7.8 HPLC analysis to detect GSLsFor

7.8 HPLC analysis to detect GSLs
For the analysis of GSL, 100 µL of the 50 mL clear incubated supernatant of each extract will be mixed with 10 µL Pb/Ba acetate solution (equimolar, 1 M) followed by centrifugation (5 min, 15,000 rpm). The supernatant will be added to a water pre-equilibrated (1 ml, 2 Xs) Sephadex-A25 ion exchange column (acetate form, 0.5 ml bed volume) and rinsed with water (1 ml, 2 Xs) followed by equilibrating with a sodium acetate buffer solution (0.5 mL, 0.02 M, pH 5.0). H. pomatia sulfatase (75 µL, 0.3U/mL) will be added to the top of the ion exchange gel and left overnight to allow desulfation. The columns will be eluted with deionised water (0.5 ml, 3 Xs) and transferred to an Eppendorf tube (2 mL). Desulfo-glucosinolates (DS-GSLs) will be eluted from the column with water (3 X 0.5 mL). DS-GSLs will be separated on a water (Solvent A)–acetonitrile (Solvent B) gradient; 2-15% B (10 min), 15-20% B (10 min), 20-25% B (5 min), 25% B (5 min hold), 25-70% B (5 min), 70% B (5 min hold), 70-2% B (1 min) and 2% B (9 min) at a flow rate of 0.2 mL/min and at 35°C by HPLC (Shimadzu LC-20A) fitted with a Synergi 4u Hydro-RP 80A, 250 x 2 mm, 4 micron (Phenomenex Inc., Torrance, CA). Eluent will be monitored at A229 nm on a UV detector. Quantification of DS-GSL will be achieved using known response factors for each GSL relative to an external standard (sinigrin). GSLs can be identified using the previous GSL elution profiles with authentic GSL standards

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

7.8 วิเคราะห์ HPLC การตรวจสอบ GSLsในการวิเคราะห์ GSL, 100 µL ของ 50 มล.ใสที่ได้รับการกก supernatant ของสารสกัดแต่ละจะผสมกับ 10 µL โซลูชันอะซิเตท (equimolar, 1 M) Pb/Ba ตาม ด้วยหมุนเหวี่ยง (5 นาที 15,000 รอบต่อนาที) Supernatant จะเพิ่มลงในน้ำก่อน equilibrated (1 ml, 2 Xs) เอ 25 Sephadex คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออน (ฟอร์มอะซิเตท ปริมาตร 0.5 ml เตียง) และล้าง ด้วยน้ำ (1 ml, 2 Xs) ตาม ด้วย equilibrating ด้วยโซเดียมอะซิเตบัฟเฟอร์ (0.5 mL, 0.02 M ค่า pH 5.0) H. pomatia sulfatase (75 µL, 0.3U / mL) จะเพิ่มไปยังด้านบนของเจแลกเปลี่ยนไอออน และทิ้งค้างคืนเพื่อให้ทิ้ง คอลัมน์จะ eluted deionised น้ำ (0.5 มิลลิลิตร 3 Xs) และโอนย้ายไปหลอด Eppendorf (2 mL) Desulfo-glucosinolates (DS-GSLs) จะได้ eluted จากคอลัมน์น้ำ (3 X 0.5 มิลลิลิตร) DS GSLs จะแยกน้ำ (ตัวทำละลาย A) – acetonitrile (ตัวทำละลาย B) ไล่ระดับสี B 2-15% (10 นาที), 15-20% B (10 นาที) B 20-25% (5 นาที), 25% B (5 นาทีค้าง), B 25-70% (5 นาที), 70% B (5 นาทีค้าง), 70-2% B (1 นาที) และ 2% B (9 นาที) อัตราไหล 0.2 มิลลิลิตร/นาที และ 35° c โดย HPLC (Shimadzu LC-20A) ประกอบ ด้วยการ Synergi 4u ไฮโดร-RP 80A, 250 x 2 มม. , 4 ไมครอน (Phenomenex Inc. รันซ์ CA) จะตรวจสอบ Eluent ที่ nm A229 บนเครื่องตรวจจับ UV ด้านของ DS GSL จะได้ใช้ปัจจัยตอบสนองรู้จักละ GSL สัมพันธ์กับมาตรฐานการภายนอก (sinigrin) GSLs สามารถระบุการใช้โพรไฟล์ชะ GSL ก่อนหน้ามาตรฐาน GSL แท้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

7.8 การวิเคราะห์ HPLC เพื่อตรวจจับ GSLs
สำหรับการวิเคราะห์ GSL 100 ไมโครลิตรของ 50 มลชัดเจนบ่มใสของแต่ละสารสกัดจะได้รับการผสมกับ 10 ไมโครลิตร Pb / บริติชแอร์เวย์แก้ปัญหาอะซิเตท (equimolar, M 1) ตามด้วยการหมุนเหวี่ยง (5 นาที 15,000 รอบต่อนาที ) ใสจะถูกเพิ่มลงไปในน้ำก่อน equilibrated (1 มล. 2 Xs) Sephadex-A25 คอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออน (แบบอะซิเตทปริมาณ 0.5 มลเตียง) และล้างด้วยน้ำ (1 มล. 2 Xs) ตามด้วยเข้าสู่ดุลยภาพที่มีโซเดียม สารละลายบัฟเฟอร์อะซิเตท (0.5 มล, 0.02 M ค่า pH 5.0) เอช pomatia sulfatase (75 ไมโครลิตร, 0.3U / มิลลิลิตร) จะถูกเพิ่มไปด้านบนของเจลการแลกเปลี่ยนไอออนและทิ้งค้างคืนที่จะอนุญาตให้ desulfation คอลัมน์จะถูกชะด้วยน้ำ deionised (0.5 มล. 3 Xs) และโอนไปยังหลอด Eppendorf (2 มิลลิลิตร) Desulfo-glucosinolates (DS-GSLs) จะชะจากคอลัมน์ด้วยน้ำ (3 x 0.5 มิลลิลิตร) DS-GSLs จะถูกแยกออกจากกันในน้ำ (ตัวทำละลาย) -acetonitrile (Solvent B) การไล่ระดับสี; 2-15% B (10 นาที), 15-20% B (10 นาที), 20-25% B (5 นาที) 25% B (5 นาทีถือ) 25-70% B (5 นาที) 70 % B (5 นาทีถือ) 70-2% B (1 นาที) และ 2% B (9 นาที) ที่อัตราการไหล 0.2 มิลลิลิตร / นาทีและที่ 35 ° C โดยวิธี HPLC (Shimadzu LC-20A) พอดีกับที่ Synergi 4u Hydro-RP 80A, 250 x 2 มม 4 ไมครอน (Phenomenex อิงค์ Torrance, CA) ตัวชะจะถูกตรวจสอบที่ A229 นาโนเมตรบนเครื่องตรวจจับรังสียูวี ปริมาณ DS-GSL จะทำได้โดยใช้ปัจจัยการตอบสนองที่รู้จักกันสำหรับแต่ละ GSL เทียบกับมาตรฐานภายนอก (sinigrin) GSLs สามารถระบุการใช้ GSL โปรไฟล์ชะก่อนที่มีมาตรฐาน GSL แท้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

7.8 HPLC การวิเคราะห์เพื่อตรวจสอบ gslsเพื่อวิเคราะห์ GSL 100 µลิตร 50 มิลลิลิตร โดยนำสารสกัดใสแต่ละจะถูกผสมกับ 10 µ L PB / BA อะซิเตท โซลูชั่น ( ๆ 1 M ) ตามด้วยการเหวี่ยงแยก ( 5 นาที , 15 , 000 รอบต่อนาที ) และน่านจะถูกเพิ่มลงในน้ำก่อน equilibrated ( 1 มิลลิลิตร , 2 x ) คอลัมน์ sephadex-a25 แลกเปลี่ยนไอออน ( แบบฟอร์ม 0.5 มล. ปริมาตร acetate ) และล้างด้วยน้ำ ( 1 มิลลิลิตร และ 2 ปี ) ตามด้วยเดือนก่อนด้วยโซเดียมอะซิเตตสารละลายบัฟเฟอร์ ( 0.5 ml 0.02 M pH 5.0 ) ชั่วโมง pomatia ซัลฟาเทส ( 75 µ L , 0.3u / ml ) จะถูกเพิ่มไปยังด้านบนของเจลแลกเปลี่ยนไอออน และปล่อยค้างคืนให้ desulfation . คอลัมน์จะเป็นตัวอย่างกับ deionised น้ำ ( 0.5 ml 3 XS ) และย้ายไปเป็นหลอดเพนดอร์ฟ ( 2 ml ) desulfo กลูโคซิโนเลต ( DS gsls ) จะได้รับตัวอย่างจากคอลัมน์ด้วยน้ำ ( 3 x 0.5 ml ) DS gsls จะแยกกันในน้ำ ( ตัวทำละลาย ) –ไน ( ตัวทำละลาย B ) ลาด ; 2-15 % B ( 10 นาที ) , 15-20 % B ( 10 นาที ) , 20-25 % B ( 5 นาที ) , 25 % B ( 5 นาทีค้าง ) , 25-70 % B ( 5 นาที ) , 70 % B ( 5 นาทีค้าง ) , 70-2 % B ( 1 นาที ) และ 2 % B ( 9 นาที ) ที่อัตราการไหล 2 มล. / นาที และ 35 องศา C โดย HPLC ( Shimadzu lc-20a ) พอดีกับ synergi 4U ไฮโดร RP 80a 250 x 2 มม. 4 ไมครอน ( phenomenex Torrance , CA ) ) นี้จะได้รับการตรวจสอบที่ a229 nm ใน UV รังสี ปริมาณของ ds-gsl จะได้รู้จักการใช้ปัจจัยแต่ละ GSL เทียบกับมาตรฐานภายนอก ( sinigrin ) gsls สามารถระบุการใช้ก่อนหน้านี้ GSL ( โปรไฟล์มาตรฐาน GSL แท้ๆ