschul et al., 1997) was used to identify related sequences available from the GenBank database.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 Phyllody แยกและการสกัดกรดนิวคลีอิกสิบโรคphyllody ได้รับผลกระทบตัวอย่างพริกไทยดำที่เก็บรวบรวมจากเขต Kozhikode แห่งรัฐเกรละอินเดียถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้ แหลมที่เก็บได้จากพืชพริกไทยดำไม่มีอาการจากนูร์เขตรัฐเกรละอินเดียถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมที่มีสุขภาพดี DNAs ทั้งหมดถูกสกัดจากสุขภาพดีและไม่ถูกต้องแหลมพริกไทยดำโดยใช้ชุดดีเอ็นเอ Plant (Macherey-แจคกี้ Duren, เยอรมนี) รวมดีเอ็นเอที่สกัดจาก phytoplasma ที่รู้จักกัน (หอยขมใบเล็ก ๆ ) ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมในเชิงบวก การควบคุมน้ำ (ไม่ดีเอ็นเอแม่แบบ) ก็รวมอยู่ในทุกปฏิกิริยา PCR ในการตรวจสอบการปนเปื้อนถ้ามี. 2.2 PCR ซ้อนดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมดที่ถูกยัดเยียดให้PCR ที่ซ้อนกันโดยใช้ไพรเมอร์สากลที่ออกแบบมาเพื่อขยายลำดับที่เฉพาะเจาะจงภายใน 16S rDNA ของไฟโตพลาสมา (Gundersen และลี, 1996) ไพรเมอร์ P6 (5 'CGGTAGGGATCACTTGTTACGACTTA 3') (เติ้งและ Hiruki, 1991) และ SN910601 (5 'CGAAAAAACCTTACCAGGTCTTTG 3') (Namba et al., 1993) ถูกนำมาใช้สำหรับการขยายรอบแรกของ 16S rDNAs สำหรับรอบที่สองเพื่อขยายชิ้นส่วนภายในของ 16S rDNA ไพรเมอร์ R16F2n (5 'GAAACGACTGCTAAGACTGG 3') ที่สอดคล้องกับฐาน 144-163 และ R16R2 (5 'TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG 3') ที่สอดคล้องกับฐาน 1365-1386 (Lee et al, , 1993) ถูกนำมาใช้ ปฏิกิริยา PCR (100 ไมโครลิตร) ที่มี 200 ng แต่ละไพรเมอร์ 2.5 หน่วย Taq โพลิเมอร์ 1 ×บัฟเฟอร์ PCR 1.25 มิลลิ MgCl2 และ 10 ไมครอนแต่ละ dNTPs ผสม PCR (27 ไมโครลิตร) ที่มีส่วนประกอบดังกล่าวข้างต้นถูกบันทึกอยู่ในท่อที่มีแม่แบบดีเอ็นเอ (73 ไมโครลิตร) ส่งผลให้ปริมาณการเกิดปฏิกิริยาสุดท้ายของ 100 ไมโครลิตร ขยายได้ดำเนินการใน Cycler ความร้อนอัตโนมัติ (Eppendorf โท Cycler ไล่โทนสี) โปรแกรมสำหรับหนึ่งรอบ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย 35 รอบรายละเอียดปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับวันที่ 30 ของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 ° C 60 ของการอบที่ 53 องศาเซลเซียสและ 90 ของส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสและรอบเดียวของการขยายสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีสำหรับการขยายรอบแรก ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา (1 ไมโครลิตร) ของการขยายรอบแรกถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับรอบที่สองของการขยายปฏิกิริยากับโปรไฟล์ที่คล้ายกันยกเว้นสำหรับขั้นตอนการอบซึ่งได้ดำเนินการที่ 56 ° C (แทน 53 ° C). 2.3 โคลนของผลิตภัณฑ์ PCR และลำดับต่อไปนี้PCR ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาวิเคราะห์ 1% agarose ข่าวคราวใน EDTA Tris-acetate (TAE) บัฟเฟอร์ที่มี ethidium bromide (0.4 g / ml) ดีเอ็นเอถูกมองเห็นและถ่ายภาพโดยใช้ transilluminator รังสียูวีและอุปกรณ์เอกสารเจล (อัลฟา Innotech คอร์ปอเรชั่น, CA, USA) 500 bp บันไดที่ใช้เป็นขนาดมาตรฐาน ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์โดยใช้ชุดฟอกชั้นเตรียม PCR (Stratagene, LaJolla, CA, USA) ตามด้วยการขัดผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์โดยใช้ Pfu ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Stratagene, LaJolla, CA, USA) และการผสมผสาน dNTP ผลิตภัณฑ์ผลเป็นโคลนแล้วเป็น pPCR สคริปต์แอมป์เอสเค (+) โคลนเวกเตอร์ใช้ pPCR สคริปต์แอมป์เอสเค (+) โคลนชุดเวกเตอร์ (Stratagene, LaJolla, CA, USA) และมีอำนาจเชื้อ Escherichia coli (สายพันธุ์DH5α) ถูกเปลี่ยนโดยทำตามโมเลกุลมาตรฐาน ขั้นตอนทางชีววิทยา (Sambrook และรัสเซล, 2001) โคลน recombinant ถูกระบุข้อ จำกัด endonuclease การย่อยอาหารและโคลนที่เลือกมีลำดับขั้นตอนที่มีการเรียงลำดับอัตโนมัติของ Applied Biosystems (ปริซึม ABI) ดังต่อไปนี้เทอร์มิโซ่ dideoxy โปรโตคอลลำดับ (เพอร์กินเอลเมอ). 2.4 ลำดับวิเคราะห์ข้อมูลลำดับถูกรวบรวมโดยใช้ Seqaid เวอร์ชั่น 3.6 (โรดห์และ Roufa, 1985) การจัดแนวหลายลำดับที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ Clustal วัตต์ (ธ อมป์สัน et al., 1994) Phylogenetic ต้นไม้ถูกสร้างขึ้นจากพื้นที่ใกล้เคียงเข้าร่วมวิธีการบูต (วิเคราะห์ Bootstrap 1000 ซ้ำ) ใน Clustal X (1.81) และต้นไม้ที่หยั่งรากถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ TREEVIEW (Win 32) (หน้า 1996) 16S rDNA ลำดับเบสของแยก phytoplasma อื่น ๆ ที่ใช้สำหรับการเปรียบเทียบ (ตารางที่ 1) ที่ได้รับจาก GenBank (เบนสัน et al., 1999) โปรแกรม BLAST (Altschul et al., 1997) ถูกนำมาใช้เพื่อระบุลำดับที่เกี่ยวข้องที่มีอยู่จากฐานข้อมูล GenBank