2.9. Western blottingThe tissue hom

2.9. Western blotting
The tissue homogenates were mixed with 5× sample buffer (8% SDS; 0.04%
Coomassie blue R-250; 40% glycerol; 200 mM Tris, pH 6.8 and 10% 2-mercaptoethanol)
and boiled for 10 min. Samples were electrophoresed in a 10% SDS-PAGE minigel and
then transferred onto polyvinylidenedifluoride membranes (PVDF; Millipore Corp.,
Bedford, MA, USA) with transfer buffer (48 mM Tris; 39 mM glycine; 0.0037% SDS and
20% methanol) at 350 mA for 60 min. The membranes were blocked with 5% nonfat
milk in PBS solution containing 0.1% Tween-20 (PBST) for 1 h. The membrane was
immunoblotted, respectively, with primary antibodies of rabbit anti-rat Nrf2, anti-Aβ
and anti-rat mitogen-activated protein kinase (MAPK) family in PBST solution
containing 5% bovine serum albumin at 4°C overnight. After consecutive 30-min
PBST washes, the membrane was incubated with horseradish peroxidase-labeled
secondary antibody for 60 min at room temperature and then washed with PBST for 30
min. The final detection was performed using an enhanced chemiluminescence (ECL™
kit) Western blotting reagents (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.9. blotting วิธีตะวันตกHomogenates เนื้อเยื่อถูกผสมกับ× 5 อย่างบัฟเฟอร์ (8% SDS, 0.04%Coomassie blue R-250 กลีเซอร 40% 200 มม.ตรี pH 6.8 และ 10% 2-mercaptoethanol)และต้มสำหรับตัวอย่าง 10 นาทีมี electrophoresed ในตัว 10% SDS-หน้า minigel และจากนั้น โอนย้ายไปเข้า polyvinylidenedifluoride (PVDF Corp.มากกลาสโกว์ MA, USA) พร้อมโอนบัฟเฟอร์ (48 mM ตรี glycine 39 mM; 0.0037% SDS และเมทานอล 20%) ที่ 350 mA สำหรับ 60 นาที สารที่ถูกบล็อก nonfat 5%นมในโซลูชัน PBS ประกอบด้วย 0.1% Tween-20 (PBST) สำหรับ 1 h เยื่อได้immunoblotted ตามลำดับ กับแอนตี้หลักของกระต่ายป้องกันหนู Nrf2, anti-Aβและครอบครัว PBST โซลูชั่นป้องกันหนูเรียก mitogen โปรตีน kinase (MAPK)ประกอบด้วย 5% วัว serum albumin ที่ 4° C ค้างคืน หลังจาก 30 นาทีติดต่อกันต่อผิวหน้า PBST เมมเบรนมี incubated กับ horseradish peroxidase ป้ายแอนติบอดีรองใน 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง และล้าง ด้วย PBST สำหรับ 30นาที ตรวจสอบขั้นสุดท้ายทำใช้ chemiluminescence ที่เพิ่มขึ้น (ECL ™ชุด) ตะวันตก blotting วิธี reagents (Pharmacia Amersham เทคโนโลยีชีวภาพ NJ สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.9 เวสเทิร์ blotting
homogenates เนื้อเยื่อถูกผสมกับ 5 ×บัฟเฟอร์ตัวอย่าง (8% SDS; 0.04%
Coomassie สีฟ้า R-250; 40% กลีเซอรอล 200 มิลลิทริสพีเอช 6.8 และ 10% 2 mercaptoethanol)
และต้มเป็นเวลา 10 นาที ตัวอย่าง electrophoresed ใน 10% minigel SDS-PAGE
และจากนั้นก็ย้ายไปยังเยื่อpolyvinylidenedifluoride (PVDF; คคอร์ป,
ฟอร์ด, MA, USA) ที่มีการถ่ายโอนบัฟเฟอร์ (48 มิลลิทริส; 39 มิลลิ glycine; 0.0037% SDS
และเมทานอล20%) ที่ 350 มิลลิแอมป์ 60 นาที เยื่อถูกบล็อก 5%
ไม่มีน้ำมันนมพีบีเอสในการแก้ปัญหาที่มี0.1% Tween-20 (PBST) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง เมมเบรนได้
immunoblotted ตามลำดับโดยมีแอนติบอดี้หลักของกระต่ายต่อต้านหนู NRF2
ป้องกันAβและป้องกันหนูโปรตีนไคเนสmitogen เปิดใช้งาน (MAPK) ครอบครัวในการแก้ปัญหา PBST
ที่มี 5% ซีรั่มอัลบูมิวัวที่ 4 ° C ในชั่วข้ามคืน หลังจากที่ติดต่อกัน 30
นาทีล้างPBST เมมเบรนที่ถูกบ่มกับมะรุม peroxidase
ติดฉลากแอนติบอดีรองสำหรับ60 นาทีที่อุณหภูมิห้องและล้างแล้วกับ PBST 30
นาที การตรวจสอบขั้นสุดท้ายที่ได้ดำเนินการโดยใช้ chemiluminescence เพิ่มขึ้น (ECL
™ชุด) น้ำยาซับตะวันตก (Amersham Pharmacia ไบโอเทค, NJ, สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.9 . Western blotting
เนื้อเยื่อ homogenates ผสม 5 ×ตัวอย่างบัฟเฟอร์ ( 8 % t ; 0.04 %
เหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้า r-250 ; 40 % กลีเซอรอล ; 200 มม. ซึ่ง pH 6.8 และ 10% อย่างเดียว )
และต้มนาน 10 นาที จำนวน electrophoresed ใน minigel 10% SDS-PAGE และจากนั้นโอนไปยัง polyvinylidenedifluoride
+ ( PVDF ; มิลลิ .
Bedford , MA , USA ) กับบัฟเฟอร์โอน ( 48 mm โดย ;39 มม. ไกลซีน ; 0.0037 % SDS และ
20 % เมทานอล ) มา 350 60 นาทีเยื่อที่ถูกบล็อกด้วย 5 % นมไม่มีไขมัน
PBS สารละลายที่มี 0.1% tween-20 ( pbst ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงเมมเบรน
immunoblotted ตามลำดับ ระดับแอนติบอดีต่อต้าน nrf2 หนูกระต่าย
anti-a บีตาและต่อต้านหนูปรากฎเปิดโปรตีนไคเนส ( mapk ) ครอบครัว
pbst โซลูชั่นเซรั่มที่ประกอบด้วย 5% อัลบูมิวัว 4 ° C ในชั่วข้ามคืน หลังจากติดต่อกัน 30 นาที
pbst ล้างเมมเบรนถูกบ่มกับพืชชนิดหนึ่งมีป้าย
รองแอนติบอดีต่อ 60 นาที ที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นล้างด้วย pbst 30
นาทีการตรวจจับสุดท้ายคือการใช้นโยบายแรงงานที่เพิ่มขึ้น ( ECL ™
Kit ) Western blotting สารเคมี ( ที่มุ่งมั่น ไบโอเทค , NJ , USA )