3.2.1. Sample preparation for fluor

3.2.1. Sample preparation for fluorometric analysis
Cells are seeded the day before analysis at 5–20  103 cells in
100 ll per well in 96-well adherent plates using L15 medium
(Leibovitz), which allows CO2-independent buffering. The next
day the cells should be 80% confluent at the most when inducing
cell death. Add a cell impermeant dye 30 min before measurement
(e.g. Sytox Green to obtain a final concentration of 5 lM), and put
the cells back at 37 C. Sytox Green intensity can then be
measured on a fluorescence plate reader in function of time. The
choice of excitation and emission filters depends on the probe
used. To ensure an average value that accurately reflects the extent
of cell death per well, it is advised to set up multiple reads per well
via orbital averaging with a diameter of 3 mm for 96-well plates to
avoid border effects. The obtained value is referred to as ICD (induced
cell death). To obtain the maximum Sytox Green intensity
per well, which corresponds to 100% cell death (MCDn), Triton
X-100 is added to each well to a final concentration of 0.1%. Cells
are incubated for 1 h at 37 C and Sytox Green intensity is
measured again [27]. The value obtained is referred to as MCD
(max cell death). Results are expressed as percentage cell death
per well (Fig. 1), which can be calculated by the following formula:

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3.2.1. ตัวอย่างการเตรียมการสำหรับการวิ fluorometricเซลล์มี seeded วันก่อนวิเคราะห์ที่เซลล์ 5-20 103100 จะต่อดีในแผ่น 96 ดีนฤมลใช้สื่อ L15(นนีเลโบวิตช์), ซึ่งช่วยให้ CO2 อิสระบัฟเฟอร์ ถัดไปวันที่เซลล์ควร confluent 80% ที่มากที่สุดเมื่อ inducingเซลล์ตาย เพิ่มเซลล์สี impermeant 30 นาทีก่อนวัด(เช่น Sytox สีเขียวเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 5 lM), และเซลล์ที่ความเข้มของสีเขียว Sytox C. 37 ได้แล้ววัดบนเครื่องอ่านแผ่น fluorescence ในฟังก์ชันของเวลา ที่ทางเลือกของตัวกรองในการกระตุ้นและปล่อยก๊าซขึ้นอยู่กับโพรบใช้ ให้ค่าเฉลี่ยที่ถูกต้องสะท้อนให้เห็นถึงขอบเขตเซลล์ตายต่อดี คุณควรจะตั้งค่าอ่านหลายต่อด้วยผ่านการหาค่าเฉลี่ยของวงโคจรมีเส้นผ่าศูนย์กลาง 3 มม.สำหรับแผ่น 96 ดีไปหลีกเลี่ยงลักษณะเส้นขอบ ค่าที่ได้รับจะเรียกว่า ICD (ทำให้เกิดเซลล์ตาย) เพื่อให้ได้ความเข้ม Sytox สีเขียวสูงสุดต่อความ ซึ่งตรง 100% เซลล์ตาย (MCDn), ไตรตั้นX 100 เพิ่มไปด้วยเพื่อความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.1% เซลล์มี incubated สำหรับ h 1 ที่ 37 C และความเข้มของสีเขียว Sytoxวัดอีกครั้ง [27] ค่าที่ได้จะเรียกว่าเฮิร์ด(สูงสุดเซลล์ตาย) ผลลัพธ์จะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์เซลล์ตายต่อดี (Fig. 1), ซึ่งสามารถคำนวณได้จากสูตรต่อไปนี้:

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.2.1 การเตรียมความพร้อมสำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างฟลูออโร
เซลล์จะเมล็ดวันก่อนการวิเคราะห์ที่ 5-20? 103 เซลล์ใน
100 LL ต่อดีในแผ่น 96 หลุมพรรคพวกใช้สื่อ L15
(Leibovitz) ซึ่งช่วยให้การกำหนดบัฟเฟอร์ CO2 อิสระ ต่อไป
วันเซลล์ที่ควรจะไหลมารวมกัน 80% ที่มากที่สุดเมื่อการกระตุ้นให้เกิด
การตายของเซลล์ เพิ่มสีย้อมเซลล์ impermeant 30 นาทีก่อนที่จะวัด
(เช่น Sytox? สีเขียวเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 5 LM) และนำ
เซลล์กลับมาที่ 37 องศาเซลเซียส Sytox? สีเขียวเข้มนั้นจะสามารถ
วัดอ่านแผ่นเรืองแสงในการทำงานของเวลา
ทางเลือกของการกระตุ้นและตัวกรองการปล่อยขึ้นอยู่กับการสอบสวน
ที่ใช้ เพื่อให้แน่ใจว่าค่าเฉลี่ยที่ถูกต้องสะท้อนให้เห็นถึงขอบเขต
ของการตายของเซลล์ต่อดีก็ควรที่จะตั้งขึ้นหลายอ่านต่อดี
ผ่านทางเฉลี่ยโคจรที่มีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 3 มมสำหรับแผ่น 96 ดีเพื่อ
หลีกเลี่ยงผลกระทบชายแดน ค่าที่ได้จะเรียกว่า ICD (เหนี่ยวนำให้เกิด
การตายของเซลล์) ที่จะได้รับสูงสุด Sytox? ความเข้มของสีเขียว
ต่อกันซึ่งสอดคล้องกับ 100% การตายของเซลล์ (MCDn), Triton
X-100 จะถูกเพิ่มในแต่ละดีเพื่อความเข้มข้นสุดท้ายที่ 0.1% เซลล์
จะฟักเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและ Sytox เข้มเขียว
วัดอีกครั้ง [27] ค่าที่ได้จะเรียกว่า MCD
(การตายของเซลล์สูงสุด) ผลการค้นหาจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์การตายของเซลล์
ต่อดี (รูปที่ 1.) ซึ่งสามารถคำนวณได้จากสูตรดังต่อไปนี้:

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ดำเนินงาน . ตัวอย่างการเตรียมเซลล์การวิเคราะห์
fluorometric เป็นเมล็ดก่อนวันที่ 5 – 20 การวิเคราะห์  103 เซลล์
100 จะต่อใน 96 ก็ติดจานกลาง ( ใช้
l15 เลโบวิตช์ ) ซึ่งช่วยให้ CO2 อิสระด้ . วันถัดไป
เซลล์ควรจะ 80% กระจู๋กระจี๋ในที่สุดเมื่อกระตุ้น
เซลล์ตายได้ เพิ่มเซลล์ impermeant ย้อม 30 นาทีก่อนการวัด
( เช่นsytox  สีเขียวเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 5 กล. ) และใส่
เซลล์กลับที่ 37  C sytox  สีเขียวเข้มแล้ว
วัดเรืองจานอ่านในฟังก์ชันของเวลา
เลือกของความตื่นเต้นและการปล่อยตัวกรองขึ้นอยู่กับการสอบสวน
ใช้ . เพื่อให้แน่ใจว่าเป็นค่าเฉลี่ยที่ถูกต้องสะท้อนให้เห็นถึงขอบเขต
การตายของเซลล์ ต่อ ก็ควรที่จะตั้งหลายอ่านต่อแล้ว
ทางโคจรเฉลี่ยที่มีเส้นผ่าศูนย์กลาง 3 มม. สำหรับ 96 ดี

ขอบจานหลีกเลี่ยงผลกระทบ นำค่าเรียกว่า ICD ( induced
เซลล์ตาย ) ที่จะได้รับสูงสุด sytox  สีเขียวเข้ม
ต่อด้วย ซึ่งสอดคล้องกับการตายของเซลล์ 100% ( mcdn ) , Triton X-100
เพิ่มแต่ละเพื่อความเข้มข้นสุดท้าย 0.1% เซลล์
จะบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง และ  sytox สีเขียวเข้ม
วัดอีกครั้ง [ 27 ] ค่าที่ได้จะเรียกว่า MCD
( ตายสูงสุดเซลล์ ) ผลลัพธ์ที่ได้จะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์การตายของเซลล์
ต่อด้วย ( รูปที่ 1 ) ซึ่งสามารถคำนวณได้จากสูตรต่อไปนี้