NNA plates containing living or hea

NNA plates containing living or heat-killed Enterobacter spp.
Cultures were then subsequently transferred to liquid culture
using Optimal Growth Media (OGM) (Byers et al. 1980) or
Bacto-Casitone/Senun (BCS) media (Cerva 1980). modified
with the substitution of adult bovine serum for rabbit serum, in
25-cm2 culture flasks at 27 "C.
DNA extraction and PCR. DNA was extracted as previously
described (Schroeder et al. 2001) or by extraction using
the DNeasy kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA). Rns genotyping
of environmental isolates was done using previously published
procedures (Booton et al. 2002; Schroeder et al. 2001). Amplicon
ASA.Sl, containing DF3, was amplified by PCR using genus-specific
primers JDPl (5'-GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA-3')
and JDP2 (5'-TCTCACAAGCTGCTAGGGGAGTCA-3')
following DNA extraction (Schroeder et al. 2001).
Since these primers are genus-specific they are not affected by
co-extraction of bacterial DNA from Acanthamoeba cultures
that contain Enterobacter as a food source. PCR conditions
were the following: an initial denaturing step of 7 min at 95 "C
followed by 40 cycles of 1 min at 95 "C, 1 min at 55 "C, and
2 min at 72 "C. This was followed by a final extension of 15
min at 72 "C. Amplicons of approximately 470 bp from Acanthamoeba
cultures were visualized on a 1% agarose gel following
electrophoresis of 20% of the PCR reaction and staining
with ethidium bromide. The remaining PCR product was prepared
for sequencing by using the Qiaquick PCR clean-up kit
(Qiagen, Inc.). Samples were typically eluted in 30-5Op1 of
Qiagen elution buffer and 3.5 pl of purified sample was routinely
used for sequencing reactions.
Sequencing, alignment, and phylogenetic analysis. Direct
sequencing of the PCR product was done with an ABI 310
automated fluorescent sequencing system (Applied Biosystems,
Foster City, CA) using Rns conserved primers 892 (5'-CCAAGAAl-ITCACCTCTGAC-3')
and 892C (5'-GTCAGAGGTGAAATTCTTGG-3')
to determine the primary DNA sequence
of DF3 of Rns (Schroeder et al. 2001). Sequence differences
were confirmed by repeated sequencing and by examination of
the primary data electropherogram. DF3 sequences thal differed
consistently by a single nucleotide or more were defined as
different sequences in this study. Genotype determination was
done by phylogenetic analysis of sequence variation of DF3. In
some isolates we determined the entire Rns sequence for comparison
to the results using DF3. In all instances in this study,
as in previous work, DF3 fragment sequence analysis identified
the same genotypes as identified using complete Rns genes. The
24 sequences obtained in this study were aligned to each other
and to 80 previously determined sequences using the computer
sequence alignment program ESEE (Cabot and Beckenbach
1989). These sequences are a subset of the OSU Acantlzamoeba
Nuclear Small Subunit Ribosomal DNA (SSU rDNA) Database
(www.biosci.ohio-state.edu/tbyers/byers.htm). The alignment of
the genotypically informative region of DF3 (105 bp) was used
to calculate dissimilarity values using the Kimura 2-parameter
algorithm in the phylogenetic analysis computer program
MEGA2 (Kumar et al. 2001). Gaps were excluded from distance
calculations using the pair-wise deletion option in
MEGA2. Phylogenetic reconstruction also was done in
MEGA2, which was used to produce gene trees using neighborjoining
and minimum evolution methods.
Statistical analyses. Statistical data analyses including average,
variance, standard deviation, correlation, and analysis of
variance (ANOVA) of migration data were performed using the
computer program Statview (Abacus Concepts, Inc., Berkeley.
CA).
GenBank references. Sequences determined in the current
study were deposited in GenBank and are available through

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ประกอบด้วยห้องนั่งเล่น หรือ ฆ่าความร้อนโอ Enterobacter แผ่น NNAวัฒนธรรมได้แล้วต่อมาโอนย้ายไปที่วัฒนธรรมของเหลวใช้ดีที่สุดเจริญเติบโตของสื่อ (ogm เสียง) (Byers et al. 1980) หรือBacto-Casitone/Senun (BCS) สื่อ (Cerva 1980) การปรับเปลี่ยนด้วยการแทนที่ของเซรั่มวัวผู้ใหญ่สำหรับเซรั่มกระต่าย ในนำวัฒนธรรม 25 cm2 ที่ 27 " cสกัดดีเอ็นเอและ PCR ดีเอ็นเอที่สกัดเป็นก่อนหน้านี้อธิบาย (Schroeder et al. 2001) โดยแยกชุด DNeasy (Qiagen, Inc., Valencia, CA) Rns genotypingของสิ่งแวดล้อมแยก เป็นทำใช้ก่อนหน้านี้เผยแพร่ขั้นตอน (Booton et al. 2002 Schroeder et al. 2001) AmpliconASA Sl, DF3 ประกอบด้วยถูกขยาย โดยใช้สกุลเฉพาะ PCRไพรเมอร์ JDPl (5'-GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA-3')และ JDP2 (5'-TCTCACAAGCTGCTAGGGGAGTCA-3')วิธีการสกัดดีเอ็นเอ (Schroeder et al. 2001)ตั้งแต่ไพรเมอร์เหล่านี้ พวกเขาจะไม่ได้รับผลกระทบโดยเฉพาะ สกุลสกัดดีเอ็นเอจากแบคทีเรียจาก Acanthamoeba วัฒนธรรมร่วมที่ประกอบด้วย Enterobacter เป็นแหล่งอาหาร เงื่อนไขของ PCRได้ต่อไปนี้: ขั้นตอนการ denaturing แรก 7 นาทีที่ 95 " Cตามรอบ 40 1 นาทีที่ 95 " C, 1 นาทีที่ 55 " C และ2 นาทีที่ 72 " c นี้ถูกตาม ด้วยนามสกุลเป็นครั้งสุดท้าย 15นาทีที่ 72 " Amplicons C. ของประมาณ 470 bp จาก Acanthamoebaวัฒนธรรมมี visualized บนเป็น 1% agarose เจดังต่อไปนี้electrophoresis 20% ของ PCR ปฏิกิริยาและการย้อมสีมีโบรไมด์ ethidium ผลิตภัณฑ์ PCR ที่เหลือเตรียมไว้การจัดลำดับโดยใช้ชุดการล้าง Qiaquick PCR(Qiagen, Inc.) ตัวอย่างที่ eluted โดยทั่วไปใน 30-5Op1 ของบัฟเฟอร์ Qiagen elution และ 3.5 pl บริสุทธิ์อย่างเป็นประจำใช้สำหรับปฏิกิริยาลำดับลำดับ ตำแหน่ง และวิเคราะห์ phylogenetic โดยตรงลำดับเบสของ PCR ผลิตภัณฑ์ทำ ด้วยการ 310 ABIอัตโนมัติระบบลำดับเรืองแสง (Biosystems ใช้ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) ใช้ Rns อาศัยไพรเมอร์ 892 (5'-CCAAGAAl-ITCACCTCTGAC-3')และ 892C (5'-GTCAGAGGTGAAATTCTTGG-3')เพื่อกำหนดลำดับดีเอ็นเอที่หลักของ DF3 ของ Rns (Schroeder et al. 2001) ความแตกต่างของลำดับได้รับการยืนยัน โดยลำดับซ้ำ และการตรวจสอบelectropherogram ข้อมูลหลัก ลำดับ DF3 thal แตกต่างอย่างต่อเนื่อง โดยนิวคลีโอไทด์หนึ่งหรือมากกว่าถูกกำหนดลำดับที่แตกต่างกันในการศึกษานี้ กำหนดลักษณะทางพันธุกรรมได้โดยการวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงลำดับของ DF3 phylogenetic ในบางแยกเรากำหนดลำดับ Rns ทั้งสำหรับการเปรียบเทียบเพื่อผลลัพธ์ที่ใช้ DF3 ในอินสแตนซ์ทั้งหมดในการศึกษานี้ในงานก่อนหน้า DF3 ส่วนการวิเคราะห์ระบุการศึกษาจีโนไทป์เหมือนกันเป็นระบุใช้ยีน Rns สมบูรณ์ ที่ลำดับที่ 24 ได้รับในการศึกษานี้ได้สอดคล้องกันและไป 80 ก่อนหน้านี้กำหนดลำดับในการใช้คอมพิวเตอร์โปรแกรมจัดลำดับ ESEE (Cabot และ Beckenbach1989) ลำดับเหล่านี้เป็นชุดย่อยของ Acantlzamoeba อักกรา OSUนิวเคลียร์ขนาดเล็กย่อย Ribosomal ดีเอ็นเอ (SSU rDNA) ฐานข้อมูล(www.biosci.ohio-state.edu/tbyers/byers.htm) การจัดตำแหน่งของเขตข้อมูล genotypically ของ DF3 (105 bp) ใช้การคำนวณค่า dissimilarity โดยใช้คิมุระโย 2-พารามิเตอร์อัลกอริทึมในโปรแกรมคอมพิวเตอร์วิเคราะห์ phylogeneticMEGA2 (Kumar et al. 2001) ช่องว่างถูกแยกออกจากระยะทางคำนวณโดยใช้ตัวเลือกการลบ pair-wiseMEGA2 ฟื้นฟู phylogenetic ยังภายในMEGA2 ซึ่งถูกใช้ในการผลิตยีนต้นไม้โดยใช้ neighborjoiningและวิธีการวิวัฒนาการต่ำสุดวิเคราะห์ทางสถิติ วิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติได้แก่ค่าเฉลี่ยความแปรปรวน ค่าส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ความสัมพันธ์ และการวิเคราะห์ความแปรปรวน (การวิเคราะห์ความแปรปรวน) ของการโยกย้ายข้อมูลได้ดำเนินการโดยใช้การโปรแกรม Statview (เบิร์กลีย์อบาคัสแนวคิด Inc.CA)การอ้างอิงของ GenBank ลำดับที่กำหนดในปัจจุบันศึกษาได้ฝากใน GenBank และมีผ่าน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เควสท์ที่มีอยู่ หรือแผ่นความร้อนฆ่า Enterobacter spp .
วัฒนธรรมแล้วต่อมาย้ายไป
อาหารเหลวโดยใช้สื่อการเจริญเติบโตที่เหมาะสม ( OGM ) ( โดย et al . 1980 ) หรือ
Bacto casitone / senun ( BCS ) สื่อ ( เซอร์วา 1980 ) แก้ไข
กับทดแทนผู้ใหญ่วัวเซรุ่มสำหรับกระต่ายเซรั่ม ใน ขวด วัฒนธรรม 25-cm2
ที่ 27 " C .
การสกัดดีเอ็นเอ และ PCR ดีเอ็นเอเป็นก่อนหน้านี้
อธิบาย ( ชโรเดอร์ et al . 2001 ) หรือโดยการสกัด
dneasy Kit ( QIAGEN , อิงค์ , วาเลนเซีย , แคลิฟอร์เนีย ) ส่งเสริมสิ่งแวดล้อม rn
ไอโซเลท โดยใช้กระบวนการเผยแพร่ก่อนหน้านี้
( booton et al . 2002 ; ชโรเดอร์ et al . 2001 ) และ
asa.sl ที่มี df3 ถูกขยายโดยวิธี PCR โดยใช้ไพร์เมอร์จำเพาะ
สกุล jdpl ( 5 ' - ggcccagatcgtttaccgtgaa-3 ' ) และ ( ' - 5 jdp2

tctcacaagctgctaggggagtca-3 ' )ต่อไปนี้การสกัดดีเอ็นเอ ( ชโรเดอร์ et al . 2001 ) .
เพราะไพรเมอร์เหล่านี้เป็นสกุลที่เฉพาะเจาะจงพวกเขาจะไม่ได้รับผลกระทบ โดยการสกัดดีเอ็นเอจากแบคทีเรีย
Co ทุกครั้งวัฒนธรรม
ที่ประกอบด้วย Enterobacter เป็นแหล่งอาหาร โดยเงื่อนไข
เป็นต่อไปนี้ : เริ่มต้นี่ขั้นตอนที่ 7 นาทีที่ 95 " C
ตามด้วย 40 รอบ 1 นาทีที่ 95 " C , 1 นาทีที่ 55 " C ,
2 นาทีที่ 72 " Cนี้ตามด้วยนามสกุลสุดท้าย 15 นาทีที่ 72
" C . amplicons ประมาณ 470 BP จากวัฒนธรรมเป็นปรากฏการณ์บนทุกครั้ง

1 % เจลตามวิธีของ 20% ของ PCR และปฏิกิริยาการย้อมสี
กับทิเดียมโบรไมด์ . ที่เหลือก็เตรียม
ให้จัดลำดับดีเอ็นเอผลิตภัณฑ์โดยใช้ qiaquick PCR ทำความสะอาดชุด
( เพิ่ม ) ) โดยทั่วไปตัวอย่างของตัวอย่างใน 30-5op1
QIAGEN ( บัฟเฟอร์และ 3.5 ให้ตัวอย่างที่จะใช้สำหรับปฏิกิริยาการตรวจ
.
จัดลำดับ จัด และการวิเคราะห์ phylogenetic . โดย
ลำดับของผลิตภัณฑ์ PCR ทำได้กับ ABI 310
ระบบเรืองแสงอัตโนมัติ ( Applied Biosystems
, Foster City , CA ) โดยใช้ไพรเมอร์ rn เพื่อมัน ( 5 ' - ccaagaal-itcacctctgac-3 ' ) และ ( ' - 5 892c

gtcagaggtgaaattcttgg-3 ' )เพื่อศึกษาหลักของดีเอ็นเอลำดับ
df3 ของ rn ( ชโรเดอร์ et al . 2001 ) ลำดับความแตกต่าง
ได้รับการยืนยันโดยลำดับ โดยการตรวจซ้ำ
เล็กโทรฟีโรแกรมข้อมูลปฐมภูมิ df3 อย่างต่อเนื่องโดยมีลำดับของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว

หรือกำหนดเป็นลำดับต่าง ๆ ในการศึกษานี้ ตรวจสอบ
พันธุกรรมทำโดยการวิเคราะห์ลำดับวิวัฒนาการของรูปแบบของ df3 . ในบางสายพันธุ์ที่เรากำหนดทั้งหมด

rn ลำดับสำหรับการเปรียบเทียบผลการ df3 . ในกรณีทั้งหมดในการศึกษานี้
เป็นในงานก่อนหน้านี้ df3 การวิเคราะห์ลำดับเบสระบุ
พันธุ์เดียวกับระบุการใช้ยีน rn ที่สมบูรณ์
24 ลำดับได้ ในการศึกษาครั้งนี้สอดคล้องกับแต่ละอื่น ๆ
และ 80 ก่อนหน้านี้กำหนดลำดับการใช้คอมพิวเตอร์โปรแกรม esee
ลำดับแนว ( อ่าน และ beckenbach
1989 ) อนุกรมนี้เป็นเซตย่อยของโอส acantlzamoeba subunit ribosomal DNA
นิวเคลียร์ขนาดเล็ก ( ซื่อ rDNA ) ฐานข้อมูล
( www.biosci . รัฐโอไฮโอ . edu / tbyers / โดย . htm ) แนวของเขตข้อมูล genotypically ของ df3

( 105 BP ) ถูกใช้เพื่อคำนวณหาค่าความแตกต่างโดยใช้คิมูระสองขั้นตอนวิธีในการวิเคราะห์โปรแกรมต่างๆ

คอมพิวเตอร์ mega2 ( Kumar et al . 2001 ) ช่องว่างที่ถูกแยกออกจากการคำนวณระยะทาง
ใช้คู่ปัญญาตัวเลือกการลบใน
mega2 . การฟื้นฟู ซึ่งก็เสร็จ
mega2 ซึ่งถูกใช้ในการผลิตของต้นไม้ที่ใช้ neighborjoining

และวิธีการวิวัฒนาการขั้นต่ําการวิเคราะห์ทางสถิติ สถิติการวิเคราะห์ข้อมูล ได้แก่ ค่าเฉลี่ย ความเบี่ยงเบนมาตรฐาน
, ,
) และการวิเคราะห์ความแปรปรวน ( ANOVA ) ข้อมูลการย้ายถิ่น คือการใช้คอมพิวเตอร์โปรแกรม statview
( ลูกคิดแนวคิด , Inc , Berkeley CA .
)
ขนาดอ้างอิง ลำดับมุ่งมั่นในการศึกษาปัจจุบัน
ฝากเงินในขนาดและพร้อมใช้งานผ่าน