- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Cell cultureMMTV-PyMT;Apc+/+ and MM
Cell culture
MMTV-PyMT;Apc+/+ and MMTV-PyMT;ApcMin/+ cells
were isolated as previously described [23] and were grown
in RPMI 1640 media supplemented with 10 % fetal bovine
serum, 1 % penicillin/streptomycin and 1:5000 plasmocin
(Invivogen, San Diego, CA). MDA-MB-157 breast cancer
cells (ATCC, Manassas, VA) were maintained in RPMI
1640 media supplemented with 10 % fetal bovine serum, 1
% penicillin/streptomycin, 25 mM HEPES and 1:5000
plasmocin. All cells were routinely passaged using 0.25 %
trypsin/EDTA and maintained at 37 °C with 5 % CO2.
MDA-MB-157 cells were subjected to lentiviral mediated
shRNA knockdown of APC using two different MISSION
shRNA APC constructs (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
After transduction, cells were maintained in media containing
1.5 μg/mL puromycin (Sigma-Aldrich).
Drug treatment
Cells were treated for 24 h with each chemotherapeutic
agent or solvent control: doxorubicin (MP Biomedicals,
LLC, Santa Ana, CA), paclitaxel (Sigma-Aldrich) or
cisplatin (cis-Diammineplatinum (III) dichloride, SigmaAldrich).
Drug concentrations for MMTV-PyMTderived
cells were 2.5 μM paclitaxel, 16 μM cisplatin, or
500 nM doxorubicin. MDA-MB-157 cells were treated
with 0.078 μM paclitaxel, 4 μM cisplatin or 12.5 nM
VanKlompenberg et al. BMC Cancer (2015) 15:457 Page 2 of 14
doxorubicin. These drug doses were selected after treatment
of the MMTV-PyMT;Apc+/+ cells from 24–72 h
showed approximately a 50 % reduction in cell population
(data not shown). For the combination treatments,
chemical inhibitors were added to the media 18 h after
chemotherapeutic agents, resulting in a 6 h treatment
with a combination of cisplatin or doxorubicin and
50 μM PP2 (Src inhibitor, Sigma-Aldrich) or 50 μM
SP600125 (JNK inhibitor, Sigma-Aldrich). For BrdU incorporation
assays, treatment was the same as above
with the addition of 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU,
10 μM, BD Pharmigen, Franklin Lakes, NJ) 8 h after
chemotherapeutic agents.
Immunofluorescence
For all experiments, cells were seeded in 12 well plates
on glass coverslips for 24 h prior to treatment. For cell
proliferation via BrdU incorporation, apoptosis via
cleaved caspase 3 and APC immunofluorescence, cells
were fixed in 3.7 % formaldehyde for 15 min and then
permeabilized in 0.3 % Triton X-100 for 15 min. Immunofluorescence
(IF) for BrdU was performed as
previously described [23]. All antibodies were diluted in
blocking buffer that consisted of 0.2 % non-fat dry milk,
2 % Bovine Serum Albumin and 0.3 % Triton X-100 in
Phosphate Buffered Saline (PBS). Cells were incubated
with primary antibodies: anti-BrdU rat monoclonal antibody
(1:300, Abcam, Cambridge, MA), anti-cleaved caspase
3 rabbit monoclonal antibody (1:400, Cell Signaling
Technology, Danvers, MA) or anti-APC (1:400, a gift from
K. Neufeld, University of Kansas) for 1 h at 37 °C.
Following washes in PBS, samples were incubated in
the appropriate secondary antibody: rhodamine conjugated
goat anti-rat (1:100, Thermo Scientific, Rockford,
IL) or goat-anti-rabbit Alexa Fluor 488 (1:1000, Life
Technologies, Carlsbad, CA). F-actin was visualized by
co-staining with fluorescently conjugated Phalloidin
(1:200, Life Technologies) and slides were mounted
with Fluoromount G with Hoescht. The percent of
positive cells was determined for each assay with at
least 150 cells being counted per condition. Each assay
was run in triplicate and repeated three times.
RNA isolation and RT-PCR
MMTV-PyMT;Apc+/+ and MMTV-PyMT;ApcMin/+ cells
were seeded at 2.4 x105 cells/well in 6 well plates for 24 h
then treated with drugs as above for 24 h. RNA was
isolated using Tri Reagent (Molecular Research Center,
Cincinnati, OH) and cDNA synthesis was performed with
iScript from 1 μg RNA (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA). Real-time RT-PCR was performed using Power SYBR
Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA),
50 ng of cDNA, and 7.5 μM of each primer (primer
sequences are presented in Table 1). The amplification
program included 2 initial steps at 50 °C for 2 min and
95 °C for 10 min followed by 40 cycles of 95 °C for 15 s
and 60 °C for 1 min followed by generation of a melt curve
(CFX Connect 96 thermal cycler, Bio-Rad). Samples were
run in duplicate and 18 s rRNA was used as a reference
gene for all mouse studies. Microarray analysis on MDR1
and ABCG2 was previously described [11]. The knockdown
of APC in the MDA-MB-157 cells was verified via
quantitative real time PCR following the same protocol
with GAPDH as the reference gene.
Western blots
Total protein was isolated from MMTV-PyMT tumorderived
cells after 24 h treatment with the same chemotherapeutic
agents as above using lysis buffer (20 mM
Tris–HCl, 150 mM NaCl, 1 % Triton-X, 0.5 % NP-40,
50, mM NaF, 1 mM Na3VO4, 5 mM Sodium pyrophosphate,
0.2 mM PMSF, 1x protease inhibitor cocktail
(Fisher) and 1x phosphatase inhibitor cocktail 2 (Sigma).
30 μg of protein were separated by SDS-PAGE (8 % gel),
and transferred onto Immobilon-P membrane (Millipore).
After transfer, membranes were blocked in 5 %
non-fat dry milk in 1 % TBS with 0.1 % Tween (TBS-T)
for 1 h at room temperature. Blots were incubated with
the primary antibody (MDR1, 1:1000 in 1 % bovine
serum albumin in TBS-T, Cell Signaling, or ABCG2,
1:100 in 5 % non-fat dry milk in TBS-T, Abcam) for 2
nights at 4 °C or β-actin (1:25000, 1 % BSA in TBS-T,
Sigma) for 1 h at room temperature. Secondary antibody
(anti-rabbit, anti-rat or anti-mouse IgG-HRP, 1:1000) was
diluted in the same diluent as the corresponding primary
MMTV-PyMT;Apc+/+ and MMTV-PyMT;ApcMin/+ cells
were isolated as previously described [23] and were grown
in RPMI 1640 media supplemented with 10 % fetal bovine
serum, 1 % penicillin/streptomycin and 1:5000 plasmocin
(Invivogen, San Diego, CA). MDA-MB-157 breast cancer
cells (ATCC, Manassas, VA) were maintained in RPMI
1640 media supplemented with 10 % fetal bovine serum, 1
% penicillin/streptomycin, 25 mM HEPES and 1:5000
plasmocin. All cells were routinely passaged using 0.25 %
trypsin/EDTA and maintained at 37 °C with 5 % CO2.
MDA-MB-157 cells were subjected to lentiviral mediated
shRNA knockdown of APC using two different MISSION
shRNA APC constructs (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
After transduction, cells were maintained in media containing
1.5 μg/mL puromycin (Sigma-Aldrich).
Drug treatment
Cells were treated for 24 h with each chemotherapeutic
agent or solvent control: doxorubicin (MP Biomedicals,
LLC, Santa Ana, CA), paclitaxel (Sigma-Aldrich) or
cisplatin (cis-Diammineplatinum (III) dichloride, SigmaAldrich).
Drug concentrations for MMTV-PyMTderived
cells were 2.5 μM paclitaxel, 16 μM cisplatin, or
500 nM doxorubicin. MDA-MB-157 cells were treated
with 0.078 μM paclitaxel, 4 μM cisplatin or 12.5 nM
VanKlompenberg et al. BMC Cancer (2015) 15:457 Page 2 of 14
doxorubicin. These drug doses were selected after treatment
of the MMTV-PyMT;Apc+/+ cells from 24–72 h
showed approximately a 50 % reduction in cell population
(data not shown). For the combination treatments,
chemical inhibitors were added to the media 18 h after
chemotherapeutic agents, resulting in a 6 h treatment
with a combination of cisplatin or doxorubicin and
50 μM PP2 (Src inhibitor, Sigma-Aldrich) or 50 μM
SP600125 (JNK inhibitor, Sigma-Aldrich). For BrdU incorporation
assays, treatment was the same as above
with the addition of 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU,
10 μM, BD Pharmigen, Franklin Lakes, NJ) 8 h after
chemotherapeutic agents.
Immunofluorescence
For all experiments, cells were seeded in 12 well plates
on glass coverslips for 24 h prior to treatment. For cell
proliferation via BrdU incorporation, apoptosis via
cleaved caspase 3 and APC immunofluorescence, cells
were fixed in 3.7 % formaldehyde for 15 min and then
permeabilized in 0.3 % Triton X-100 for 15 min. Immunofluorescence
(IF) for BrdU was performed as
previously described [23]. All antibodies were diluted in
blocking buffer that consisted of 0.2 % non-fat dry milk,
2 % Bovine Serum Albumin and 0.3 % Triton X-100 in
Phosphate Buffered Saline (PBS). Cells were incubated
with primary antibodies: anti-BrdU rat monoclonal antibody
(1:300, Abcam, Cambridge, MA), anti-cleaved caspase
3 rabbit monoclonal antibody (1:400, Cell Signaling
Technology, Danvers, MA) or anti-APC (1:400, a gift from
K. Neufeld, University of Kansas) for 1 h at 37 °C.
Following washes in PBS, samples were incubated in
the appropriate secondary antibody: rhodamine conjugated
goat anti-rat (1:100, Thermo Scientific, Rockford,
IL) or goat-anti-rabbit Alexa Fluor 488 (1:1000, Life
Technologies, Carlsbad, CA). F-actin was visualized by
co-staining with fluorescently conjugated Phalloidin
(1:200, Life Technologies) and slides were mounted
with Fluoromount G with Hoescht. The percent of
positive cells was determined for each assay with at
least 150 cells being counted per condition. Each assay
was run in triplicate and repeated three times.
RNA isolation and RT-PCR
MMTV-PyMT;Apc+/+ and MMTV-PyMT;ApcMin/+ cells
were seeded at 2.4 x105 cells/well in 6 well plates for 24 h
then treated with drugs as above for 24 h. RNA was
isolated using Tri Reagent (Molecular Research Center,
Cincinnati, OH) and cDNA synthesis was performed with
iScript from 1 μg RNA (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA). Real-time RT-PCR was performed using Power SYBR
Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA),
50 ng of cDNA, and 7.5 μM of each primer (primer
sequences are presented in Table 1). The amplification
program included 2 initial steps at 50 °C for 2 min and
95 °C for 10 min followed by 40 cycles of 95 °C for 15 s
and 60 °C for 1 min followed by generation of a melt curve
(CFX Connect 96 thermal cycler, Bio-Rad). Samples were
run in duplicate and 18 s rRNA was used as a reference
gene for all mouse studies. Microarray analysis on MDR1
and ABCG2 was previously described [11]. The knockdown
of APC in the MDA-MB-157 cells was verified via
quantitative real time PCR following the same protocol
with GAPDH as the reference gene.
Western blots
Total protein was isolated from MMTV-PyMT tumorderived
cells after 24 h treatment with the same chemotherapeutic
agents as above using lysis buffer (20 mM
Tris–HCl, 150 mM NaCl, 1 % Triton-X, 0.5 % NP-40,
50, mM NaF, 1 mM Na3VO4, 5 mM Sodium pyrophosphate,
0.2 mM PMSF, 1x protease inhibitor cocktail
(Fisher) and 1x phosphatase inhibitor cocktail 2 (Sigma).
30 μg of protein were separated by SDS-PAGE (8 % gel),
and transferred onto Immobilon-P membrane (Millipore).
After transfer, membranes were blocked in 5 %
non-fat dry milk in 1 % TBS with 0.1 % Tween (TBS-T)
for 1 h at room temperature. Blots were incubated with
the primary antibody (MDR1, 1:1000 in 1 % bovine
serum albumin in TBS-T, Cell Signaling, or ABCG2,
1:100 in 5 % non-fat dry milk in TBS-T, Abcam) for 2
nights at 4 °C or β-actin (1:25000, 1 % BSA in TBS-T,
Sigma) for 1 h at room temperature. Secondary antibody
(anti-rabbit, anti-rat or anti-mouse IgG-HRP, 1:1000) was
diluted in the same diluent as the corresponding primary
0/5000
เพาะเลี้ยงเซลล์MMTV-PyMT เอพีซี + /mts + และ MMTV-PyMT ApcMin / + เซลล์ได้แยกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] และมีการเติบโตใน RPMI 1640 สื่อเสริม ด้วย 10% ครรภ์วัวเซรั่ม plasmocin ยา เพนนิซิลลิน/streptomycin และ 1:5000 1%(Invivogen ซานดิเอโก CA) มะเร็งเต้านม MDA-MB-157เซลล์ (ATCC, VA มานาสซาส) ถูกจัดเก็บอยู่ใน RPMI1640 สื่อเสริม ด้วยเซรั่มวัวครรภ์ 10%, 1ยาเพนนิซิลลิน% / streptomycin, 25 มม. HEPES และ 1:5000plasmocin เซลล์ทั้งหมดที่มี passaged ใช้ 0.25% เป็นประจำทริปซิ น/EDTA และรักษาที่ 37 ° C กับ 5% CO2MDA-MB-157 เซลล์ถูกต้องเพื่อ lentiviral mediatedshRNA knockdown ของ APC ใช้ภารกิจที่แตกต่างกันสองshRNA APC โครงสร้าง (Aldrich ซิก เซนต์หลุยส์ MO)หลัง transduction เซลล์ถูกจัดเก็บอยู่ในสื่อที่ประกอบด้วยPuromycin μg 1.5 mL (ซิก-Aldrich)รักษายาเสพติดเซลล์ได้รับการรักษาใน 24 ชมละเผชิญตัวแทนหรือตัวทำละลาย: doxorubicin (MP BiomedicalsLLC ไทเป CA), paclitaxel (ซิก-Aldrich) หรือcisplatin (cis-Diammineplatinum (III) dichloride, SigmaAldrich)ความเข้มข้นของยาใน MMTV PyMTderivedเซลล์ได้ 2.5 μM paclitaxel, 16 μM cisplatin หรือ500 nM doxorubicin MDA-MB-157 เซลล์ได้รับการรักษา0.078 μM paclitaxel, 4 μM cisplatin หรือ 12.5 nMมะเร็ง BMC VanKlompenberg et al. 15:457 (2015) หน้า 2 ของ 14doxorubicin เลือกปริมาณยาเสพติดเหล่านี้หลังการรักษาของ MMTV-PyMT เอพีซี + /mts เซลล์จาก 24-72 h +พบประมาณลด 50% ในประชากรเซลล์(ข้อมูลไม่แสดง) สำหรับการรักษาชุดเพิ่ม inhibitors เคมีสื่อ h 18 หลังตัวแทนเผชิญ ผลการรักษา 6 hมีส่วนผสมของ cisplatin หรือ doxorubicin และ50 μM PP2 (นายเตอร์ ซิก Aldrich) หรือ 50 μMSP600125 (JNK เตอร์ ซิก Aldrich) สำหรับจดทะเบียน BrdUassays รักษาเดียวกับข้างบนแห่ง 5-โบรโม-2'-deoxyuridine (BrdU10 μM, BD Pharmigen แฟรงคลินทะเลสาบ NJ) h 8 หลังหน้าที่เผชิญImmunofluorescenceสำหรับการทดลองทั้งหมด เซลล์ถูก seeded ในแผ่น 12 ดีใน coverslips แก้วใน 24 ชมก่อนการรักษา สำหรับเซลล์แพร่หลายผ่าน BrdU ประสาน apoptosis ผ่านcaspase แหวก 3 และ APC immunofluorescence เซลล์ไม่ถาวรใน 3.7% ฟอร์มาลดีไฮด์สำหรับ 15 นาทีแล้วpermeabilized 0.3% 15 นาที Immunofluorescence X ไตรตั้น-100(ถ้า) สำหรับ BrdU ทำเป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] แอนตี้ทั้งหมดถูกผสมในบล็อกบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 0.2% ไม่แห้งนม2% วัว Serum Albumin และ 0.3% ไตรตั้น X-100 ในฟอสเฟต Buffered น้ำเกลือ (PBS) เซลล์ถูก incubatedมีแอนตี้หลัก: แอนติบอดีต้าน BrdU ราษฎร์ monoclonal(1:300, Abcam เคมบริดจ์ MA), ต่อต้านแหวก caspaseกระต่าย 3 monoclonal แอนติบอดี (1: 400 เซลล์ตามปกติเทคโนโลยี เดนเวอร์ MA) หรือต่อต้าน-APC (1: 400 ของขวัญจากคุณยเฟลด์ มหาวิทยาลัยแคนซัส) สำหรับ h 1 ที่ 37 องศาเซลเซียสต่อ washes ใน PBS ตัวอย่างที่ incubated ในแอนติบอดีรองที่เหมาะสม: rhodamine กลวงหนูป้องกันแพะ (1: 100 เทอร์โมวิทยาศาสตร์ ร็อคฟอร์ดIL) หรือแพะป้องกันกระต่าย 488 Fluor Alexa (1:1000 ชีวิตเทคโนโลยี คาร์ลส CA) แอกติน F มี visualized โดยย้อมร่วมสีกับ fluorescently กลวง Phalloidin(1: 200 เทคโนโลยีชีวิต) และภาพนิ่งถูกติดตั้งกับ G Fluoromount กับ Hoescht ร้อยละของกำหนดสำหรับแต่ละทดสอบกับที่เซลล์บวกอย่างน้อย 150 เซลล์ถูกนับต่อเงื่อนไข ทดสอบแต่ละถูกเรียกใช้ใน triplicate และซ้ำสามครั้งแยกอาร์เอ็นเอและ RT-PCRMMTV-PyMT เอพีซี + /mts + และ MMTV-PyMT ApcMin / + เซลล์มี seeded ที่ 2.4 x 105 เซลล์/ดีใน 6 แผ่นดี 24 ชมแล้ว รับยาด้านบนสำหรับ 24 h. อาร์เอ็นเอได้แยกต่างหากโดยใช้รีเอเจนต์ Tri (ศูนย์วิจัยโมเลกุลซินซินนาติ OH) และทำการสังเคราะห์ cDNA ด้วยiScript จากอาร์เอ็นเอ (Bio Rad ห้องปฏิบัติ เฮอร์คิวลิส 1 μgCA) ทำแบบเรียลไทม์ RT-PCR ใช้ SYBR พลังงานส่วนผสมหลักสีเขียว (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA),50 ng ของ cDNA, μM 7.5 (รองพื้นแต่ละพื้นลำดับที่แสดงในตารางที่ 1) ขยายการโปรแกรมรวม 2 ขั้นตอนเริ่มต้นที่ 50 ° C สำหรับ 2 นาที และ95 ° C สำหรับ 10 นาทีตาม ด้วยรอบ 40 95 องศาเซลเซียส 15 sและ 60 องศาเซลเซียสใน 1 นาทีตาม ด้วยรุ่นของละลาย(CFX เชื่อมต่อ 96 ร้อน cycler, Bio Rad) ตัวอย่างดีใช้ซ้ำ และ 18 s rRNA ถูกใช้อ้างอิงยีนสำหรับศึกษาเมาส์ทั้งหมด วิเคราะห์ Microarray MDR1และ ABCG2 ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [11] การ knockdownของ APC ในเซลล์ MDA-MB-157 ถูกตรวจสอบผ่านเวลาจริงเชิงปริมาณ PCR ต่อโพรโทคอเดียวกันกับ GAPDH เป็นยีนอ้างอิงตะวันตกกันบล็อทโปรตีนรวมไม่แยกจาก MMTV PyMT tumorderivedเซลล์หลังการรักษา 24 ชมกับเผชิญกันตัวแทนเป็นกว่าการใช้บัฟเฟอร์ lysis (20 มม.ทริสเรทติ้ง – HCl, 150 มม. NaCl, 1% ไตรตั้น-X, 0.5% NP-4050, NaF, Na3VO4, pyrophosphate โซเดียม 5 mM, 1 mM มม.0.2 mM PMSF, 1 x รติเอสเตอร์ค็อกเทล(Fisher) และ 1 x ฟอสฟาเตสเตอร์ค็อกเทล 2 (ซิกมา)Μg 30 โปรตีนถูกคั่น ด้วยเพ SDS (8% เจล),และโอนย้ายไปยังเมมเบรน Immobilon-P (มาก)หลังจากโอนย้าย บล็อกเข้า 5%ไม่แห้งนมใน 1% TBS ด้วย 0.1% Tween (TBS-T)สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้อง กันบล็อทได้ incubated ด้วยแอนติบอดีหลัก (MDR1, 1:1000 ในวัว 1%serum albumin ใน TBS-T เซลล์ตามปกติ ABCG21: 100 ใน 5% ไม่ใช่ไขมันนมแห้งใน TBS-T, Abcam) 2คืนที่ 4 ° C หรือβ-แอกติน (1:25000 บีเอสเอ 1% ใน TBS-Tซิกมา) สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีที่รอง(ป้องกันกระต่าย หนูป้องกัน หรือต่อต้านเมาส์ IgG-HRP, 1:1000) ได้ยกเว้นใน diluent เดียวเป็นหลักที่สอดคล้องกัน
การแปล กรุณารอสักครู่..
การเพาะเลี้ยงเซลล์
MMTV-PyMT; Apc + / + และ MMTV-PyMT; ApcMin / + เซลล์
ที่แยกได้ตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ [23] และได้รับการเติบโต
ใน RPMI 1640 สื่อเสริมด้วย 10% ของทารกในครรภ์วัว
ซีรั่ม, ยาปฏิชีวนะ 1% streptomycin / 1: 5000 plasmocin
(Invivogen, ซานดิเอโก) MDA-MB-157 โรคมะเร็งเต้านม
เซลล์ (ATCC ซาส, VA) ได้รับการเก็บรักษาไว้ใน RPMI
1640 สื่อเสริมด้วย 10% ของทารกในครรภ์ซีรั่มวัว 1
penicillin% / streptomycin, 25 มิลลิ HEPES และ 1: 5000
plasmocin เซลล์ทั้งหมดถูกใช้เป็นประจำ passaged 0.25%
trypsin EDTA / และเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 5% CO2.
MDA-MB-157 เซลล์ถูกยัดเยียดให้ lentiviral พึ่ง
shRNA ล้มลงของ APC ใช้สองภารกิจที่แตกต่างกัน
shRNA APC สร้าง (Sigma-Aldrich เซนต์ . หลุยส์, มิสซูรี่)
หลังจากพลังงานเซลล์ได้รับการดูแลในสื่อที่มี
. 1.5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร puromycin (Sigma-Aldrich)
ยารักษา
เซลล์ได้รับการรักษาเป็นเวลา 24 ชั่วโมงด้วยเคมีบำบัดในแต่ละ
ตัวแทนหรือการควบคุมตัวทำละลาย: doxorubicin (MP Biomedicals,
LLC, ซานตาอานา , CA) paclitaxel (Sigma-Aldrich) หรือ
cisplatin (CIS-Diammineplatinum (III) dichloride, SigmaAldrich).
ความเข้มข้นของยา MMTV-PyMTderived
เซลล์ 2.5 ไมครอน paclitaxel 16 ไมครอน cisplatin หรือ
doxorubicin 500 นาโนเมตร MDA-MB-157 เซลล์ได้รับการรักษา
ด้วยยา paclitaxel 0.078 ไมครอน, cisplatin 4 ไมครอนหรือ 12.5 นาโนเมตร
VanKlompenberg et al, BMC มะเร็ง (2015) 15: 457 หน้า 2 จาก 14
doxorubicin ปริมาณยาเสพติดเหล่านี้ได้รับการคัดเลือกหลังการรักษา
ของ MMTV-PyMT; Apc + / + เซลล์ 24-72 ชั่วโมง
แสดงให้เห็นว่าการลดลงประมาณ 50% ของประชากรในเซลล์
(ไม่ได้แสดงข้อมูล) สำหรับการรักษารวมกัน
ยับยั้งสารเคมีที่ถูกเพิ่มเข้าไปในสื่อ 18 ชั่วโมงหลังจากที่
ยาเคมีบำบัดที่มีผลในการรักษา 6 ชั่วโมง
ที่มีการรวมกันของ cisplatin หรือ doxorubicin และ
50 ไมครอน PP2 (ยับยั้ง Src, Sigma-Aldrich) หรือ 50 ไมครอน
SP600125 (JNK ยับยั้ง , Sigma-Aldrich) สำหรับการรวมตัว BrdU
การตรวจรักษาเป็นเช่นเดียวกับข้างต้น
ด้วยนอกเหนือจาก 5 โบรโม-2'-deoxyuridine (BrdU,
10 ไมครอน, BD Pharmigen แฟรงคลินเลคส์, นิวเจอร์ซีย์) 8 ชั่วโมงหลังจากที่
ยาเคมีบำบัด.
immunofluorescence
สำหรับการทดสอบทุกเซลล์ได้ เมล็ดใน 12 แผ่นเดียว
ใน coverslips แก้วเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนที่จะมีการรักษา สำหรับมือถือ
ผ่านการขยายการรวมตัว BrdU, apoptosis ผ่าน
ตัด caspase ที่ 3 และอิมมูโน APC เซลล์
ได้รับการแก้ไขในไฮด์ 3.7% เป็นเวลา 15 นาทีและจากนั้น
ใน permeabilized 0.3% Triton X-100 เป็นเวลา 15 นาที immunofluorescence
(IF) สำหรับ BrdU ได้ดำเนินการตาม
ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] แอนติบอดีทั้งหมดถูกเจือจางใน
การปิดกั้นการบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 0.2% ไม่มีไขมันนมแห้ง
2% โคเซรั่มอัลบูมิและ 0.3% Triton X-100
ฟอสเฟต Buffered Saline (พีบีเอส) เซลล์ที่ถูกบ่ม
กับแอนติบอดีหลัก: หนูต่อต้าน BrdU แอนติบอดี
(1: 300, Abcam เคมบริดจ์, แมสซาชูเซต), การป้องกันตัดเซ่
3 กระต่ายแอนติบอดี (1: 400, มือถือส่งสัญญาณ
เทคโนโลยีเดนเวอร์, MA) หรือต่อต้าน APC (1: 400, ของขวัญจาก
เค Neufeld, มหาวิทยาลัยแคนซัส). เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
หลังจากการล้างพีบีเอสในตัวอย่างถูกบ่มใน
แอนติบอดีรองที่เหมาะสม: rhodamine ผัน
แพะต่อต้านหนู (1: 100, เทอร์โม วิทยาศาสตร์ฟอร์ด,
IL) หรือแพะต่อต้านกระต่าย Alexa Fluor 488 (1: 1,000 ชีวิต
Technologies, Carlsbad, CA) F-โปรตีนได้รับการมองเห็นโดย
ร่วมกับการย้อมสี fluorescently ผัน phalloidin
(1: 200 เทคโนโลยีชีวิต) และภาพนิ่งที่ถูกติดตั้ง
ด้วย Fluoromount G กับ Hoescht เปอร์เซ็นต์ของ
เซลล์บวกถูกกำหนดสำหรับการทดสอบแต่ละอย่าง
น้อย 150 เซลล์ถูกนับต่อสภาพ ทดสอบแต่ละคน
ได้รับการทำงานในเพิ่มขึ้นสามเท่าและทำซ้ำสามครั้ง.
แยกอาร์เอ็นเอและ RT-PCR
MMTV-PyMT; Apc + / + และ MMTV-PyMT; ApcMin / + เซลล์
เมล็ดที่ 2.4 x105 เซลล์ / ดีใน 6 แผ่นเดียวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง
รับการรักษาแล้ว กับยาเสพติดดังกล่าวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง อาร์เอ็นเอที่ถูก
แยกออกโดยใช้สารไตร (โมเลกุลศูนย์วิจัย
Cincinnati, OH) และยีนสังเคราะห์ได้ดำเนินการกับ
iScript ตั้งแต่วันที่ 1 ไมโครกรัมอาร์เอ็นเอ (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad ดาว,
CA) Real-time RT-PCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้พลังงาน SYBR
ผสมต้นแบบสีเขียว (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย)
50 นาโนกรัมของยีนและ 7.5 ไมครอนของแต่ละไพรเมอร์ (ไพรเมอร์
ลำดับที่ถูกนำเสนอในตารางที่ 1) ขยาย
โปรแกรมรวมถึงขั้นตอนที่ 2 เริ่มต้นที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีและ
95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีตามด้วย 40 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 15 วินาที
และ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีตามด้วยรุ่นของเส้นโค้งละลาย
(CFX เชื่อมต่อ 96 Cycler ร้อน Bio-Rad) ตัวอย่าง
ทำงานในที่ซ้ำกันและ 18 s rRNA ถูกนำมาใช้เป็นข้อมูลอ้างอิง
สำหรับการศึกษายีนเมาส์ทั้งหมด การวิเคราะห์ Microarray ใน MDR1
และ ABCG2 ถูกอธิบายไว้ก่อนหน้า [11] ล้มลง
ของ APC ในภาคตะวันออกเฉียงเหนือ-MB-157 เซลล์ถูกตรวจสอบผ่านทาง
เชิงปริมาณเวลาจริง PCR ต่อไปนี้โปรโตคอลเดียวกัน
กับ GAPDH เป็นยีนอ้างอิง.
blots ตะวันตก
โปรตีนรวมที่แยกได้จาก MMTV-PyMT tumorderived
เซลล์ 24 ชั่วโมงหลังจากการรักษาด้วยเคมีบำบัดเดียวกัน
ตัวแทนดังกล่าวโดยใช้บัฟเฟอร์สลาย (20 มิลลิ
Tris-HCl 150 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 1% Triton-X, 0.5% NP-40,
50, มิลลิ NaF 1 มิลลิ Na3VO4 5 มิลลิ pyrophosphate โซเดียม
0.2 มิลลิ PMSF ยับยั้งเอนไซม์โปรติเอ 1x ค๊อกเทล
(ฟิชเชอร์) และยับยั้ง phosphatase 1x ค๊อกเทล 2 (ซิกม่า).
30 ไมโครกรัมของโปรตีนที่ถูกแยกออกจากระบบ SDS-PAGE (8% เจล)
และโอนไปยังเมมเบรน Immobilon-P (ค).
หลังจากโอนเยื่อถูกบล็อกใน 5%
นมไม่มีไขมันแห้งใน 1% TBS กับ 0.1% Tween (TBS-T)
เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง Blots ถูกบ่มด้วย.
แอนติบอดีหลัก (MDR1 1: 1000 1% วัว
อัลบูมิซีรั่มใน TBS-T, โทรศัพท์มือ สัญญาณหรือ ABCG2,
1: 100 ใน 5% นมไม่มีไขมันแห้งใน TBS-T, Abcam) สำหรับ 2
คืนที่ 4 องศาเซลเซียสหรือβ-โปรตีน (1: 25000, 1% บีเอสเอใน TBS-T,
Sigma) สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีรอง
(ป้องกันกระต่ายป้องกันหนูหรือต่อต้านเมาส์ IgG-HRP 1: 1000) ได้รับการ
เจือจางในเจือจางเช่นเดียวกับหลักที่สอดคล้องกัน
MMTV-PyMT; Apc + / + และ MMTV-PyMT; ApcMin / + เซลล์
ที่แยกได้ตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ [23] และได้รับการเติบโต
ใน RPMI 1640 สื่อเสริมด้วย 10% ของทารกในครรภ์วัว
ซีรั่ม, ยาปฏิชีวนะ 1% streptomycin / 1: 5000 plasmocin
(Invivogen, ซานดิเอโก) MDA-MB-157 โรคมะเร็งเต้านม
เซลล์ (ATCC ซาส, VA) ได้รับการเก็บรักษาไว้ใน RPMI
1640 สื่อเสริมด้วย 10% ของทารกในครรภ์ซีรั่มวัว 1
penicillin% / streptomycin, 25 มิลลิ HEPES และ 1: 5000
plasmocin เซลล์ทั้งหมดถูกใช้เป็นประจำ passaged 0.25%
trypsin EDTA / และเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 5% CO2.
MDA-MB-157 เซลล์ถูกยัดเยียดให้ lentiviral พึ่ง
shRNA ล้มลงของ APC ใช้สองภารกิจที่แตกต่างกัน
shRNA APC สร้าง (Sigma-Aldrich เซนต์ . หลุยส์, มิสซูรี่)
หลังจากพลังงานเซลล์ได้รับการดูแลในสื่อที่มี
. 1.5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร puromycin (Sigma-Aldrich)
ยารักษา
เซลล์ได้รับการรักษาเป็นเวลา 24 ชั่วโมงด้วยเคมีบำบัดในแต่ละ
ตัวแทนหรือการควบคุมตัวทำละลาย: doxorubicin (MP Biomedicals,
LLC, ซานตาอานา , CA) paclitaxel (Sigma-Aldrich) หรือ
cisplatin (CIS-Diammineplatinum (III) dichloride, SigmaAldrich).
ความเข้มข้นของยา MMTV-PyMTderived
เซลล์ 2.5 ไมครอน paclitaxel 16 ไมครอน cisplatin หรือ
doxorubicin 500 นาโนเมตร MDA-MB-157 เซลล์ได้รับการรักษา
ด้วยยา paclitaxel 0.078 ไมครอน, cisplatin 4 ไมครอนหรือ 12.5 นาโนเมตร
VanKlompenberg et al, BMC มะเร็ง (2015) 15: 457 หน้า 2 จาก 14
doxorubicin ปริมาณยาเสพติดเหล่านี้ได้รับการคัดเลือกหลังการรักษา
ของ MMTV-PyMT; Apc + / + เซลล์ 24-72 ชั่วโมง
แสดงให้เห็นว่าการลดลงประมาณ 50% ของประชากรในเซลล์
(ไม่ได้แสดงข้อมูล) สำหรับการรักษารวมกัน
ยับยั้งสารเคมีที่ถูกเพิ่มเข้าไปในสื่อ 18 ชั่วโมงหลังจากที่
ยาเคมีบำบัดที่มีผลในการรักษา 6 ชั่วโมง
ที่มีการรวมกันของ cisplatin หรือ doxorubicin และ
50 ไมครอน PP2 (ยับยั้ง Src, Sigma-Aldrich) หรือ 50 ไมครอน
SP600125 (JNK ยับยั้ง , Sigma-Aldrich) สำหรับการรวมตัว BrdU
การตรวจรักษาเป็นเช่นเดียวกับข้างต้น
ด้วยนอกเหนือจาก 5 โบรโม-2'-deoxyuridine (BrdU,
10 ไมครอน, BD Pharmigen แฟรงคลินเลคส์, นิวเจอร์ซีย์) 8 ชั่วโมงหลังจากที่
ยาเคมีบำบัด.
immunofluorescence
สำหรับการทดสอบทุกเซลล์ได้ เมล็ดใน 12 แผ่นเดียว
ใน coverslips แก้วเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนที่จะมีการรักษา สำหรับมือถือ
ผ่านการขยายการรวมตัว BrdU, apoptosis ผ่าน
ตัด caspase ที่ 3 และอิมมูโน APC เซลล์
ได้รับการแก้ไขในไฮด์ 3.7% เป็นเวลา 15 นาทีและจากนั้น
ใน permeabilized 0.3% Triton X-100 เป็นเวลา 15 นาที immunofluorescence
(IF) สำหรับ BrdU ได้ดำเนินการตาม
ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [23] แอนติบอดีทั้งหมดถูกเจือจางใน
การปิดกั้นการบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 0.2% ไม่มีไขมันนมแห้ง
2% โคเซรั่มอัลบูมิและ 0.3% Triton X-100
ฟอสเฟต Buffered Saline (พีบีเอส) เซลล์ที่ถูกบ่ม
กับแอนติบอดีหลัก: หนูต่อต้าน BrdU แอนติบอดี
(1: 300, Abcam เคมบริดจ์, แมสซาชูเซต), การป้องกันตัดเซ่
3 กระต่ายแอนติบอดี (1: 400, มือถือส่งสัญญาณ
เทคโนโลยีเดนเวอร์, MA) หรือต่อต้าน APC (1: 400, ของขวัญจาก
เค Neufeld, มหาวิทยาลัยแคนซัส). เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
หลังจากการล้างพีบีเอสในตัวอย่างถูกบ่มใน
แอนติบอดีรองที่เหมาะสม: rhodamine ผัน
แพะต่อต้านหนู (1: 100, เทอร์โม วิทยาศาสตร์ฟอร์ด,
IL) หรือแพะต่อต้านกระต่าย Alexa Fluor 488 (1: 1,000 ชีวิต
Technologies, Carlsbad, CA) F-โปรตีนได้รับการมองเห็นโดย
ร่วมกับการย้อมสี fluorescently ผัน phalloidin
(1: 200 เทคโนโลยีชีวิต) และภาพนิ่งที่ถูกติดตั้ง
ด้วย Fluoromount G กับ Hoescht เปอร์เซ็นต์ของ
เซลล์บวกถูกกำหนดสำหรับการทดสอบแต่ละอย่าง
น้อย 150 เซลล์ถูกนับต่อสภาพ ทดสอบแต่ละคน
ได้รับการทำงานในเพิ่มขึ้นสามเท่าและทำซ้ำสามครั้ง.
แยกอาร์เอ็นเอและ RT-PCR
MMTV-PyMT; Apc + / + และ MMTV-PyMT; ApcMin / + เซลล์
เมล็ดที่ 2.4 x105 เซลล์ / ดีใน 6 แผ่นเดียวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง
รับการรักษาแล้ว กับยาเสพติดดังกล่าวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง อาร์เอ็นเอที่ถูก
แยกออกโดยใช้สารไตร (โมเลกุลศูนย์วิจัย
Cincinnati, OH) และยีนสังเคราะห์ได้ดำเนินการกับ
iScript ตั้งแต่วันที่ 1 ไมโครกรัมอาร์เอ็นเอ (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad ดาว,
CA) Real-time RT-PCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้พลังงาน SYBR
ผสมต้นแบบสีเขียว (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย)
50 นาโนกรัมของยีนและ 7.5 ไมครอนของแต่ละไพรเมอร์ (ไพรเมอร์
ลำดับที่ถูกนำเสนอในตารางที่ 1) ขยาย
โปรแกรมรวมถึงขั้นตอนที่ 2 เริ่มต้นที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีและ
95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีตามด้วย 40 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 15 วินาที
และ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีตามด้วยรุ่นของเส้นโค้งละลาย
(CFX เชื่อมต่อ 96 Cycler ร้อน Bio-Rad) ตัวอย่าง
ทำงานในที่ซ้ำกันและ 18 s rRNA ถูกนำมาใช้เป็นข้อมูลอ้างอิง
สำหรับการศึกษายีนเมาส์ทั้งหมด การวิเคราะห์ Microarray ใน MDR1
และ ABCG2 ถูกอธิบายไว้ก่อนหน้า [11] ล้มลง
ของ APC ในภาคตะวันออกเฉียงเหนือ-MB-157 เซลล์ถูกตรวจสอบผ่านทาง
เชิงปริมาณเวลาจริง PCR ต่อไปนี้โปรโตคอลเดียวกัน
กับ GAPDH เป็นยีนอ้างอิง.
blots ตะวันตก
โปรตีนรวมที่แยกได้จาก MMTV-PyMT tumorderived
เซลล์ 24 ชั่วโมงหลังจากการรักษาด้วยเคมีบำบัดเดียวกัน
ตัวแทนดังกล่าวโดยใช้บัฟเฟอร์สลาย (20 มิลลิ
Tris-HCl 150 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 1% Triton-X, 0.5% NP-40,
50, มิลลิ NaF 1 มิลลิ Na3VO4 5 มิลลิ pyrophosphate โซเดียม
0.2 มิลลิ PMSF ยับยั้งเอนไซม์โปรติเอ 1x ค๊อกเทล
(ฟิชเชอร์) และยับยั้ง phosphatase 1x ค๊อกเทล 2 (ซิกม่า).
30 ไมโครกรัมของโปรตีนที่ถูกแยกออกจากระบบ SDS-PAGE (8% เจล)
และโอนไปยังเมมเบรน Immobilon-P (ค).
หลังจากโอนเยื่อถูกบล็อกใน 5%
นมไม่มีไขมันแห้งใน 1% TBS กับ 0.1% Tween (TBS-T)
เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง Blots ถูกบ่มด้วย.
แอนติบอดีหลัก (MDR1 1: 1000 1% วัว
อัลบูมิซีรั่มใน TBS-T, โทรศัพท์มือ สัญญาณหรือ ABCG2,
1: 100 ใน 5% นมไม่มีไขมันแห้งใน TBS-T, Abcam) สำหรับ 2
คืนที่ 4 องศาเซลเซียสหรือβ-โปรตีน (1: 25000, 1% บีเอสเอใน TBS-T,
Sigma) สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีรอง
(ป้องกันกระต่ายป้องกันหนูหรือต่อต้านเมาส์ IgG-HRP 1: 1000) ได้รับการ
เจือจางในเจือจางเช่นเดียวกับหลักที่สอดคล้องกัน
การแปล กรุณารอสักครู่..
pymt mmtv วัฒนธรรม
เซลล์ ; APC / และ mmtv pymt ; apcmin / เซลล์ที่แยกได้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
[ 23 ] และปลูกใน RPMI 1640
สื่อเสริม 10% ซีรั่มโค
ทารกในครรภ์ , 1% และ streptomycin เพนนิซิลลิน / 1:5000 plasmocin
( invivogen , San Diego , CA ) mda-mb-157 มะเร็งเต้านม
เซลล์ ( ATCC Manassas , VA , RPMI 1640 ) ถูกเก็บรักษาไว้ใน
สื่อเสริม 10% fetal bovine serum 1
,เพนนิซิลลิน / จัง % 25 มม. และฮีเปส 1:5000
plasmocin . เซลล์ทั้งหมดถูกตรวจ passaged ใช้ 0.25 %
ทริป / EDTA และรักษาอุณหภูมิ 37 องศา C คาร์บอนไดออกไซด์ 5%
mda-mb-157 เซลล์ถูก lentiviral )
shrna น็อคของ APC โดยใช้ที่แตกต่างกันสองภารกิจ
shrna APC โครงสร้าง ( ซิกม่า Aldrich เซนต์หลุยส์ โม ) .
หลังจากผ่านเซลล์ถูกเก็บรักษาไว้ในสื่อที่มี
15 μ g / ml puromycin ( ซิกม่า Aldrich )
เซลล์ยา ได้รับการรักษาเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่มีตัวแทนแต่ละชนิด
หรือควบคุมตัวทำละลาย : ด๊อกโซรูบิซิน ( MP biomedicals
, LLC , ซานตาอานา , แคลิฟอร์เนีย ) , ยุโรป ( ซิกม่า Aldrich ) หรือ
ซิสพลาติน ( CIS diammineplatinum ไดคลอไรด์ ( III ) ,
sigmaaldrich ) ยาสำหรับ mmtv pymtderived
เซลล์มีความเข้มข้น 2.5 μ M เป็น 16 μ M เคมีบำบัดหรือ
500 nm doxorubicin .mda-mb-157 เซลล์จะถูก
กับ 0.078 μ M เป็น 4 M , μเคมีบำบัดหรือ 12.5 nm
vanklompenberg et al . มะเร็ง BMC ( 2015 ) 15:457 หน้า 2 จาก 14
doxorubicin . ซึ่งยาเหล่านี้ถูกเลือกหลังจากการรักษา
ของ mmtv pymt ; APC / เซลล์จาก 24 - 72 H
พบประมาณลด 50% ในเซลล์ประชากร
( ข้อมูลไม่แสดง ) สำหรับการรักษา
เคมียา ที่ถูกสื่อ 18 ชั่วโมงหลังจากเจ้าหน้าที่
อาจเป็นผลใน 6 ชั่วโมง การรักษาด้วยเคมีบำบัดหรือการรวมกันของ
50 doxorubicin μและ M pp2 ( SRC ซึ่งซิกม่า Aldrich ) หรือ 50 μ M
sp600125 ( jnk ซึ่งซิกม่า Aldrich ) สำหรับ brdu ประสาน
) , การรักษาก็เหมือนข้างบน
ด้วยนอกเหนือจาก 5-bromo-2 ' - deoxyuridine ( brdu
10 , μ pharmigen BD , MFranklin Lakes , NJ ) 8 H หลัง
D
อาจตัวแทน สำหรับการทดลองในเซลล์ถูก seeded ดีจาน
บน coverslips แก้ว 24 ชั่วโมงก่อนการรักษา สำหรับการแพร่กระจายผ่านทาง brdu ประสานเซลล์
( ผ่านของแคสเปส 3 และ APC D , เซลล์
ถูกกำหนดใน 3.7% ฟอร์มาลดีไฮด์ 15 นาทีแล้ว
permeabilized ใน 0.3 % Triton X-100 เป็นเวลา 15 นาทีD
( ถ้า ) มีการปฏิบัติตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า brdu
[ 23 ] ทั้งหมดลดการปิดกั้นแอนติบอดีใน
บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยไขมัน 0.2 % ไม่แห้งนม
2 % อัลบูมินและ 0.3% Triton X-100 ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (
( PBS ) เซลล์ที่ถูกบ่ม
กับแอนติบอดีประถมศึกษา : ป้องกัน brdu หนูโมโนโคลนอลแอนติบอดี
( 1:300 ABCAM , Cambridge , MA ) ต่อต้านของแคสเปส
3 กระต่ายโมโนโคลนอลแอนติบอดี ( 1 : 400 เซลล์ส่งสัญญาณ
เทคโนโลยี , เดนเวอร์ , MA ) หรือป้องกัน APC ( 1 : 400 , ของขวัญจาก
K . นูเฟลด์ , มหาวิทยาลัยแคนซัส ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 องศา C .
ต่อไปนี้ล้างใน PBS กลุ่มตัวอย่างที่เหมาะสม ( มัธยม )
:
แพะจากผลิตภัณฑ์ป้องกันหนู ( 100 เทอร์โมวิทยาศาสตร์ , Rockford IL )
, หรือแพะป้องกันกระต่าย Alexa Fluor 488 ( 000 , ชีวิต
เทคโนโลยีคาร์ลสแบดแคลิฟอร์เนีย ) f-actin ถูกมองเห็นโดย
Co ย้อมด้วย fluorescently conjugated phalloidin
( ชีวิต 1:200 เทคโนโลยี ) และสไลด์ติด
กับ fluoromount กรัม hoescht . เปอร์เซ็นต์ของ
เซลล์บวกถูกกำหนดสำหรับแต่ละการทดสอบด้วย
อย่างน้อย 150 เซลล์ถูกนับต่อเงื่อนไข แต่ละวิธี
ใช้ทั้งสามใบซ้ำ 3 ครั้ง และแยก RNA นี้
mmtv pymt ; APC / และ mmtv pymt ;apcmin / เซลล์
ถูก seeded ที่ 2.4 x105 เซลล์ / ดีใน 6 ดีแผ่น 24 H
แล้วได้รับการรักษาด้วยยาดังกล่าว เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ซึ่งมีการใช้แยกไทร
( โมเลกุลศูนย์วิจัย
ซินซินนาติ โอ ) และการสังเคราะห์ cDNA ได้ด้วย
iscript จาก 1 μ G RNA ( ไบโอ ราด ห้องปฏิบัติการ เฮอร์คิวลิส
CA ) เวลาจริงนี้ได้โดยใช้พลังงานสีเขียว SYBR
Master Mix ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้แคลิฟอร์เนีย ) ,
50 ของ cDNA และ 7.5 μ M ของแต่ละสี ( สีรองพื้น
ลำดับแสดงในตารางที่ 1 ) โปรแกรมขยาย
รวม 2 ขั้นตอนแรกที่ 50 องศา C เป็นเวลา 2 นาที 95 องศา C
10 นาทีตามด้วย 40 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 ° C
1 นาทีตามด้วยรุ่นของละลายโค้ง
( cfx เชื่อมต่อ 96 ความร้อนวงจรชีวภาพราด ) จำนวน
วิ่งซ้ำและ 18 s rRNA เป็นใช้เป็นข้อมูลอ้างอิง
ยีนเพื่อการศึกษาเมาส์ทั้งหมด การวิเคราะห์ microarray mdr1
abcg2 ก่อนหน้านี้และอธิบาย [ 11 ] การน็อค
ของ APC ในเซลล์ mda-mb-157 ยืนยันผ่าน
Real Time PCR ปริมาณต่อไปนี้เหมือนกันกับ gapdh เป็นอ้างอิงโปรโตคอล
ยีน blots ตะวันตกรวมโปรตีนที่แยกได้จาก mmtv pymt tumorderived
เซลล์หลังจาก 24 ชั่วโมงการรักษาด้วย
ชนิดเดียวกันตัวแทนดังกล่าว โดยใช้การสลายบัฟเฟอร์ ( 20 mm
ทริส– HCL 150 mM NaCl 0.5% , 1% triton-x np-40
, , 50 มม. นัฟ 1 มม. na3vo4 5 มิลลิเมตรโซเดียมไพโร
, 0.2 มม. PMSF , 1x โปรตีเ นฮิบิเตอร์ค็อกเทล
( ฟิชเชอร์ ) และ 1x ฟอสฟาเตสยับยั้งค็อกเทล 2 ( Sigma )
30 กรัมของโปรตีนμแยกกันโดย SDS-PAGE ( 8% Gel ) และโอนไปยังเยื่อ ( immobilon-p
หลังจากโอนมิลลิ )เยื่อที่ถูกบล็อกใน 5 %
ปลอดไขมันนมแห้ง 1% TBS กับ 0.1% Tween ( tbs-t )
1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ไม้ถูกบ่มกับแอนติบอดีหลัก ( mdr1
,
000 1% และอัลบูมินใน tbs-t เซลล์สัญญาณ หรือ abcg2
1 : 100 , 5 % ปลอดไขมันนมแห้งใน tbs-t ABCAM , ) 2
คืนที่ 4 องศา C หรือบีตา - actin ( 1:25000 1 % BSA ใน tbs-t
, Sigma ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องมัธยมศึกษา )
( anti anti anti เมาส์หนูหรือกระต่าย ช IgG , 000 ) คือ
เจือจางในเจือจางเหมือนที่หลัก
เซลล์ ; APC / และ mmtv pymt ; apcmin / เซลล์ที่แยกได้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
[ 23 ] และปลูกใน RPMI 1640
สื่อเสริม 10% ซีรั่มโค
ทารกในครรภ์ , 1% และ streptomycin เพนนิซิลลิน / 1:5000 plasmocin
( invivogen , San Diego , CA ) mda-mb-157 มะเร็งเต้านม
เซลล์ ( ATCC Manassas , VA , RPMI 1640 ) ถูกเก็บรักษาไว้ใน
สื่อเสริม 10% fetal bovine serum 1
,เพนนิซิลลิน / จัง % 25 มม. และฮีเปส 1:5000
plasmocin . เซลล์ทั้งหมดถูกตรวจ passaged ใช้ 0.25 %
ทริป / EDTA และรักษาอุณหภูมิ 37 องศา C คาร์บอนไดออกไซด์ 5%
mda-mb-157 เซลล์ถูก lentiviral )
shrna น็อคของ APC โดยใช้ที่แตกต่างกันสองภารกิจ
shrna APC โครงสร้าง ( ซิกม่า Aldrich เซนต์หลุยส์ โม ) .
หลังจากผ่านเซลล์ถูกเก็บรักษาไว้ในสื่อที่มี
15 μ g / ml puromycin ( ซิกม่า Aldrich )
เซลล์ยา ได้รับการรักษาเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่มีตัวแทนแต่ละชนิด
หรือควบคุมตัวทำละลาย : ด๊อกโซรูบิซิน ( MP biomedicals
, LLC , ซานตาอานา , แคลิฟอร์เนีย ) , ยุโรป ( ซิกม่า Aldrich ) หรือ
ซิสพลาติน ( CIS diammineplatinum ไดคลอไรด์ ( III ) ,
sigmaaldrich ) ยาสำหรับ mmtv pymtderived
เซลล์มีความเข้มข้น 2.5 μ M เป็น 16 μ M เคมีบำบัดหรือ
500 nm doxorubicin .mda-mb-157 เซลล์จะถูก
กับ 0.078 μ M เป็น 4 M , μเคมีบำบัดหรือ 12.5 nm
vanklompenberg et al . มะเร็ง BMC ( 2015 ) 15:457 หน้า 2 จาก 14
doxorubicin . ซึ่งยาเหล่านี้ถูกเลือกหลังจากการรักษา
ของ mmtv pymt ; APC / เซลล์จาก 24 - 72 H
พบประมาณลด 50% ในเซลล์ประชากร
( ข้อมูลไม่แสดง ) สำหรับการรักษา
เคมียา ที่ถูกสื่อ 18 ชั่วโมงหลังจากเจ้าหน้าที่
อาจเป็นผลใน 6 ชั่วโมง การรักษาด้วยเคมีบำบัดหรือการรวมกันของ
50 doxorubicin μและ M pp2 ( SRC ซึ่งซิกม่า Aldrich ) หรือ 50 μ M
sp600125 ( jnk ซึ่งซิกม่า Aldrich ) สำหรับ brdu ประสาน
) , การรักษาก็เหมือนข้างบน
ด้วยนอกเหนือจาก 5-bromo-2 ' - deoxyuridine ( brdu
10 , μ pharmigen BD , MFranklin Lakes , NJ ) 8 H หลัง
D
อาจตัวแทน สำหรับการทดลองในเซลล์ถูก seeded ดีจาน
บน coverslips แก้ว 24 ชั่วโมงก่อนการรักษา สำหรับการแพร่กระจายผ่านทาง brdu ประสานเซลล์
( ผ่านของแคสเปส 3 และ APC D , เซลล์
ถูกกำหนดใน 3.7% ฟอร์มาลดีไฮด์ 15 นาทีแล้ว
permeabilized ใน 0.3 % Triton X-100 เป็นเวลา 15 นาทีD
( ถ้า ) มีการปฏิบัติตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า brdu
[ 23 ] ทั้งหมดลดการปิดกั้นแอนติบอดีใน
บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยไขมัน 0.2 % ไม่แห้งนม
2 % อัลบูมินและ 0.3% Triton X-100 ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (
( PBS ) เซลล์ที่ถูกบ่ม
กับแอนติบอดีประถมศึกษา : ป้องกัน brdu หนูโมโนโคลนอลแอนติบอดี
( 1:300 ABCAM , Cambridge , MA ) ต่อต้านของแคสเปส
3 กระต่ายโมโนโคลนอลแอนติบอดี ( 1 : 400 เซลล์ส่งสัญญาณ
เทคโนโลยี , เดนเวอร์ , MA ) หรือป้องกัน APC ( 1 : 400 , ของขวัญจาก
K . นูเฟลด์ , มหาวิทยาลัยแคนซัส ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 องศา C .
ต่อไปนี้ล้างใน PBS กลุ่มตัวอย่างที่เหมาะสม ( มัธยม )
:
แพะจากผลิตภัณฑ์ป้องกันหนู ( 100 เทอร์โมวิทยาศาสตร์ , Rockford IL )
, หรือแพะป้องกันกระต่าย Alexa Fluor 488 ( 000 , ชีวิต
เทคโนโลยีคาร์ลสแบดแคลิฟอร์เนีย ) f-actin ถูกมองเห็นโดย
Co ย้อมด้วย fluorescently conjugated phalloidin
( ชีวิต 1:200 เทคโนโลยี ) และสไลด์ติด
กับ fluoromount กรัม hoescht . เปอร์เซ็นต์ของ
เซลล์บวกถูกกำหนดสำหรับแต่ละการทดสอบด้วย
อย่างน้อย 150 เซลล์ถูกนับต่อเงื่อนไข แต่ละวิธี
ใช้ทั้งสามใบซ้ำ 3 ครั้ง และแยก RNA นี้
mmtv pymt ; APC / และ mmtv pymt ;apcmin / เซลล์
ถูก seeded ที่ 2.4 x105 เซลล์ / ดีใน 6 ดีแผ่น 24 H
แล้วได้รับการรักษาด้วยยาดังกล่าว เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ซึ่งมีการใช้แยกไทร
( โมเลกุลศูนย์วิจัย
ซินซินนาติ โอ ) และการสังเคราะห์ cDNA ได้ด้วย
iscript จาก 1 μ G RNA ( ไบโอ ราด ห้องปฏิบัติการ เฮอร์คิวลิส
CA ) เวลาจริงนี้ได้โดยใช้พลังงานสีเขียว SYBR
Master Mix ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้แคลิฟอร์เนีย ) ,
50 ของ cDNA และ 7.5 μ M ของแต่ละสี ( สีรองพื้น
ลำดับแสดงในตารางที่ 1 ) โปรแกรมขยาย
รวม 2 ขั้นตอนแรกที่ 50 องศา C เป็นเวลา 2 นาที 95 องศา C
10 นาทีตามด้วย 40 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 15 วินาทีและ 60 ° C
1 นาทีตามด้วยรุ่นของละลายโค้ง
( cfx เชื่อมต่อ 96 ความร้อนวงจรชีวภาพราด ) จำนวน
วิ่งซ้ำและ 18 s rRNA เป็นใช้เป็นข้อมูลอ้างอิง
ยีนเพื่อการศึกษาเมาส์ทั้งหมด การวิเคราะห์ microarray mdr1
abcg2 ก่อนหน้านี้และอธิบาย [ 11 ] การน็อค
ของ APC ในเซลล์ mda-mb-157 ยืนยันผ่าน
Real Time PCR ปริมาณต่อไปนี้เหมือนกันกับ gapdh เป็นอ้างอิงโปรโตคอล
ยีน blots ตะวันตกรวมโปรตีนที่แยกได้จาก mmtv pymt tumorderived
เซลล์หลังจาก 24 ชั่วโมงการรักษาด้วย
ชนิดเดียวกันตัวแทนดังกล่าว โดยใช้การสลายบัฟเฟอร์ ( 20 mm
ทริส– HCL 150 mM NaCl 0.5% , 1% triton-x np-40
, , 50 มม. นัฟ 1 มม. na3vo4 5 มิลลิเมตรโซเดียมไพโร
, 0.2 มม. PMSF , 1x โปรตีเ นฮิบิเตอร์ค็อกเทล
( ฟิชเชอร์ ) และ 1x ฟอสฟาเตสยับยั้งค็อกเทล 2 ( Sigma )
30 กรัมของโปรตีนμแยกกันโดย SDS-PAGE ( 8% Gel ) และโอนไปยังเยื่อ ( immobilon-p
หลังจากโอนมิลลิ )เยื่อที่ถูกบล็อกใน 5 %
ปลอดไขมันนมแห้ง 1% TBS กับ 0.1% Tween ( tbs-t )
1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ไม้ถูกบ่มกับแอนติบอดีหลัก ( mdr1
,
000 1% และอัลบูมินใน tbs-t เซลล์สัญญาณ หรือ abcg2
1 : 100 , 5 % ปลอดไขมันนมแห้งใน tbs-t ABCAM , ) 2
คืนที่ 4 องศา C หรือบีตา - actin ( 1:25000 1 % BSA ใน tbs-t
, Sigma ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องมัธยมศึกษา )
( anti anti anti เมาส์หนูหรือกระต่าย ช IgG , 000 ) คือ
เจือจางในเจือจางเหมือนที่หลัก
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- attached to anyone
- ฉันมีผมตรงยาว
- simple teaser for attraction call agents
- 细胞因子
- ทานข้าวยัง
- best solvent to methanol volumetric rati
- คนโสด
- สำเนาบัตรประชาชนน.ส.สุพรรณี แซ่เล้า
- คนรักสุขภาพ
- ไปหาอะไรกินสิ
- เรารักและพร้อมจะเรียนรู้ในความต่างของเรา
- Credit Issue
- The use of edible ®lms and coatings to e
- คัดแยกและตัด งานเสีย
- คุณธรรม (Moral / Virtue) “คุณธรรม” คือ ค
- ผมไปที่ประเทศไทยมา
- i mean what subject?
- เคยกินข้าวขาหมู
- คุณธรรม (Moral / Virtue) “คุณธรรม” คือ ค
- วันที่12
- อาการเที่ยง จะกินอะไร?
- OJALA LE QUITEN LOS NIÑOS!! ES UN MONSTR
- ฉันจะไม่เป็นตัวเลือกของใคร
- I have not data about Projects page For
