Typical results for AWF extractions

Typical results for AWF extractions performed on healthy 3 week old P. vulgaris cv. Tendergreenleaves, using distilled water as the infiltration fluid are shown in Table 2. Young P. vulgaris leaves are amenable to infiltration, and at the centrifugation speed used here (1,000 x g) the removal of the majority of infiltration fluid by centrifugation can be seen directly as the leaves revert to their original green colour. P. vulgaris leaf fresh weight was on average 1.1 x g before infiltration and yielded 0.5 ml of AWF per gram fresh weight. The protein concentration of the AWF was determined to be 0.18 ± 0.08 mg/ml using a standard Bradford protein assay. The dilution factor for these leaves, calculated by measuring indigo carmine dilution, was 2.3 ± 0.3 fold. The above values can vary substantially between species and pilot experiments are required to determine the yield of AWF per gram leaf fresh weight, as well as the AWF protein concentration and dilution factor that can be expected for a given leaf type. Damage to the integrity of the cells can occur both during the infiltration step, if the changes in pressure are too rapid, and during the centrifugation step if the centrifugal force is too high. It is therefore necessary to assay AWF samples for markers of cytoplasmic contamination; ideally, multiple independent assays are performed. Here, the results from three possible assays are reported in Table 2. In well-performed extractions of P. vulgaris AWF, G6PDH was undetectable by a standard enzyme assay. This is consistent with other reports where G6PDH activity becomes detectable only above a threshold centrifugal force12. In contrast, a baseline level of malate dehydrogenase activity (2.5 U/ ml) was detectable in all P. vulgaris AWF samples using a standard metabolic assay. Increasing the centrifugal force above a threshold of 1,000 x g resulted in increased MDH activities (results not shown). As the apoplast from other species is known to contain endogenous MDH activity18, the amount detected here is considered genuine apoplastic activity and significant increases above this baseline level are indicative of contamination. Metabolites that are thought to be predominantly cytoplasmic, such as hexose-6-phosphates, can also be used to assess contamination of AWF. Here, GC-MS analysis detected zero or trace levels of G-6-P in AWF extractions. By contrast, in cut maize root sections, G-6-P was detected after AWF extraction at all centrifugation speeds and increased in concentration at higher speeds, indicating cytoplasmic contamination10. Metabolite analysis by GC-MS of P. vulgaris leaf AWF typically yields 40 - 60 identifiable metabolites and an approximately equal number of unidentifiable compounds (Figure 2). Organic acids, simple sugars, and amino acids represent the bulk of the identifiable metabolites, however, secondary plant metabolites have also been detected and quantified from AWF11. Several example peaks from these different molecule classes are labeled in Figure 2. Further downstream analytical techniques are applicable to these AWF samples to quantify various molecules, for example: ICP-MS, NMR, HPLC, atomic absorption spectroscopy, protein mass spectrometry. The protein component of the apoplast is also represented in the AWF as shown in the Coomassie Brilliant Blue stained SDS-PAGE gel in Figure 3. Among other roles, the apoplastic enzymes are responsible for the synthesis of the cell wall and the creation of extracellular reactive oxygen species. Proteomic studies of AWF from various species have identified dozens of individual proteins and shown that the protein component of the apoplast responds to environmental stress13,19. Ideally AWF extract should be free from contamination by cytoplasmic proteins such as Rubisco; however in practice this is difficult to achieve. The presence of a Rubisco protein band at ~53 kDa following SDS-PAGE provides a further qualitative assay for the integrity of AWF samples. For example, the sample loaded in lane 2 in Figure 3 contains a greater amount of Rubisco contamination that of lane 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ผลลัพธ์ปกติสำหรับสกัด AWF ดำเนินบนสุขภาพอายุ 3 สัปดาห์ผด P. พันธุ์ Tendergreenleaves ใช้น้ำกลั่นของเหลวแทรกซึมอยู่ดังแสดงในตาราง 2 หนุ่ม P. ผดใบจะคล้อยตามการแทรกซึม และหมุนเหวี่ยงความเร็วที่ใช้ที่นี่ (1,000 x g) สามารถมองเห็นการกำจัดส่วนใหญ่ของของเหลวที่แทรกซึมโดยการหมุนเหวี่ยงกับใบไม้กลับไปสีเขียวเดิมของพวกเขา P. ผดใบน้ำหนักสดถูกบนเฉลี่ย 1.1 x g ก่อนแทรกซึม และผล AWF 0.5 มิลลิลิตรต่อกรัมน้ำหนักสด ความเข้มข้นของโปรตีนของ AWF ถูกกำหนดเป็น 0.18 ± 0.08 มิลลิกรัม/มิลลิลิตรโดยใช้การทดสอบโปรตีนแบรดฟอร์ดมาตรฐาน ตัวเจือจางสำหรับใบนี้ คำนวณ โดยวัดครามแดงเจือจาง ถูกพับ± 0.3 2.3 ค่าข้างต้นอาจแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างสายพันธุ์ และการทดลองนำร่องจะต้องกำหนดผลผลิตของ AWF ต่อกรัมน้ำหนักสดของใบ เป็น AWF โปรตีนเข้มข้นและเจือจางปัจจัยที่สามารถคาดหวังสำหรับชนิดใบกำหนด เสียความสมบูรณ์ของเซลล์อาจเกิดขึ้น ระหว่างขั้น ตอนการแทรกซึม ถ้าการเปลี่ยนแปลงความดันอย่างรวดเร็วเกินไป และ ระหว่างขั้นตอนการหมุนเหวี่ยงหากแรงเหวี่ยงสูงเกินไป ดังนั้นจึงจำเป็นต้อง assay AWF ตัวอย่างสำหรับเครื่องหมายของรายการเลือกปน ระดับ assays อิสระหลายจะดำเนินการ นี่ จะรายงานผลจาก assays เป็นไปได้ที่สามในตาราง 2 ในสกัดทำดีของ P. ผด AWF, G6PDH เป็น undetectable โดยทดสอบมาตรฐานเอนไซม์ นี่คือสอดคล้องกับรายงานอื่น ๆ ที่กิจกรรม G6PDH จะตรวจจับได้เฉพาะข้างเกณฑ์แรงเหวี่ยง force12 ความเปรียบต่าง มาลาเต dehydrogenase กิจกรรมในระดับพื้นฐาน (2.5 U / ml) ถูกตรวจพบได้ในตัวอย่าง AWF P. ผดทั้งหมดที่ใช้ทดสอบการเผาผลาญอาหารมาตรฐาน เพิ่มแรงเหวี่ยงเหนือขีดจำกัดของ 1,000 x g ผลเพิ่ม MDH กิจกรรม (ไม่แสดงผล) Apoplast จากสายพันธุ์อื่น ๆ เป็นที่รู้จักมี activity18 MDH ภายนอก จำนวนเงินที่พบที่นี่ถือว่ากิจกรรม apoplastic ของแท้ และเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญระดับพื้นฐานนี้จะบ่งบอกการปนเปื้อน ยังสามารถใช้สารที่มีความคิดที่เป็นรายการเลือก เช่นเฮกโซส-6-ฟอสเฟต เพื่อประเมินการปนเปื้อนของ AWF ที่นี่ วิเคราะห์ GC MS พบศูนย์หรือระดับของ G-6-P ใน AWF สกัด โดยคมชัด ในส่วนรากข้าวโพดตัด G-6-P ตรวจพบหลังจากสกัด AWF ทั้งหมดหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็ว และเพิ่มความเข้มข้นที่ความเร็วสูง แสดงรายการเลือก contamination10 Metabolite วิเคราะห์ โดย GC MS ใบ P. ผด AWF โดยทั่วไปผลผลิต 40-60 สามารถระบุสารและสารประกอบ unidentifiable (รูป 2) จำนวนประมาณเท่านี้ กรดอินทรีย์ น้ำตาลเรียบง่าย และกรดอะมิโนเป็นตัวแทนของสารส่วนบุคคล อย่างไรก็ตาม สารพืชรองยังได้ตรวจพบ และวัดจาก AWF11 หลายอย่างยอดจากระดับชั้นโมเลกุลแตกต่างกันเหล่านี้จะมีป้ายชื่อในรูปที่ 2 เพิ่มเติม เทคนิควิเคราะห์ที่ปลายน้ำจะเกี่ยวข้องกับตัวอย่างเหล่านี้ AWF ปริมาณโมเลกุลต่าง ๆ ตัวอย่างเช่น: โปรตีนรเมท HPLC, NMR ดูดกลืนโดยอะตอมมิก ICP MS ส่วนประกอบโปรตีนของ apoplast ยังแสดงใน AWF ดังที่แสดงใน Coomassie Blue สดใสย้อมเจล SDS-หน้าภาพที่ 3 ในบทบาทอื่น ๆ เอนไซม์ apoplastic รับผิดชอบการสังเคราะห์ผนังเซลล์และสร้างออกซิเจนปฏิกิริยาสารพันธุ์ Proteomic การศึกษาของ AWF จากหลากหลายชนิดมีระบุของโปรตีนแต่ละ และแสดงว่า ส่วนประกอบโปรตีนของ apoplast การตอบสนองสิ่งแวดล้อม stress13, 19 ระดับ AWF สารสกัดควรปราศจากการปนเปื้อนโดยรายการเลือกโปรตีนเช่น Rubisco อย่างไรก็ตาม ในทางปฏิบัติ นี้เป็นเรื่องยากที่จะบรรลุ ของวงโปรตีน Rubisco ที่ ~ 53 kDa ต่อหน้า SDS ให้ทดสอบคุณภาพเพิ่มเติมเพื่อความสมบูรณ์ของ AWF ตัวอย่าง เช่น โหลดในเลนที่ 2 ภาพที่ 3 ตัวอย่างประกอบด้วยปริมาณมากขึ้นปน Rubisco ที่เลน 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ผลการทั่วไปสำหรับสกัด AWF ดำเนินการเกี่ยวกับสุขภาพดีอายุ 3 สัปดาห์ P. vulgaris CV Tendergreenleaves ใช้น้ำกลั่นเป็นของเหลวแทรกซึมจะแสดงในตารางที่ 2 หนุ่มพีใบขิงเป็นคล้อยตามการแทรกซึมและการหมุนเหวี่ยงที่ความเร็วที่ใช้ที่นี่ (1,000 XG) การกำจัดของคนส่วนใหญ่ของของเหลวแทรกซึมโดยการหมุนเหวี่ยงที่สามารถเห็นได้โดยตรง เป็นใบเปลี่ยนกลับไปเป็นสีเขียวเดิม P. vulgaris ใบน้ำหนักสดเฉลี่ย 1.1 XG ก่อนที่จะแทรกซึมและให้ผล 0.5 มิลลิลิตร AWF ต่อกรัมน้ำหนักสด ความเข้มข้นของโปรตีน AWF มุ่งมั่นจะเป็น 0.18 ± 0.08 mg / ml โดยใช้มาตรฐานการทดสอบแบรดฟอโปรตีน ปัจจัยที่เจือจางใบเหล่านี้คำนวณโดยการวัดเจือจางสีครามสีแดงเป็น 2.3 ± 0.3 เท่า ค่าข้างต้นสามารถแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างเผ่าพันธุ์และการทดลองนำร่องจะต้องกำหนดอัตราผลตอบแทนต่อ AWF ใบกรัมน้ำหนักสดเช่นเดียวกับ AWF ความเข้มข้นของโปรตีนและปัจจัยที่ทำให้เจือจางที่สามารถคาดหวังสำหรับประเภทใบที่กำหนด เกิดความเสียหายต่อความสมบูรณ์ของเซลล์สามารถเกิดขึ้นได้ทั้งในระหว่างขั้นตอนการแทรกซึมหากมีการเปลี่ยนแปลงในความดันที่มีอย่างรวดเร็วเกินไปและในระหว่างขั้นตอนการหมุนเหวี่ยงถ้าแรงเหวี่ยงสูงเกินไป ดังนั้นจึงเป็นเรื่องจำเ​​ป็นที่จะต้อง assay ตัวอย่าง AWF สำหรับเครื่องหมายของการปนเปื้อนนิวเคลียส; นึกคิดหลายชุดตรวจอิสระจะดำเนินการ นี่คือผลการตรวจจากสามเป็นไปได้ที่จะมีการรายงานในตารางที่ 2 ในการสกัดสารที่ดีดำเนินการของพี vulgaris AWF, G6PDH เป็น undetectable โดยเอนไซม์ทดสอบมาตรฐาน ซึ่งสอดคล้องกับรายงานอื่น ๆ ที่จะกลายเป็นกิจกรรม G6PDH ตรวจพบเพียงข้างต้นเกณฑ์ force12 แรงเหวี่ยง ในทางตรงกันข้ามในระดับพื้นฐานของกิจกรรม dehydrogenase มาเลต (2.5 U / ml) เป็นที่ตรวจพบในทุก P. vulgaris ตัวอย่าง AWF ใช้ทดสอบการเผาผลาญมาตรฐาน การเพิ่มแรงเหวี่ยงสูงกว่าเกณฑ์ 1,000 XG ส่งผลในกิจกรรม MDH เพิ่มขึ้น (ผลไม่แสดง) ในฐานะที่เป็น apoplast จากสายพันธุ์อื่น ๆ ที่เป็นที่รู้จักกันประกอบด้วยภายนอก MDH activity18 จำนวนเงินที่ตรวจพบที่นี่ถือว่าเป็นกิจกรรม apoplastic แท้และการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเหนือระดับพื้นฐานนี้จะบอกเล่าของการปนเปื้อน metabolites ที่จะคิดว่าเป็นส่วนใหญ่นิวเคลียสเช่น hexose-6-ฟอสเฟตนอกจากนี้ยังสามารถใช้ในการประเมินการปนเปื้อนของ AWF นี่คือการวิเคราะห์ GC-MS ตรวจพบร่องรอยศูนย์หรือระดับของ G-6-P สกัด AWF โดยคมชัดในส่วนรากตัดข้าวโพด G-6-P ถูกตรวจพบหลังจากการสกัด AWF หมุนเหวี่ยงที่ความเร็วและเพิ่มขึ้นในความเข้มข้นที่ความเร็วสูงแสดงให้เห็น contamination10 นิวเคลียส วิเคราะห์ metabolite ด้วย GC-MS พี vulgaris ใบ AWF มักจะมีอัตราผลตอบแทน 40-60 สารระบุตัวและจำนวนที่เท่ากันโดยประมาณของสารระ (รูปที่ 2) กรดอินทรีย์น้ำตาลง่ายและกรดอะมิโนเป็นตัวแทนกลุ่มของสารที่สามารถระบุตัวตน แต่สารพืชรองยังได้รับการตรวจพบและวัดจาก AWF11 ยอดตัวอย่างจากหลายชั้นเรียนโมเลกุลเหล่านี้แตกต่างกันมีความโดดเด่นในรูปที่ 2 เทคนิคการวิเคราะห์เพิ่มเติมปลายน้ำมีผลบังคับใช้เหล่านี้ตัวอย่าง AWF ปริมาณโมเลกุลต่างๆเช่น: ICP-MS, NMR, HPLC, อะตอมดูดซึมสเปกโทรสโกโปรตีนมวลสาร องค์ประกอบของโปรตีน apoplast ยังเป็นตัวแทนใน AWF ดังที่แสดงใน Coomassie สีฟ้าสดใสเจลสี SDS-PAGE ในรูปที่ 3 ในบรรดาบทบาทอื่น ๆ , เอนไซม์ apoplastic มีความรับผิดชอบในการสังเคราะห์ของผนังเซลล์และการสร้างสารที่มีปฏิกิริยา ชนิดออกซิเจน การศึกษาโปรตีนของ AWF จากสายพันธุ์ต่างๆได้ระบุหลายสิบของโปรตีนของแต่ละบุคคลและแสดงให้เห็นว่าองค์ประกอบของโปรตีน apoplast ตอบสนองต่อการ stress13,19 สิ่งแวดล้อม จะเป็นการดีที่สารสกัดจาก AWF ควรจะเป็นอิสระจากการปนเปื้อนจากโปรตีนนิวเคลียสเช่น Rubisco; แต่ในทางปฏิบัตินี้เป็นเรื่องยากที่จะบรรลุ การปรากฏตัวของวงโปรตีน Rubisco ประมาณ 53 กิโลดาลตันต่อไปนี้ระบบ SDS-PAGE ยังมีการทดสอบคุณภาพต่อไปสำหรับความสมบูรณ์ของตัวอย่าง AWF ยกตัวอย่างเช่นตัวอย่างที่โหลดในช่องทางที่ 2 ในรูปที่ 3 มีจำนวนมากของการปนเปื้อนของ Rubisco เลน 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โดยทั่วไปผลลัพธ์สำหรับการสกัด awf การมีสุขภาพดีอายุ 3 สัปดาห์ P . vulgaris cv . tendergreenleaves โดยใช้น้ำกลั่นเป็นซึมของเหลวจะถูกแสดงในตารางที่ 2 หนุ่ม P . vulgaris ใบจะซูฮกให้แทรกซึม และที่ความเร็วที่ปั่นใช้ที่นี่ ( 1 , 000 x G ) กำจัดส่วนใหญ่ของของเหลวซึมโดยการเหวี่ยงแยกได้โดยตรงเห็นใบไม้เปลี่ยนสีเขียวเดิม P . vulgaris ใบ น้ำหนักสด มีค่า เฉลี่ย 1.1 x G ก่อนการแทรกซึมจาก 0.5 มิลลิลิตร ต่อน้ำหนักสด awf กรัม ระดับโปรตีนของ awf ตั้งใจจะ± 0.08 0.18 mg / ml โดยใช้มาตรฐานแบรดฟอร์ดโปรตีน ตามลำดับ ปัจจัย 4 สำหรับใบนี้คำนวณโดยการวัดสีครามสีแดงเจือจางเป็น 2.3 ± 0.3 เท่า ค่าข้างต้นสามารถแตกต่างกันอย่างมากระหว่างการทดลองชนิดและนักบินจะต้องตรวจสอบผลผลิตของ awf กรัมต่อน้ำหนักสดของใบ ตลอดจน awf โปรตีนความเข้มข้นและเจือจางองค์ประกอบที่สามารถคาดหวังเพื่อให้ใบพิมพ์ ความเสียหายต่อความสมบูรณ์ของเซลล์สามารถเกิดขึ้นได้ทั้งในรูปแบบขั้นตอน ถ้าการเปลี่ยนแปลงในความดันเป็นอย่างรวดเร็วเกินไป และในขั้นตอนที่ 3 ถ้าแรงเหวี่ยงสูงจนเกินไป จึงจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องวิเคราะห์ awf ตัวอย่างเครื่องหมายของการปนเปื้อนพบ ideally ) อิสระหลายจะดําเนินการ ที่นี่ผลจากสามวิธีที่เป็นไปได้จะมีการรายงานในตารางที่ 2 ดีแสดงปริมาตรของ P . vulgaris awf g6pdh เป็น undetectable , เอนไซม์โดยวิธีมาตรฐาน ซึ่งสอดคล้องกับรายงานอื่น ๆที่เป็นกิจกรรม g6pdh ได้แค่ข้างบนเพดาน พัดลมดูดอากาศ force12 . ในทางตรงกันข้าม พื้นฐาน ระดับของกิจกรรม dehydrogenase Malate ( 2.5 U / ml ) คือการตรวจพบใน P . vulgaris awf ตัวอย่าง โดยใช้มาตรฐานเกี่ยวกับการทดสอบ เพิ่มแรงเหวี่ยงสูงกว่าเกณฑ์ของ 1 , 000 x g ทำให้เพิ่มกิจกรรมชนิด ( ผลลัพธ์ไม่แสดง ) เป็นแอโพพลาสต์จากสายพันธุ์อื่น ๆเป็นที่รู้จักกันมีโครงสร้างชนิด activity18 , ปริมาณที่ตรวจพบ ที่นี่ถือว่าของแท้ apoplastic กิจกรรมและเพิ่มขึ้นเหนือระดับพื้นฐานนี้จะแสดงให้เห็นถึงการปนเปื้อน สาร ที่คิดว่า จะ พบ เด่น เช่น hexose-6-phosphates ยังสามารถใช้เพื่อประเมินการปนเปื้อนของ awf . ที่นี่การวิเคราะห์ GC-MS พบศูนย์หรือติดตามระดับของ g-6-p ใน awf การสกัด . โดยคมชัดในการตัดข้าวโพดรากส่วน g-6-p ถูกตรวจพบหลังจาก awf การสกัดที่ความเร็วที่ปั่นทั้งหมด และเพิ่มความเข้มข้นในความเร็วสูง ซึ่งพบ contamination10 . วิเคราะห์โดย GC-MS ไลท์ของ P . vulgaris ใบ awf โดยปกติผลผลิต 40 - 60 ที่ระบุสายพันธุ์และจำนวนประมาณเท่ากับของที่ไม่สามารถพิสูจน์สารประกอบ ( รูปที่ 2 ) กรดอินทรีย์ น้ำตาลง่ายและกรดอะมิโนแสดงเป็นกลุ่มของสาร , ระบุอย่างไรก็ตาม สารรองพืชยังได้รับการตรวจพบและวัดได้จาก awf11 . หลายตัวอย่างยอดเหล่านี้แตกต่างจากโมเลกุลของชั้น ป้ายในรูปที่ 2 เพิ่มเติมด้านเทคนิคการวิเคราะห์จะสามารถใช้ได้กับตัวอย่าง awf เหล่านี้ที่มีโมเลกุลต่าง ๆ ตัวอย่างเช่น : ICP-MS , NMR , HPLC , Atomic absorption spectroscopy , มวลสารโปรตีน . โปรตีนที่เป็นส่วนประกอบของแอโพพลาสต์ยังเป็นตัวแทนใน awf ตามที่แสดงในการแก้ปัญหาเหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้าสดใสเปื้อนเจลในรูปที่ 3 ในบทบาทอื่น ๆ ที่ใช้ apoplastic รับผิดชอบในการสังเคราะห์ผนังเซลล์และการสร้างที่มีปฏิกิริยาชนิดออกซิเจน . จากการศึกษาของ awf โปรตีนชนิดต่างๆได้ระบุสิบบุคคลและแสดงให้เห็นว่าโปรตีนโปรตีนเป็นส่วนประกอบของ stress13,19 โพพลาสต์ตอบสนองต่อสิ่งแวดล้อม ซึ่งสารสกัดจาก awf ควรจะฟรีจากการปนเปื้อนโดยโปรตีนนี้ เช่น rubisco อย่างไรก็ตามในทางปฏิบัตินี้ยากที่จะบรรลุ สถานะของแถบโปรตีนที่ rubisco ~ 53 kDa เอนไซม์มีคุณภาพต่อไปนี้การทดสอบเพิ่มเติมเพื่อความสมบูรณ์ของตัวอย่าง awf . ตัวอย่างเช่น ตัวอย่างที่โหลดในซอย 2 ในรูปที่ 3 มีมากขึ้น การปนเปื้อนของ rubisco ของเลน 1