HEK-293 cells stably expressing TRP

HEK-293 cells stably expressing TRPM8 were grown to 70–80% confluence, washed and collected with cold PBS. Cells were harvested and resuspended in 0.25 M sucrose-1 mM triethanolamine (TEA) HCl, with addition of a protease inhibitor cocktail (Roche, Indianapolis, IN), pH 7.4. Plasma membranes were isolated by differential centrifugation. The TRPM8 protein was extracted from plasma membranes with (in mM) 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 Glucose and 10 Hepes, pH 7.4, in presence of 1% Nonidet P40 (Roche) and 0.5% dodecylmaltoside (DDM) (Roche), and the protease inhibitors, upon incubation at 4°C on a shaker with gentle agitation for 2 h.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

HEK 293 เซลล์แสดง TRPM8 stably ถูกโต 70-80% บรรจบ ล้าง และเก็บรวบรวม ด้วย PBS เย็น เซลล์เก็บเกี่ยว และ triethanolamine ซูโครส 1 mM 0.25 M resuspended (ชา) HCl บวกผลรติเอสค็อกเทล (Roche อินเดียนา IN), pH 7.4 เยื่อหุ้มพลาสมาถูกแยกต่างหาก โดย centrifugation แตกต่าง โปรตีน TRPM8 ถูกสกัดจากพลาสม่าเข้าด้วย (ใน mM) 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2 กลูโคส 10 และ 10 Hepes, pH 7.4 สถานะ% 1 Nonidet P40 (Roche) และ 0.5% dodecylmaltoside (DDM) (Roche), และ inhibitors ที่รติเอส เมื่อบ่มที่ 4° C ในเชคเกอร์ด้วยอาการกังวลต่ออ่อนโยนสำหรับ 2 h

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เซลล์ HEK-293 เสถียรแสดง TRPM8 ปลูกไปบรรจบ 70-80% ล้างและเก็บรวบรวมพีบีเอสที่มีอากาศหนาวเย็น เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวและ resuspended ในซูโครส 0.25 M-1 มิลลิ triethanolamine (TEA) HCl ด้วยนอกเหนือจากน้ำย่อยยับยั้งค๊อกเทล (Roche, อินเดียแนโพลิ), พีเอช 7.4 เยื่อหุ้มพลาสม่าที่แยกได้โดยการหมุนเหวี่ยงที่แตกต่างกัน โปรตีน TRPM8 ถูกสกัดจากเยื่อพลาสมาพร้อม (ในมิลลิ) 137 NaCl 5 KCl 1 MgCl2 10 กลูโคสและ 10 HEPES ค่า pH 7.4 ในการปรากฏตัว 1% Nonidet P40 (Roche) และ 0.5% dodecylmaltoside (DDM) (Roche ) และน้ำย่อยเมื่อมีการบ่มที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสในเครื่องปั่นที่มีการกวนอ่อนโยนสำหรับ 2 ชั่วโมง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

hek-293 เซลล์เสถียรแสดง trpm8 ปลูก 70 – 80 % บรรจบ ล้าง และเก็บกับช่องเย็น เซลล์เก็บ resuspended ใน 0.25 m sucrose-1 มม. ไตรชา ) HCL กับเพิ่มของตัวยับยั้งโปรเทล ( โรเช่ , Indianapolis , IN ) ที่ pH 7.4 . พลาสมาเมมเบรนแยกความแตกต่างโดยการปั่นเหวี่ยงการ trpm8 โปรตีนสกัดจากพลาสมาเมมเบรน ( มิลลิเมตร ) 137 NaCl KCl 1 ชุด 5 , 10 และ 10 ฮีเปสกลูโคส pH 7.4 , ในการแสดงตนของ 1% nonidet ดำ ( โรช ) และ 0.5% dodecylmaltoside ( DDM ) ( ยา ) , และ protease inhibitors เมื่อบ่มที่ 4 ° C ใน เครื่องปั่นกับอ่อนโยนมาก

2 h