Forward primers for each pair were

Forward primers for each pair were labeled with tetrachloro-6-
carboxy-fluorescine (TET) fluorescent dye at the 5′-end. PCR for
genotyping was performed in 11 μl volumes containing 0.05 pmol/μl
of forward primer, 0.5 pmol/μl of reverse primer, 1× reaction buffer,
2.0 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1% BSA, 0.025 U of Taq polymerase
(Takara: Ex-Taq, Japan) and 25 ng of genomic DNA. Cycle amplification
was performed in MJ PTC-100 (Bio-Rad, USA) for 5 min at 95 °C as an
initial denaturation, 36 cycles of 30 s at 95 °C, 1 min at an annealing
temperature (56 °C), 1 min at 72 °C and 10 min at 72 °C for final extension.
Amplification products weremixed with an equal volume of loading
buffer (98% formaldehyde, 10 mM EDTA and 0.05% bromophenol
blue), heated for 10 min at 95 °C and then immediately cooled on ice.
The mixturewas loaded onto 6% Page-plus gel (Amresco, OH, USA) containing
7 Murea and 0.5× TBE buffer. Electrophoresiswas performed in
0.5× TBE buffer at 1800 V constant voltage for 1.5 h. After electrophoresis,
the gelwas scanned and imaged using an FMBIO III Multi-View fluorescence
image analyzer (Hitachi-soft, Japan).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ไพรเมอร์ไปข้างหน้าสำหรับแต่ละคู่ถูกติดป้าย tetrachloro-6 -สีย้อมฟลูออเรส carboxy-fluorescine (TET) ที่สุด 5′ PCR สำหรับgenotyping ทำในไดรฟ์ μl 11 ประกอบด้วย 0.05 pmol/μlรองพื้นไปข้างหน้า pmol 0.5 μl กลับพื้น 1 การ บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา2.0 mM MgCl2, dNTPs 0.2 mM บีเอสเอ 1% พอลิเมอเรส U Taq 0.025(Takara: อดีต-Taq ญี่ปุ่น) และ 25 ng ของ genomic DNA วงจรขยายทำใน MJ PTC-100 (Bio Rad สหรัฐอเมริกา) ใน 5 นาทีที่ 95 ° C เป็นการเริ่มต้น denaturation รอบ 36 30 s ที่ 95 ° C, 1 นาทีที่มีการอบเหนียวอุณหภูมิ (56 ° C), 1 นาที ที่ 72 ° C และ 10 นาทีที่ 72 ° C สำหรับส่วนขยายสุดท้ายขยายผลิตภัณฑ์ weremixed กับปริมาตรการเท่ากันของโหลดบัฟเฟอร์ (98% ฟอร์มาลดีไฮด์ bromophenol EDTA และ 0.05% 10 มม.สีฟ้า), ความร้อนใน 10 นาทีที่ 95 ° C และจากนั้น ทันทีระบายความร้อนด้วยบนน้ำแข็งMixturewas ที่โหลดไปยังประกอบด้วยเจหน้าบวก 6% (Amresco, OH สหรัฐอเมริกา)7 Murea และ 0.5 × TBE บัฟเฟอร์ ดำเนินการใน Electrophoresiswasบัฟเฟอร์ TBE 0.5 ×ที่ 1800 V แรงดันไฟฟ้าคงที่สำหรับ 1.5 h หลังจาก electrophoresisgelwas สแกน และ imaged ใช้ fluorescence FMBIO III ดูหลายที่วิเคราะห์ภาพ (ฮิตาชิอ่อน ญี่ปุ่น)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ส่งต่อรองพื้นสำหรับแต่ละคู่มีป้าย ด้วย tetrachloro-6 -
คาร์บ fluorescine ( Tet ) สีเรืองแสงที่ 5 ’ - จบ ซึ่งถูกจัดขึ้นในเขต 11 μ
l ปริมาณที่มีระดับ pmol / μ L
ของ forward primer 0.5 ลิตร / μ pmol ย้อนกลับ ไพรเมอร์ บัฟเฟอร์ ปฏิกิริยา 1 ×
ชุด , 2.0 มม. , 0.2 มม. dntps 1 % BSA , 0.025 U ของแท็กการ
( Takara : แท็ค แฟนเก่าของญี่ปุ่น ) และ 25 นาโนดีเอ็นเอ .
แบบวงจรแสดงในเจ ptc-100 ( USA ไบแรด ) เป็นเวลา 5 นาทีที่ 95 องศา C เป็น
( เริ่มต้นที่ 36 รอบ 30 s ที่ 95 องศา C , 1 นาที ที่อุณหภูมิการอบอ่อน ( 56 ° C )
1 นาทีที่ 72 ° C และ 10 นาทีที่ 72 ° C สำหรับ ส่งเสริมผลิตภัณฑ์สุดท้าย .
( weremixed ด้วยปริมาณเท่ากับน้ำหนัก
บัฟเฟอร์ ( ฟอร์มาลดีไฮด์ , 98% 10 mM EDTA และ 0.05 % โบรโมฟีนอล
สีฟ้า )ร้อนสำหรับ 10 นาทีที่ 95 องศา C และจากนั้นทันทีลงบนน้ำแข็ง mixturewas
โหลดลง 6% หน้าพลัสเจล ( amresco , โอ้ , USA ) ประกอบด้วย
7 murea และ 0.5 ×ทีบีบัฟเฟอร์ electrophoresiswas แสดง
0.5 ×ทีบีบัฟเฟอร์ที่ 1800 v คงที่แรงดัน 1.5 ชั่วโมง หลังจากที่อิเล็ก
gelwas สแกนและอื่นๆโดยใช้ fmbio 3 มัลติวิวเรืองแสง
ภาพวิเคราะห์ ( ฮิตาชิ นุ่ม , ญี่ปุ่น )