Materials and Methods2.1. Plasmid c

Materials and Methods
2.1. Plasmid construction and microbial strains.
E. coli DH5α strain (Sambrook and Rusell, 2001) was used for the construction of the
E.coli-yeast shuttle vector. The vpr gene sequence from the NL4-3 clone of HIV-1
(Adachi et al., 1986) was cloned into the SmaI and BamHI sites of pEMBLyex, a high
copy number yeast expression vector carrying a galactose inducible and glucose
repressible promoter (Cesareni and Murray, 1987). Exogenous gene expression is
controlled by the CYCGAL1 promoter, which is tightly repressed by glucose and
strongly induced by galactose. Two clones of S. cerevisiae W303-1B strain (Thomas
and Rothstein, 1989) were used; a wild type clone and a petite mutant isolated after
growth in the presence of ethidium bromide (Goldring et al., 1970), which was
generously provided by M. Remacha, (CBMSO. Universidad Autónoma de Madrid.
Spain). The petite mutant preserved characteristics of respiratory deficient mutants, such
as slow growth and formation of small (petite) colonies in fermentable media (Ephrussi,
1949).
2.2. Yeast media, transformation and induction.
Yeast cells were grown at 30ºC, with orbital shaking at 300 rpm, in standard YNB
glucose medium supplemented with 20 mg/l L-tryptophan, 40 mg/l adenine and 20 mg/l
L-histidine. A standard lithium acetate protocol was used for production of competent
yeast and transformation (Burke et al., 2000). Transformants of the W303-1B strain
7
(carrying pEMBLyex or pEMBLyex-vpr plasmids) were maintained in selective
medium (containing 20 mg/l L-leucine). For vpr expression, yeast cells were cultured in
YNB medium containing 2% galactose plus required supplements (inducing medium).
The pH of media was adjusted with Trizma base. When required, solid medium was
prepared by the addition of 1.5 % purified agar (Difco) to the broth.
2.3. Assay conditions.
All experiments were repeated at least three times using at least three cultures derived
from independent colonies, with consistent results. Growth curves represent average
data from three experiments. Before initiation of experiments, cells were grown in pH
7-adjusted non-inducing medium to the exponential phase. Following a washing step in
MilliQ water, cells were diluted in fresh inducing medium and cell density was
adjusted. Cell growth was estimated by measuring optical density at 600 nm (OD600) in
a spectrophotometer (Genesys 10 VIS Thermo Scientific). Culturing was carried out at
30 ºC, with shaking at 300 rpm. Liquid cultures were initiated with exponentially
growing cells diluted in inducing medium to an OD600 of 0.01 (corresponding to 2 x 105
cells/ml) or 0.1 (petite mutants). In growth kinetic assays, samples were collected after
24 h of incubation (t= 0 h) and OD600 was determined. Agar plate assays were
performed with exponentially growing cells. After a washing step, cultures were diluted
with fresh medium to an OD600 of 0.2 (glucose) or 0.4 (galactose). Drop tests were
carried out by spotting 5 µl of serial dilutions of the cell suspension onto agar plates.
Drop tests used the same (non-inducing or inducing) pH- adjusted medium for dilutions
and also to prepare agar plates. Plates were incubated for the indicated time at 30 ºC and
then scanned.
2.4. Protein extraction and western blotting.
8
Exponentially growing cells were diluted in YNB (2 % galactose) to an OD600 of 0.005.
Samples (1 ml) were collected at OD600 1.0 and protein extraction was performed using
the following procedure: cells were pelleted and suspended in 1 ml lysis buffer (0.2 M
NaOH, 0.1 M β-mercaptoethanol and 0.1 mM PMSF). After 5 min on ice, 2 µl of 100 %
TCA was added and cell lysates were incubated at 65 ºC for 5 min followed by
incubation at 4 ºC for 5 min. The non-soluble fraction was collected by centrifugation
and washed with cold (-20 ºC) acetone (Merck). The pellet was dried in a Speed-vac
concentrator (Savant) and the extract was suspended in 100 µl sample buffer (0.16 M
Tris-HCl pH 6.8, 13.3 % glycerol (Merck), 2 % SDS, 1.5 % DTT and 0.033 %
bromophenol blue). Lastly, samples were briefly sonicated and heated to 100 ºC for 5
min. Total protein content of each extract was measured using the Protein Assay Kit
from Bio-Rad and concentrations were normalized to 1mg/ml protein prior to loading
onto SDS/20 % polyacrylamide gels. Proteins were transferred to nitrocellulose
membranes by wet blotting. Protein transfer efficiency was monitored by Ponceau S
staining. Membranes were subsequently cut into strips with the aid of molecular weight
marker bands. Membranes were quickly destained in distilled water and blocked before
addition of primary and secondary antibodies (Gonzalez and Carrasco, 2001). Labelled
proteins were detected using ECLTM Western Blotting Detection Reagents (Amersham).
Membrane striping was carried out in a buffer containing 100 mM 2-Mercaptoetanol, 2
% SDS and 62.5 mM TrisHCl (pH 7) at 50 ºC for 30 min. Membranes were
subsequently reprobed.
2.5. Antibodies.
The Vpr monoclonal antibody was kindly provided by Dr. J. Koop (Provided by the EU
Program EVA Centre for AIDS Reagents, NIBSC, UK. AVIP Contract Number LSHPCT-2004-503487).
The monoclonal antibodies, anti-yeast 3- phosphoglycerate kinase
9
(PGK), anti-yeast mitochondrial porin (Por1), anti-yeast COX complex IV subunit II
(Cox2p) anti-yeast COX complex IV subunit IV (Cox4p) and anti-yeast H+-ATPase 60
kDa subunit were purchased from Mitosciences. A primary monoclonal antibody to
GAPDH and peroxidase-conjugated goat secondary antibodies (anti-rabbit or anti
mouse) were purchased from Pierce.
2.6. Transmission electron microscopy:
Wild-type yeasts were cultured in induction medium and 48 h later cells were collected.
Cells were fixed (5 min) in glutaraldehyde in 0.1 M cacodylate buffer, added as a 2x
stock to the culture. Cells were collected by centrifugation and resuspended at 1
OD600/ml in fresh 1x fixative to complete fixation while gently rotating at room
temperature (15 min). After potassium permanganate staining, samples were dehydrated
and embedded in epoxy resin. Thin sections were prepared and mounted on mesh grids
as described (Wright, 2000).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ2.1. ก่อสร้าง plasmid และสายพันธุ์จุลินทรีย์E. coli ต้องใช้ DH5α (Sambrook และ Rusell, 2001) ใช้สำหรับการก่อสร้างระบบยีสต์รถเวกเตอร์ ลำดับยีน vpr จากโคลน NL4-3 ของเอชไอวี-1(อะดะ et al., 1986) ถูกโคลนเข้าไซต์ SmaI และ BamHI ของ pEMBLyex สูงคัดลอกแบบเวกเตอร์นิพจน์ยีสต์หมายเลขที่ดำเนินกาแล็กโทสเป็น inducible และกลูโคสโปรโมเตอร์ repressible (Cesareni และเมอร์เรย์ 1987) มียีนบ่อยควบคุม โดยโปรโมเตอร์ CYCGAL1 ซึ่งเป็น repressed แน่น โดยกลูโคส และขอเกิดจากกาแล็กโทส โคลนของ S. cerevisiae W303 1B 2 สายพันธุ์ (Thomasและ Rothstein, 1989) ได้ใช้ โคลนชนิดป่าและ mutant สตูดิโอแยกต่างหากหลังจากเจริญเติบโตในต่อหน้าของโบรไมด์ ethidium (Goldring et al., 1970), ซึ่งถูกโดยม. Remacha, (CBMSO อย่างลงตัว Universidad Autónoma de มาดริดสเปน) Mutant เกรดรักษาลักษณะของสายพันธุ์ขาดสารหายใจ เช่นเจริญเติบโตช้าและจัดตั้งอาณานิคมขนาดเล็ก (ขนาดเล็ก) ที่สื่อ fermentable (Ephrussi1949)2.2. ยีสต์สื่อ การเปลี่ยนแปลงและเหนี่ยวนำเซลล์ยีสต์ได้เติบโตขึ้นที่ 30ºC กับการสั่นของวงโคจรที่ 300 rpm ในมาตรฐาน YNBน้ำตาลในสื่อเสริม ด้วย 20 mg/l L-ทริปโตเฟน adenine 40 mg/l และ 20 mg/lL-histidine โพรโทคอ acetate มาตรฐานลิเธียมถูกใช้สำหรับการผลิตของพนักงานเจ้าหน้าที่ยีสต์และการแปลง (ลิตี้เบอร์กและ al., 2000) สายพันธุ์ Transformants W303 1B 7(กระเป๋า pEMBLyex หรือ pEMBLyex-vpr plasmids) ถูกเก็บรักษาไว้ในงานปานกลาง (ประกอบด้วย 20 mg/l L leucine) สำหรับนิพจน์ vpr เซลล์ยีสต์มีอ่างในYNB ขนาดกลางมี 2% กาแล็กโทสบวกต้องเสริม (inducing ปานกลาง)PH ของสื่อมีการปรับปรุงมี Trizma เมื่อถูกต้อง แข็งปานกลางจัดทำ โดยการเพิ่ม 1.5% บริสุทธิ์ agar (Difco) กับซุป2.3. assay เงื่อนไขการทดลองทั้งหมดถูกซ้ำน้อยสามครั้งโดยใช้วัฒนธรรมที่สามมาจากอิสระอาณานิคม ผลสอดคล้องกัน เจริญเติบโตของเส้นโค้งแสดงค่าเฉลี่ยข้อมูลจากการทดลอง 3 ก่อนเริ่มต้นการทดลอง เซลล์เติบโตขึ้นใน pHปรับปรุง 7 ไม่ inducing ปานกลางระยะเนน ต่อไปนี้เป็นขั้นตอนการซักผ้าในMilliQ เซลล์ถูกทำให้เจือจางใน inducing สด น้ำมีความหนาแน่นของเซลล์ปรับปรุง เจริญเติบโตของเซลล์ถูกประเมิน โดยการวัดความหนาแน่นของแสงที่ 600 nm (OD600) ในเป็นเครื่องทดสอบกรดด่าง (Genesys 10 วิเทอร์โมวิทยาศาสตร์) Culturing ถูกดำเนินการที่30 ºC ด้วยการสั่นที่ 300 rpm วัฒนธรรมของเหลวได้เริ่มต้นด้วยสร้างเติบโตยกเว้นใน inducing ปานกลางถึงมี OD600 0.01 (ที่สอดคล้องกับ 2 x 105 เซลล์เซลล์/มล.) หรือ 0.1 (สายพันธุ์ขนาดเล็ก) ในการเจริญเติบโตเคลื่อนไหว assays ตัวอย่างถูกเก็บรวบรวมหลังจาก24 ชมของคณะทันตแพทยศาสตร์ (t = 0 h) และ OD600 ได้กำหนดไว้ Agar assays จานได้ทำกับเซลล์การเจริญเติบโตขยายตัวอย่างมาก หลังจากขั้นตอนการซักผ้า วัฒนธรรมถูกทำให้เจือจางด้วยปานกลางสดเพื่อการ OD600 0.2 (กลูโคส) หรือ 0.4 (กาแล็กโทส) ฝากทดสอบได้ดำเนิน โดยจำ µl 5 ของ dilutions ประจำการระงับเซลล์บนแผ่น agarฝากทดสอบใช้เดียวกัน (ไม่ใช่ inducing หรือ inducing) pH-ปรับปรุงสื่อ dilutionsและยัง เตรียม agar แผ่น แผ่นถูก incubated สำหรับเวลาที่ระบุที่ 30 ºC และสแกนแล้ว2.4. โปรตีนสกัดและ blotting วิธีตะวันตก 8ได้ยกเว้นเซลล์สร้างการเติบโตใน YNB (กาแล็กโทส 2%) จะมี OD600 0.005มีการรวบรวมตัวอย่าง (1 มล) OD600 1.0 และทำการแยกโปรตีนโดยใช้ขั้นตอนต่อไปนี้: เซลล์ pelleted และถูกระงับในบัฟเฟอร์การ lysis 1 ml (0.2 MNaOH β-mercaptoethanol 0.1 M และ 0.1 มม. PMSF) หลังจาก 5 นาทีบนน้ำแข็ง µl 2 100%TCA เข้ามา และ lysates เซลล์ถูก incubated ที่ 65 ºC สำหรับ 5 นาทีตามด้วยบ่มที่ 4 ºC ใน 5 นาที เศษส่วนที่ไม่ละลายน้ำถูกรวบรวม โดย centrifugationและหินกับน้ำเย็น (-20 ºC) อะซีโตน (เมอร์ค) เม็ดถูกอบแห้งในความเร็ว-vacอาทิตย์หัว (Savant) และสารสกัดที่ถูกระงับใน 100 µl อย่างบัฟเฟอร์ (0.16 Mทริสเรทติ้ง HCl pH 6.8, 13.3% กลีเซอร (เมอร์ค), SDS 2%, 1.5% DTT และ 0.033%bromophenol blue) สุดท้าย ตัวอย่างสั้น ๆ sonicated และอุณหภูมิ 100 ºC สำหรับ 5นาทีรวมโปรตีนของสารสกัดแต่ละถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีนไบโอ-Rad และความเข้มข้นได้ตามปกติกับโปรตีน 1mg/ml ก่อนโหลดบน SDS/20% polyacrylamide gels โปรตีนถูกโอนย้ายไป nitrocelluloseเข้า โดย blotting วิธีเปียก ตรวจสอบประสิทธิภาพโอนโปรตีนถูก Ponceau Sย้อมสี เข้าได้มาตัดเป็นแถบด้วยความช่วยเหลือของน้ำหนักโมเลกุลเครื่องหมายวงการ สารได้อย่างรวดเร็ว destained ในน้ำกลั่น และบล็อกก่อนนอกจากนี้หลัก และรองแอนตี้ (Gonzalez และ Carrasco, 2001) มันโปรตีนพบใช้ ECLTM เวสเทิร์น blotting วิธีตรวจ Reagents (Amersham)การสไทรพ์เมมเบรนถูกดำเนินในบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 100 มม. 2-Mercaptoetanol, 2SDS และ 62.5 มม. TrisHCl (pH 7) 50 ºC ใน 30 นาทีเพื่อช่วยได้ต่อมา reprobed2.5 การแอนตี้กรุณาให้แอนติบอดี monoclonal Vpr โดยดร.เจ Koop (EU โดยโปรแกรม EVA ศูนย์เอดส์ Reagents, NIBSC, UK AVIP สัญญาหมายเลข LSHPCT-2004-503487)แอนตี้ monoclonal ยีสต์ป้องกัน 3-phosphoglycerate kinase9(PGK), ยีสต์ป้องกัน mitochondrial porin (Por1) ยีสต์ป้องกันค็อกซ์ซับซ้อน IV ย่อย II(Cox2p) ยีสต์ป้องกันค็อกซ์ซับซ้อน IV ย่อย IV (Cox4p) และยีสต์ป้องกัน H + -ATPase 60kDa ย่อยได้ถูกซื้อจาก Mitosciences แอนติบอดี monoclonal มีหลักการGAPDH และ peroxidase กลวงแพะแอนตี้รอง (กระต่ายป้องกันหรือต่อต้านเมาส์) ซื้อจากเพียร์ซ2.6 การส่งอิเล็กตรอน microscopy:ชนิดป่า yeasts ได้อ่างในการเหนี่ยวนำ และ 48 h หลังเซลล์ถูกเก็บรวบรวมเซลล์ได้ถาวร (5 นาที) ใน glutaraldehyde ในบัฟเฟอร์ cacodylate 0.1 M เพิ่มเป็น 2 xหุ้นเพื่อวัฒนธรรม เซลล์ถูกรวบรวม โดย centrifugation และ resuspended ที่ 1OD600/ml ใน 1 x สดตรึงการเบีสมบูรณ์ขณะหมุนเบา ๆ ที่ห้องอุณหภูมิ (15 นาที) หลังจากทับทิมย้อมสี ตัวอย่างอบแห้งและฝังตัวในเรซินแบบ ส่วนบางเตรียมไว้ และติดตั้งบนกริดตาข่ายเป็นอธิบาย (ไรท์ 2000)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
2.1 พลาสมิดก่อสร้างและสายพันธุ์จุลินทรีย์.
อี สายพันธุ์ coli DH5α (Sambrook และ Rusell, 2001)
ที่ใช้สำหรับการก่อสร้างของรถรับส่งอีโคไลยีสต์เวกเตอร์ ลำดับยีน VPR จากโคลน NL4-3 ของเชื้อ HIV-1
(อะดา et al., 1986) เป็นโคลนเข้าไปในสมัย ​​BamHI และเว็บไซต์ของ pEMBLyex,
สูงยีสต์สำเนาจำนวนเวกเตอร์แสดงออกแบกกาแลคโตinducible
และกลูโคสก่อการrepressible (Cesareni และเมอเรย์ 1987) การแสดงออกของยีนจากภายนอกจะถูกควบคุมโดยโปรโมเตอร์ CYCGAL1 ซึ่งเป็นอัดอั้นแน่นโดยกลูโคสและเหนี่ยวนำให้เกิดอย่างมากจากกาแลคโต โคลนสองสายพันธุ์เอส cerevisiae W303-1B (โทมัสและRothstein, 1989) ถูกนำมาใช้; โคลนชนิดป่าและกลายพันธุ์เล็กกระทัดรัดแยกหลังจากที่การเจริญเติบโตในการปรากฏตัวของโบรไมด์ ethidium นี้ (แหวนทองคำ et al., 1970) ซึ่งได้รับการบริการที่มีให้อย่างไม่เห็นแก่ตัวโดยเอ็มRemacha (CBMSO. Universidad Autónomaมาดริด. สเปน) กลายพันธุ์เล็กกระทัดรัดที่เก็บรักษาไว้ในลักษณะของการกลายพันธุ์ที่ขาดระบบทางเดินหายใจเช่นการเจริญเติบโตช้าและการก่อตัวของขนาดเล็ก (เล็ก) อาณานิคมในสื่อย่อย (Ephrussi, 1949). 2.2 สื่อยีสต์และเหนี่ยวนำการเปลี่ยนแปลง. เซลล์ยีสต์เติบโตที่ 30 องศาเซลเซียสโดยมีวงโคจรเขย่าที่ 300 รอบต่อนาทีมาตรฐาน YNB กลางกลูโคสเสริมด้วย 20 mg / l โพรไบโอ L-40 mg / l adenine และ 20 mg / l L-histidine โปรโตคอลอะซิเตตลิเธียมมาตรฐานที่ใช้สำหรับการผลิตที่มีอำนาจยีสต์และการเปลี่ยนแปลง (เบิร์ et al., 2000) Transformants ของสายพันธุ์ W303-1B 7 (แบก pEMBLyex หรือพลาสมิด pEMBLyex-VPR) ได้รับการดูแลในการเลือกสื่อ(ที่มี 20 mg / l L-leucine) สำหรับการแสดงออก VPR เซลล์ยีสต์เลี้ยงในYNB ขนาดกลางที่มีกาแลคโต 2% บวกกับผลิตภัณฑ์เสริมอาหารที่ต้องการ (กลางชักนำ). ค่า pH ของสื่อมีการปรับฐาน Trizma เมื่อจำเป็นต้องใช้สื่อที่เป็นของแข็งได้รับการจัดทำขึ้นโดยการเพิ่มขึ้นของ 1.5% อาหารเลี้ยงเชื้อบริสุทธิ์ (Difco) เพื่อน้ำซุป. 2.3 เงื่อนไข Assay. การทดลองทั้งหมดได้ซ้ำแล้วซ้ำอีกอย่างน้อยสามครั้งโดยใช้เวลาอย่างน้อยสามวัฒนธรรมที่มาจากอาณานิคมอิสระกับผลที่สอดคล้องกัน เส้นโค้งการเจริญเติบโตเฉลี่ยเป็นตัวแทนของข้อมูลจากการทดลองสาม ก่อนที่จะเริ่มต้นการทดลองเซลล์ที่ถูกปลูกในค่า pH 7 ที่ปรับขนาดกลางที่ไม่ใช่การกระตุ้นให้เกิดการขั้นตอนการชี้แจง ต่อไปนี้ขั้นตอนการซักผ้าในน้ำ MilliQ เซลล์ที่ถูกเจือจางในสื่อการกระตุ้นให้เกิดความสดใหม่และความหนาแน่นของเซลล์ได้รับการปรับ เจริญเติบโตของเซลล์ได้รับการประเมินโดยการวัดความหนาแน่นของแสงที่ 600 นาโนเมตร (OD600) ในสเปก(Genesys 10 VIS เทอร์โมวิทยาศาสตร์) การเพาะเลี้ยงได้ดำเนินการที่30 องศาเซลเซียสด้วยการเขย่า 300 รอบต่อนาทีที่ วัฒนธรรมเหลวถูกเริ่มต้นด้วยชี้แจงเซลล์ที่เพิ่มขึ้นในการกระตุ้นให้เกิดการปรับลดขนาดกลางไปยัง OD600 0.01 (ตรงกับ 2 x 105 เซลล์ / มล.) หรือ 0.1 (กลายพันธุ์เล็กกระทัดรัด) ในการวิเคราะห์การเคลื่อนไหวการเจริญเติบโตเก็บตัวอย่างหลังจาก24 ชั่วโมงของการบ่ม (t = 0 ชั่วโมง) OD600 ถูกกำหนด วุ้นตรวจแผ่นได้รับการดำเนินการกับเซลล์เติบโตชี้แจง หลังจากขั้นตอนการซักผ้าวัฒนธรรมถูกเจือจางกับสื่อใหม่เพื่อ OD600 ของ 0.2 (กลูโคส) หรือ 0.4 (กาแลคโต) การทดสอบ Drop ถูกดำเนินการโดยการจำ5 ไมโครลิตรของเจือจางอนุกรมของเซลล์แขวนลอยลงบนแผ่นวุ้น. ลดลงทดสอบที่ใช้เหมือนกัน (ที่ไม่ใช่การกระตุ้นให้เกิดการกระตุ้นให้เกิดหรือ) pH- กลางปรับเจือจางและเพื่อเตรียมความพร้อมจานอาหารเลี้ยงเชื้อ แผ่นถูกบ่มสำหรับเวลาที่ระบุวันที่ 30 องศาเซลเซียสและจากนั้นสแกน. 2.4 . การสกัดโปรตีนและซับตะวันตก8. ชี้แจงการเจริญเติบโตของเซลล์ที่ถูกเจือจางใน YNB (กาแลคโต 2%) ไปยัง OD600 0.005 ตัวอย่าง (1 มล.) ได้รับการเก็บที่ OD600 1.0 และการสกัดโปรตีนดำเนินการโดยใช้ขั้นตอนต่อไปนี้: เซลล์เม็ดและระงับ ใน 1 มิลลิลิตรบัฟเฟอร์สลาย (0.2 M NaOH 0.1 M β-mercaptoethanol และ 0.1 มิลลิ PMSF) หลังจาก 5 นาทีบนน้ำแข็ง 2 ไมโครลิตร 100% TCA ถูกบันทึกและ lysates เซลล์ถูกบ่มที่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วยการบ่มที่อุณหภูมิ4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ส่วนที่ไม่ละลายน้ำที่ถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงและล้างด้วยเย็น (-20 องศาเซลเซียส) อะซีโตน (เมอร์ค) เม็ดแห้งในความเร็ว-Vac หัว (เมธี) และสารสกัดจากถูกระงับใน 100 บัฟเฟอร์ตัวอย่างไมโครลิตร (0.16 M Tris-HCl pH 6.8, กลีเซอรีน 13.3% (เมอร์ค), 2% SDS 1.5% DTT และ 0.033% bromophenol สีน้ำเงิน). สุดท้ายตัวอย่าง sonicated สั้น ๆ และให้ความร้อนถึง 100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ปริมาณโปรตีนรวมของแต่ละสารสกัดจากวัดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีนจาก Bio-Rad และความเข้มข้นที่ได้รับปกติ 1mg / ml โปรตีนก่อนที่จะโหลดลงบนSDS / 20% เจลอะคริเลต โปรตีนที่ถูกย้ายไป nitrocellulose เยื่อโดยซับเปียก ประสิทธิภาพการถ่ายโอนโปรตีนได้รับการตรวจสอบโดย Ponceau S ย้อมสี เยื่อถูกตัดต่อมาเป็นแผ่นด้วยความช่วยเหลือของน้ำหนักโมเลกุลวงดนตรีที่เครื่องหมาย เยื่อถูก destained ได้อย่างรวดเร็วในน้ำกลั่นและก่อนที่จะปิดกั้นการเพิ่มขึ้นของแอนติบอดีประถมศึกษาและมัธยมศึกษา(กอนซาเลและ Carrasco, 2001) ป้ายโปรตีนที่ถูกตรวจพบโดยใช้ ECLTM ตะวันตกซับรีเอเจนต์การตรวจสอบ (Amersham). แถบเมมเบรนได้ดำเนินการในบัฟเฟอร์ที่มี 100 มิลลิ 2 Mercaptoetanol 2 SDS% และ 62.5 มิลลิ TrisHCl (pH 7) ที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที เยื่อถูกreprobed ภายหลัง. 2.5 แอนติบอดี. แอนตี้บอดี้ Vpr ให้ความกรุณาโดยดร. เจ Koop (โดยสหภาพยุโรปโปรแกรมEVA ศูนย์รีเอเจนต์เอดส์ NIBSC สหราชอาณาจักร. AVIP สัญญาจำนวน LSHPCT-2004-503487). โคลนอลแอนติบอดีต่อต้านยีสต์ 3 ไคเนส phosphoglycerate 9 (PGK) ต่อต้านยีสต์ยล Porin (Por1) ต่อต้านยีสต์ COX subunit IV ซับซ้อน II (Cox2p) ต่อต้านยีสต์ COX ซับซ้อน IV subunit iv (Cox4p) และ H ต่อต้านยีสต์ + ATPase นา 60 kDa subunit กำลังซื้อ จาก Mitosciences โมโนโคลนอลแอนติบอดีหลักในการGAPDH และแพะ peroxidase-ผันแอนติบอดีรอง (ป้องกันกระต่ายป้องกันหรือเมาส์) ที่ซื้อมาจากเพียร์ซ. 2.6 ส่งกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน:. ยีสต์ชนิดป่าที่ถูกเลี้ยงในสื่อเหนี่ยวนำและ 48 ชั่วโมงต่อมาเซลล์ที่ถูกเก็บรวบรวมเซลล์ได้รับการแก้ไข(5 นาที) ใน glutaraldehyde ใน 0.1 M บัฟเฟอร์ cacodylate เพิ่มเป็น 2 เท่าหุ้นวัฒนธรรม เซลล์ที่ถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงและ resuspended วันที่ 1 OD600 / ml ในตรึง 1x สดที่จะเสร็จสิ้นการตรึงขณะที่ค่อยๆหมุน ณ ห้องอุณหภูมิ(15 นาที) หลังจากการย้อมสีด่างทับทิมกลุ่มตัวอย่างเป็นแห้งและฝังตัวอยู่ในอีพอกซีเรซิน บางส่วนถูกจัดทำและติดตั้งอยู่บนตะแกรงตาข่ายตามที่อธิบายไว้ (ไรท์, 2000)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ
2.1 . การสร้างสายพันธุ์และสายพันธุ์จุลินทรีย์ เชื้อ E . coli DH5 (
αความเครียดและ sambrook รัสเซลล์ , 2001 ) ใช้สำหรับการก่อสร้างของ
e.coli-yeast รถเวกเตอร์ การ vpr ลำดับยีนจากโคลน nl4-3 ของ HIV-1
( อาดาจิ et al . , 1986 ) ถูกโคลนเข้าใช้เว็บไซต์ของ pemblyex BamHI และสูง
,คัดลอกหมายเลขยีสต์นิพจน์เวกเตอร์แบกกาแล็กโทสและกลูโคสซึ่งอดกลั้นการ inducible
( cesareni และเมอร์เรย์ , 1987 ) การแสดงออกของยีนจากภายนอกคือ
ควบคุมโดย cycgal1 promoter ซึ่งแน่นระงับโดยกลูโคสและกาแล็กโทส
ขอความ . สองสายพันธุ์ของเชื้อ S . cerevisiae สายพันธุ์ ( โทมัสและ w303-1b
10 , 1989 ) ถูกใช้เป็นป่าประเภทโคลนและ Petite กลายพันธุ์แยกหลังจาก
การเจริญเติบโตในการแสดงตนของทิเดียมโบรไมด์ ( โกลด์ริง et al . , 1970 ) ซึ่ง
พลั่กโดยม. remacha ( cbmso . Universidad Aut óโนมา เดอ มาดริด
สเปน ) เล็กรักษาคุณลักษณะของระบบทางเดินหายใจบกพร่องสายพันธุ์กลายพันธุ์ เช่น
การเจริญเติบโตช้าและการก่อตัวของเล็ก ( เล็ก ) อาณานิคมในกรัมสื่อ ( ephrussi

, 1949 ) 2.2 .สื่อยีสต์ , การเปลี่ยนแปลงและการเหนี่ยวนำ .
เซลล์ยีสต์เติบโต 30 º C เขย่า วงโคจรที่ 300 รอบต่อนาทีในมาตรฐานกลาง กลูโคส ynb
เสริม 20 มก. / ล. - 40 mg / l และสารอัลคาลอยด์ 20 มก. / ล.
l-histidine . มาตรฐานโปรโตคอลลิเธียมเตตใช้สำหรับการผลิตยีสต์ที่มีความสามารถ
และการแปลง ( เบิร์ก et al . , 2000 ) พลาสมิดของ w303-1b เมื่อย

7( แบก pemblyex หรือ pemblyex vpr พลาส ) ถูกเก็บรักษาไว้ใน selective
ปานกลาง ( 20 mg / l ( แอล ) สำหรับการแสดงออก vpr เซลล์ยีสต์ที่เพาะเลี้ยงในอาหารที่มี 2 %
ynb กาแลคโตสพลัสเป็นอาหารเสริม ( กระตุ้น ) ) .
pH ของสื่อกับ trizma ปรับฐาน เมื่อต้องแข็งปานกลาง
เตรียมเพิ่ม 1.5% วุ้นบริสุทธิ์ ( difco ) น้ำซุป
2.3เงื่อนไขการทดสอบ ทดลองซ้ำ
ทั้งหมดอย่างน้อยสามครั้งใช้อย่างน้อยสามวัฒนธรรมที่ได้มา
จากอาณานิคมอิสระ กับผลลัพธ์ที่สอดคล้องกัน เส้นโค้งการเติบโตเฉลี่ย
3 แสดงข้อมูลจากการทดลอง ก่อนที่จะเริ่มต้นของการทดลอง เซลล์ที่ถูกปลูกใน M
7-adjusted ไม่กระตุ้น ( ระยะที่ชี้แจง ต่อไปนี้เป็นขั้นตอนในการล้าง
milliq น้ำเซลล์ถูกกระตุ้นเจือจางสดขนาดกลางและความหนาแน่นเซลล์อยู่
ปรับ การเจริญเติบโตของเซลล์ โดยการวัดความหนาแน่นของแสงที่ประมาณ 600 nm ( od600 ) : Spectrophotometer ( เจเนซิส 10 วิสเทอร์โมวิทยาศาสตร์ ) การกระทำที่º
30 องศาเซลเซียสเขย่า ที่ 300 รอบต่อนาที ของเหลวมีวัฒนธรรมร่วมชี้แจง
เติบโตเซลล์เจือจางในการเหนี่ยวนำการ od600 ขนาดกลางของ 001 ( สอดคล้องกับ 2 x 105
เซลล์ / มิลลิลิตร ) หรือ 0.1 ( Petite กลายพันธุ์ ) ในการใช้ตัวอย่าง ) ,
1 หลัง 24 H ( t = 0 H ) และ od600 ตัดสินใจไว้แล้ว คือการใช้จานวุ้น
ชี้แจงการเติบโตเซลล์ หลังจากล้างขั้นตอนที่ 3 ลด
ปานกลางสดเพื่อ od600 0.2 ( กลูโคส ) หรือ 0.4 ( galactose ) การทดสอบปล่อยถูก
ดําเนินการโดยเฉพาะ 5 µ L อนุกรมเจือจางของเซลล์แขวนลอยบนจานวุ้น .
ลดลงทดสอบใช้เหมือนกัน ( ไม่ทำให้เกิดหรือกระตุ้น ) pH - ปรับขนาดกลางสำหรับเจือจาง
และยังเตรียมวุ้นแผ่น จานถูกบ่มเพื่อระบุเวลาที่ 30 º C แล้วสแกนและ
.
2.4 . การสกัดโปรตีนและ Western blotting .
8
ชี้แจงการเติบโตเซลล์ลดใน ynb ( 2% galactose ) กับ od600 ของ 0.005 .
ตัวอย่าง ( 1 มล. ) จำนวน od600 1.0 และโปรตีนที่สกัดโดยใช้
ขั้นตอนต่อไปนี้ : เซลล์มีเม็ดอยู่ในบัฟเฟอร์การสลาย 1 มล. 0.2 M
NaOH 0.1M บีตา - mercaptoethanol และ 0.1 มิลลิเมตร PMSF ) หลังจาก 5 นาทีบนน้ำแข็ง µ 100 %
2 lบริษัท ได้เพิ่มและเซลล์ lysates อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วยº
บ่มที่ 4 ºองศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ไม่ละลายน้ำ ส่วนการศึกษาโดยการปั่นเหวี่ยง
และล้างด้วยน้ำเย็น ( - 20 º C ) อะซิโตน ( Merck ) เม็ดแห้งได้ในความเร็ว Vac
หัว ( เมธี ) และสารสกัดที่ถูกระงับใน 100 µ l ตัวอย่างบัฟเฟอร์ ( 0.16 M
โดยกรดไฮโดรคลอริก pH 6.8 , 13.3 % กลีเซอรอล ( Merck ) 2 % SDS , DTT 1.5% และ 0โบรโมฟีน 033 %
สีฟ้า ) ท้ายนี้ ตัวอย่างสั้น sonicated และความร้อนถึง 100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที º
รวมโปรตีนสกัดของแต่ละวัดโดยใช้โปรตีนในชุด
จากราดชีวภาพและปริมาณปกติเพื่อ 1mg / ml โปรตีนก่อนโหลด
บน SDS / 20 % เจลอะคริลาไมด์ . โปรตีน คือ ไนโตร
เยื่อโดยวิธีเปียก .การตรวจสอบประสิทธิภาพของโปรตีนใน S
staining เยื่อแผ่นแบบตัดเป็นแผ่นต่อมาด้วยความช่วยเหลือของแถบเครื่องหมาย
น้ำหนักโมเลกุล เยื่อแผ่นแบบรวดเร็ว destained ในน้ำกลั่นและบล็อกก่อน
นอกจากนี้แอนติบอดี ( กอนซาเลซ ประถมและมัธยม และคาร์รัสโค้ , 2001 ) พบว่ามีการใช้ความรุนแรง
โปรตีน ecltm Western blotting เพื่อตรวจจับ (
ชาม )แผ่นแถบข้อมูลในบัฟเฟอร์ที่มี 2-mercaptoetanol 100 มม. , 2
% SDS และ 62.5 มม. trishcl ( pH 7 ) ที่ 50 º C เป็นเวลา 30 นาที ต่อมา reprobed membranes )
.
2.5 แอนติบอดี .
vpr โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่กรุณาให้โดย ดร. คูป ( โดยโปรแกรม EU
EVA ศูนย์ reagents , เอดส์ nibsc , สหราชอาณาจักร . avip สัญญาเลขที่ lshpct-2004-503487
โมโนโคลนอลแอนติบอดี , )ต้านยีสต์ 3 - phosphoglycerate kinase
9
( PGK ) ต่อต้านยีสต์ยลโปริน ( por1 ) ต่อต้านยีสต์ Cox ซับซ้อน 4 1 2
( cox2p ) ต้านยีสต์ Cox ซับซ้อน 4 1 4 ( cox4p ) และต่อต้านยีสต์ H - ? 1
) 60 ซื้อมาจาก mitosciences . เป็น โมโนโคลนอลแอนติบอดีประถม

gapdh และ peroxidase แอนติบอดีและแพะมัธยม ( ต่อต้านหรือป้องกันเมาส์กระต่าย

) ซื้อจาก เพียซ2.6 ส่งกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน :
ยีสต์ชนิดป่าที่เพาะเลี้ยงในเซลล์ induction medium และ 48 H ต่อมาศึกษา .
เซลล์ถูกกำหนด ( 5 นาที ) ใน glutaraldehyde ใน 0.1M จากนั้นนำบัฟเฟอร์เป็น 2x
หุ้นเพื่อวัฒนธรรม เซลล์มีจำนวน 3 resuspended และที่ 1
od600 / ml ในฟิกเซทีฟ 1x สดสมบูรณ์การตรึงในขณะที่ค่อยๆหมุนที่อุณหภูมิในห้อง
( 15 นาที )หลังจากด่างทับทิมการย้อมสีจำนวนแห้ง
และฝังตัวในอีพอกซีเรซิน ส่วนบางเตรียมไว้ และติดบนตะแกรงตาข่าย
ตามที่อธิบายไว้ ( Wright , 2000 )