2. Materials and methods2.1. Plant

2. Materials and methods
2.1. Plant material preparation
One gram of dried powder of PM was washed with 5 mL of
hexane for 1 h by sonication, followed by extraction with 5 mL
of ethyl acetate–chloroform (3:1, v/v) for four times with
sonication for 1 h. The extracts were combined and evaporated
at 60 °C. The residual (P. candollei var. mirifica crude extract or
PME) was dissolved in corn oil before using for the animal
treatment.
2.2. Chemicals
MR were isolated from tuberous roots of PM as described
previously [12] and identified in comparisonwith the authentic
standard of MR provided by Dr. Chaiyo Chaichantippayuth,
Chulalongkorn University, Thailand. Estradiol benzoate (E2)
was purchased from Schering (Kenilworth, NJ, USA). TRIzol®
and Taq DNA polymerase were supplied by Invitrogen®
(Carlsbad, CA, USA). ReverTraAce® was a product of Toyobo®,
Osaka, Japan. Random primers and RNase inhibitor were
obtained from Takara Bio Inc. (Shiga, Japan). The forward and
reverse primers and the product size of the genes were as
follows: (1) RANKL, 5′-AGC GTC GCC CTG TTC TTC TAT TT-3′/
5′-ACT TGG GAT TTT GAT GCT GGT TTT-3′, 441 bp; (2) OPG,
5′-GAA CCC AGA GCG AAA TAC A-3′/5′-CGC TGT TTT CAC AGA
GGT CA-3′, 444 bp; and (3) GAPDH, 5′-TCC ACT CAC GGC AAA
TTC AAC G/TAG ACT CCA CGA CAT ACT CAG C-3′, 145 bp. All
other chemicals were of the highest available purity from
commercial suppliers.
2.3. Animals
Female ICR mice at 6 weeks of age were supplied by the
National Laboratory Animal Center (Mahidol University,
Nakhon Pathom, Thailand) and were housed in the Labora-
tory Animal Unit of the Faculty of Pharmaceutical Sciences
(Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand) under the
supervision of the veterinary doctor of the Northeast
Laboratory Animal Center, Khon Kaen University, Khon
Kaen, Thailand. At all times, the animals were housed in
polysulfone cages with wood chip bedding and were
supplied with water and a commercial animal diet ad libitum
and acclimated for at least 7 days in housing with a 12-h
dark/light cycle under controlled temperature (23±2 °C)
before dosing. Animal handing and the treatment protocol
were approved by the Animal Ethic Committee for use and
care of Khon Kaen University, Khon Kaen, Thailand (Approval
No. AEKKU01/2555). Mice were ovariectomized or sham
operated at 7 weeks of age. Few days after ovariectomy, mice
were subcutaneously administered with E2 0.1 mg/kg, PME
(2.5 or 25 mg/kg), or MR (0.1 or 1.0 mg/kg) in corn oil once a
day for 60 days. The control group was subcutaneously
administered with corn oil or 15% tween20 daily for the
same period as the treatment groups. The mice were
sacrificed 24 h after the last treatment. Livers were immedi-
ately excised for preparing total RNAs as described elsewhere

2.4. Expression of OPG and RANKL mRNA
Mouse OPG, RANKL, and GAPDH mRNAs were semi-
quantified by RT-PCR. Hepatic total RNA was reverse-
transcribed using ReverTraAce®, and then cDNA was
amplified under the conditions recommended by the
supplier (Invitrogen®). The conditions of PCR cycle were
followed by the method of Siggelkow et al. [19] with some
modifications. After separation of the PCR products by 2%
agarose gel electrophoresis, the target cDNA were detected
under ultraviolet light in the presence of ethidium
bromide and semi-quantified by Syngene gel documenta-
tion (Ingenius L, Cambridge, UK) and the GeneTools match
program.
2.5. Statistical analysis
The results were analyzed by one-way analysis of variance
(ANOVA) followed by LSD post hoc test (SPSS ver. 17.0).
p≤0.05 was considered statistically significant.
3. Results and discussion
Osteoporosis is a major public health problem which is
becoming increasingly prevalent with aging among the
world population. In women age between 40–44 years-old,
the prevalence of osteoporosis is only 0.9% and increase to
over 30% at age of 70 years-old [20]. Estrogen deficiency has
been recognized as a key factor of osteoporosis development
[9]. Besides estrogen deficiency, alteration of cytokine
production plays a role in the pathogenesis of osteoporosis,
namely increasing of cytokine might increase osteoporosis
prevalence in postmenopausal women [21]. In the present
study, effects of PME and MR on the expression of OPG and
RANKL in comparison with estradiol, a drug of choice for
hormone replacement therapy were determined. The body
weight profile of all ovariectomized mice was analyzed
during the last 30 days of the treatment (Table 1). An
increasing tendency of the body weight of all treated mice
was noted except those of the tween20 treated mice, in
which it was slightly declined. These findings revealed that
PME and MR were as safe as those of corn oil and E2.
Expression of OPG and RANKL mRNA was not affected by
either corn oil or 15% tween20. After ovariectomy, the
expression of OPG (Figs. 2A, 3A) was lowered while that of
RANKL mRNA was increased (Figs. 2B, 3B). These observa-
tions supported previous studies that ovariectomy altered OPG
and RAN

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. โรงงานเตรียมวัสดุหนึ่งกรัมของผงแห้งของ PM ถูกล้าง ด้วย 5 mL ของเฮกเซนสำหรับ h 1 โดย sonication ตามด้วย 5 มล.ของเอทิลอะซิเตท – คลอโรฟอร์ม (3:1, v/v) สำหรับครั้งที่สี่ด้วยsonication สำหรับ 1 ชั่วโมง สารสกัดรวม และระเหยที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เหลือ (P. candollei var. กวาวเครือขาวสารสกัดหยาบ หรือละลายในน้ำมันข้าวโพด PME) ก่อนที่จะใช้สำหรับสัตว์การรักษา2.2. เคมีภัณฑ์นายถูกแยกจากราก tuberous โป่งน.ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [12] และระบุไว้ใน comparisonwith แท้มาตรฐานของนายโดยดร.ไชโย Chaichantippayuthจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ประเทศไทย Estradiol benzoate (E2)ซื้อจากเชริง (เคนิลเวิร์ธ NJ สหรัฐอเมริกา) TRIzol ®และ Taq DNA พอลิเมอเรสที่จัดทำ โดย Invitrogen ®(คาร์ลบาด CA, USA) ReverTraAce ®เป็นผลิตภัณฑ์ของ Toyobo ®โอซาก้า ญี่ปุ่น ไพรเมอร์แบบสุ่มและ RNase ยับยั้งได้รับจาก Takara ไบ อิงค์ (ชิงะ ญี่ปุ่น) การส่งต่อ และไพรเมอร์ย้อนหลังและสินค้าขนาดของยีนที่เป็นต่อไปนี้: (1) RANKL, 5′ AGC GTC GCC CTG ทีทีซี TTC TAT TT-3′ /5′ ACT TGG แกทพ้อยท์ทีแกทพ้อยท์ GCT GGT TTT-3′, 441 bp (2) OPG5′ ไหว้ CCC เอ GCG AAA TAC A-3′/5′-CGC TGT TTT CAC เอGGT CA 3′, 444 bp และ (3) GAPDH, 5′-TCC ACT CAC GGC AAATTC AAC G/แท็ก ACT CCA CGA แมว ACT CAG 3′ C, 145 bp. ทั้งหมดสารเคมีอื่น ๆ เป็นของบริสุทธิ์อยู่สูงจากจำหน่ายเชิงพาณิชย์2.3. สัตว์เมาส์ ICR หญิงที่อายุ 6 สัปดาห์ได้มาโดยการศูนย์ห้องปฏิบัติการสัตว์ (มหาวิทยาลัยมหิดลนครปฐม ไทย) ได้เชิญ Labora -tory หน่วยสัตว์คณะเภสัชศาสตร์(มหาวิทยาลัยขอนแก่น ขอนแก่น ไทย) ภายใต้การดูแลของแพทย์สัตวแพทย์ของภาคอีสานศูนย์ห้องปฏิบัติการสัตว์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น ขอนแก่นขอนแก่น ประเทศไทย ตลอดเวลา สัตว์ตั้งอยู่ในพอลิซัลโฟนกรง ด้วยไม้ชินอน และมีมาพร้อมกับน้ำและอาหารสัตว์ค้า ad libitumและ acclimated อย่างน้อย 7 วันในที่อยู่อาศัยมี 12-hภาพจากเครื่องทีรอบภายใต้การควบคุมอุณหภูมิ (23±2 ° C)ก่อนที่จะจ่าย รักษาสัตว์และโพรโทคอการรักษาได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของสัตว์สำหรับใช้ และดูแลของมหาวิทยาลัยขอนแก่น ขอนแก่น ไทย (อนุมัติไม่ใช่ AEKKU01/2555) หนูได้ ovariectomized หรือเสแสร้งดำเนินการใน 7 สัปดาห์อายุ ไม่กี่วันหลังจาก ovariectomy หนูเข้าใต้ผิวหนังคือ มี E2 0.1 มิลลิกรัม/กิโลกรัม PME(2.5 หรือ 25 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัม), หรือนาย (0.1 หรือ 1.0 มิลลิกรัม/กิโลกรัม) ในน้ำมันข้าวโพดครั้งวัน 60 วัน กลุ่มควบคุมได้เข้าใต้ผิวหนังจัดการกับ tween20 น้ำมันข้าวโพดหรือ 15% ทุกวันสำหรับการช่วงเวลาเดียวกันเป็นกลุ่มรักษา หนูได้เสียสละ 24 ชั่วโมงหลังการรักษาครั้งสุดท้าย ตับมี immedi-ately สรรพสามิตสำหรับเตรียม RNAs ทั้งหมดตามที่อธิบายไว้ในที่อื่น2.4. นิพจน์ของ OPG และ RANKL mRNAOPG เมาส์ RANKL และ GAPDH mRNAs กึ่ง-วัด โดย RT-PCR RNA รวมตับถูกย้อนกลับ-ทับศัพท์โดยใช้ ReverTraAce ® และจากนั้น cDNA ก็ขยายภายใต้เงื่อนไขแนะนำโดยจำหน่าย (Invitrogen ®) เงื่อนไขของ PCR วงจรได้ตามวิธีของ Siggelkow et al. [19] บางการปรับเปลี่ยน หลังจากการแยกผลิตภัณฑ์ PCR 2%อิเจ agarose, cDNA เป้าหมายตรวจพบภายใต้แสงอัลตราไวโอเลตใน ethidiumโบรไมด์ และกึ่ง quantified โดย documenta เจ Syngene -ทางการค้า (Ingenius L เคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร) และ GeneTools ตรงกันโปรแกรม2.5. สถิติวิเคราะห์ผลได้วิเคราะห์ โดยวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว(ANOVA) ตาม ด้วย LSD คราวหลังทดสอบ (ver. SPSS 17.0)p≤0.05 เป็นสำคัญทางสถิติ3. ผล และการอภิปรายโรคกระดูกพรุนเป็นปัญหาสำคัญซึ่งเป็นกลายเป็นที่แพร่หลายมากขึ้นกับอายุในการประชากรโลก ในผู้หญิงอายุระหว่าง 40 – 44 ปี-เก่าความชุกของโรคกระดูกพรุนเป็น 0.9% และเพิ่มขึ้นไปเท่านั้นกว่า 30% ที่อายุ 70 ปี [20] มีการขาดฮอร์โมนรับรู้เป็นปัจจัยสำคัญของการพัฒนาของโรคกระดูกพรุน[9] นอกจากขาดฮอร์โมน เปลี่ยน cytokineผลิตมีบทบาทในพยาธิกำเนิดของโรคกระดูกพรุนคือ การเพิ่มขึ้นของ cytokine อาจเพิ่มโรคกระดูกพรุนส่วนในผู้หญิง postmenopausal [21] ในปัจจุบันศึกษา ผลของ PME และนายนิพจน์ของ OPG และRANKL เมื่อเปรียบเทียบกับ estradiol ยาเสพติดของทางเลือกสำหรับฮอร์โมนทดแทนที่ถูกกำหนด ร่างกายส่วนกำหนดค่าน้ำหนักของเมาส์ ovariectomized ทั้งถูกวิเคราะห์ในช่วง 30 วันสุดท้ายของการรักษา (ตารางที่ 1) มีแนวโน้มที่เพิ่มขึ้นของน้ำหนักตัวของหนูทำทั้งหมดระบุยกเว้นเมาส์ tween20 ถือ ในซึ่งก็เล็กน้อยปฏิเสธ เปิดเผยผลการวิจัยเหล่านี้ที่ความปลอดภัยของน้ำมันข้าวโพดและ E2 PME และนายได้นิพจน์ของ OPG และ RANKL mRNA ไม่ได้รับผลกระทบโดยtween20 น้ำมันข้าวโพดหรือ 15% หลังจาก ovariectomy การนิพจน์ของ OPG (มะเดื่อ. 2A, 3A) ถูกลดลงในขณะที่RANKL mRNA ถูกเพิ่ม (มะเดื่อ. 2B, 3B) เหล่านี้ observa-ทุกระดับได้รับการสนับสนุนการศึกษาก่อนหน้านี้ที่ ovariectomy เปลี่ยนแปลง OPGและสำราญ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 พืชเตรียมวัสดุหนึ่งกรัมของผงแห้ง PM ถูกล้างด้วย 5 มลเฮกเซนเป็นเวลา1 ชั่วโมงโดย sonication ตามด้วยการสกัดด้วย 5 มิลลิลิตรของอะซิเตท-คลอโรฟอร์มเอทิล(3: 1, v / v) สี่ครั้งด้วยsonication 1 ชั่วโมง สารสกัดมารวมกันและระเหยที่ 60 ° C ที่เหลือ (พี candollei var. สารสกัดหยาบขาวหรือPME) ถูกละลายในน้ำมันข้าวโพดก่อนที่จะใช้สำหรับสัตว์รักษา. 2.2 สารเคมีนายที่แยกได้จากรากสะสมอาหารของส่วนตัวตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้[12] และระบุไว้ใน comparisonwith จริงมาตรฐานของการให้บริการโดยนายดร. ไชโย Chaichantippayuth, จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย เบนโซเอ estradiol (E2) ซื้อมาจากเชริง (Kenilworth, NJ, สหรัฐอเมริกา) TRIzol®และ Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ที่ถูกจัดทำโดยInvitrogen® (คาร์ลส, CA, USA) ReverTraAce®เป็นผลิตภัณฑ์ของToyobo®ที่โอซาก้าประเทศญี่ปุ่น ไพรเมอร์แบบสุ่มและยับยั้ง RNase ถูกที่ได้รับจากTakara Bio อิงค์ (Shiga, ญี่ปุ่น) ไปข้างหน้าและไพรเมอร์ย้อนกลับและขนาดสินค้าของยีนมีดังต่อไปนี้(1) RANKL, 5'-AGC GTC GCC CTG TTC TTC ททท TT-3 '/ 5'-ACT TGG GAT TTT GAT GCT GGT TTT-3' , 441 bp; (2) OPG, 5'-GAA CCC AGA GCG AAA TAC A-3 / 5'-CGC TGT TTT CAC AGA GGT CA-3 ', 444 bp; และ (3) GAPDH, 5'-TCC ACT CAC GGC AAA TTC AAC G / TAG ACT CCA CGA CAT ACT CAG C-3 '145 bp ทั้งหมดสารเคมีอื่น ๆ ของความบริสุทธิ์สูงสุดจากซัพพลายเออร์เชิงพาณิชย์. 2.3 สัตว์หญิงหนู ICR 6 สัปดาห์ของอายุที่ถูกจัดทำโดยห้องปฏิบัติการแห่งชาติศูนย์สัตว์(มหาวิทยาลัยมหิดล, นครปฐม, ประเทศไทย) และได้รับการตั้งอยู่ในองทดลองtory สัตว์หน่วยของคณะเภสัชศาสตร์(มหาวิทยาลัยขอนแก่นขอนแก่น ประเทศไทย) ภายใต้การกำกับดูแลของแพทย์สัตวแพทย์ภาคตะวันออกเฉียงเหนือของห้องปฏิบัติการศูนย์สัตว์, มหาวิทยาลัยขอนแก่น, Khon Kaen, Thailand ทุกครั้งที่สัตว์ที่ถูกเก็บไว้ในกรง Polysulfone มีผ้าคลุมเตียงเศษไม้และมาพร้อมกับน้ำและอาหารสัตว์เชิงพาณิชย์โฆษณาlibitum และปรับตัวเป็นเวลาอย่างน้อย 7 วันในที่อยู่อาศัยที่มี 12 ชั่วโมงเข้ม/ วงจรไฟภายใต้การควบคุมอุณหภูมิ (23 ± 2 ° C) ก่อนที่จะใช้ยา มอบสัตว์และโปรโตคอลการรักษาได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์สำหรับการใช้งานและการดูแลของมหาวิทยาลัยขอนแก่น, ขอนแก่น, ไทย (การอนุมัติครั้งที่AEKKU01 / 2555) หนูถูกตัดรังไข่หรือเสแสร้งดำเนินการใน 7 สัปดาห์ของอายุ ไม่กี่วันหลังจากที่ ovariectomy หนูเป็นยาเข้าใต้ผิวหนังด้วยE2 0.1 mg / kg PME (2.5 หรือ 25 mg / kg) หรือนาย (0.1 หรือ 1.0 มก. / กก.) ในน้ำมันข้าวโพดครั้งหนึ่งเคยเป็นวันเป็นเวลา60 วัน กลุ่มควบคุมได้เข้าใต้ผิวหนังยาด้วยน้ำมันข้าวโพดหรือ 15% tween20 รายวันสำหรับช่วงเวลาเดียวกันกับกลุ่มการรักษา หนูถูกเสียสละ 24 ชั่วโมงหลังการรักษาที่ผ่านมา ตับถูก immedi- พออย่างปานกลางสำหรับการเตรียม RNAs รวมตามที่อธิบายไว้ที่อื่น ๆ2.4 การแสดงออกของ OPG และ RANKL mRNA OPG เมาส์ RANKL และ GAPDH mRNAs กึ่งถูกวัดโดยRT-PCR อาร์เอ็นเอรวมตับเป็น reverse- คัดลอกใช้ReverTraAce®แล้ว cDNA ถูกขยายภายใต้เงื่อนไขที่แนะนำโดยผู้จัดจำหน่าย(Invitrogen®) เงื่อนไขของวงจร PCR ถูกตามมาด้วยวิธีการSiggelkow et al, [19] กับการปรับเปลี่ยน หลังจากที่แยกผลิตภัณฑ์ PCR 2% ข่าวคราว agarose, ยีนเป้าหมายถูกตรวจพบภายใต้แสงอัลตราไวโอเลตในการปรากฏตัวของethidium bromide และกึ่งเชิงปริมาณโดย Syngene เจลจัดทำการ(ingenius L, เคมบริดจ์, สหราชอาณาจักร) และการแข่งขัน GeneTools โปรแกรม . 2.5 การวิเคราะห์ทางสถิติผลการวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์ทางเดียวความแปรปรวน(ANOVA) ตามด้วยการทดสอบการโพสต์ LSD เฉพาะกิจ (SPSS Ver. 17.0). p≤0.05ได้รับการพิจารณาอย่างมีนัยสำคัญ. 3 ผลการอภิปรายและโรคกระดูกพรุนเป็นปัญหาสาธารณสุขที่สำคัญซึ่งจะกลายเป็นที่แพร่หลายมากขึ้นกับอายุในหมู่ประชากรโลก ในผู้หญิงอายุระหว่าง 40-44 ปีเก่าความชุกของโรคกระดูกพรุนเป็นเพียง0.9% และเพิ่มขึ้นเป็นกว่า30% เมื่ออายุได้ 70 ปีเก่า [20] ขาดสโตรเจนได้รับการยอมรับว่าเป็นปัจจัยสำคัญของการพัฒนาโรคกระดูกพรุน[9] นอกจากนี้การขาดฮอร์โมน, การเปลี่ยนแปลงของไซโตไคน์ผลิตมีบทบาทในการเกิดโรคกระดูกพรุนที่คือที่เพิ่มขึ้นของไซโตไคน์อาจเพิ่มเป็นโรคกระดูกพรุนความชุกในสตรีวัยหมดประจำเดือน[21] ในปัจจุบันการศึกษาผลกระทบของการ PME และนายในการแสดงออกของ OPG และ RANKL ในการเปรียบเทียบกับ estradiol, ยาเสพติดของทางเลือกสำหรับการรักษาด้วยฮอร์โมนทดแทนได้รับการพิจารณา ร่างกายรายละเอียดน้ำหนักของหนูตัดรังไข่ทั้งหมดมาวิเคราะห์ในช่วง30 วันของการรักษา (ตารางที่ 1) แนวโน้มที่เพิ่มขึ้นของน้ำหนักตัวของหนูที่ได้รับการรักษาทั้งหมดเป็นข้อสังเกตยกเว้นของ tween20 รับการรักษาหนูในการที่จะได้รับการลดลงเล็กน้อย การค้นพบนี้แสดงให้เห็นว่าPME และนายพบว่าเป็นผู้ที่มีความปลอดภัยของน้ำมันข้าวโพดและ E2. การแสดงออกของ OPG และ RANKL mRNA ไม่ได้รับผลกระทบจากทั้งน้ำมันข้าวโพดหรือ15% tween20 หลังจาก ovariectomy การแสดงออกของOPG (มะเดื่อ. 2A, 3A) ลดลงในขณะที่RANKL mRNA เพิ่มขึ้น (มะเดื่อ. 2B, 3B) เหล่านี้ observa- ทั้งนี้ได้รับการสนับสนุนการศึกษาก่อนหน้านี้ที่ ovariectomy OPG เปลี่ยนแปลงและวิ่ง