DNA preparation from direct specime

DNA preparation from direct specimens
Genomic DNA from specimens was extracted using the
QIAamp DNA Mini kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)
according to the manufacturer’s instructions.
Briefly, samples were collected in 2
0 ml microfuge tubes
and 200 ll of kit buffer AL with proteinase K (20 lg)
was added to the samples and mixed for 15 s. The reactions
were incubated at 56°C for 10 min, and 200 ll
ethanol was added. After centrifugation for 10 s at
13 000 g, 450 ll lysate was transferred to a QIAamp
DNA Mini spin column, and then centrifuged again at
13 000 g for 10 min. The column was removed, and
500 ll of kit buffers AW1 and AW2 were added separately
to each well, followed by centrifugation at 13 000 g
for 10 min. The DNA was eluted by the addition of 80 ll
kit buffer AE (10 mmol l
1 Tris-Cl, 0
5 mmol l
1 EDTA,
pH 9
0), and centrifuged at 13 000 g for 3 min. The concentration
of genomic DNA was determined by optical
density readings at 260 nm using a NanoQuant spectrophotometer
(Tecan, M€annedorf, Switzerland). The
DNA was stored at 4°C until used.
For the preparation of DNA template from FFPE samples,
5-lm tissue sections were cut from paraffin blocks
and 10 sections were placed in sterile microfuge tubes.
To avoid cross-contamination of the specimens, the
microtome blade was replaced between blocks. The tissues
were deparaffinized by the addition of 1 ml xylene
and the samples were mixed gently for 20 min at 65°C.
The samples were then centrifuged at 13 000 g for 5 min
and the supernatants were discarded. Residual xylene was
removed by washing the samples twice with 1 ml 100%
ethanol for 5 min and centrifuging at 13 000 g for
5 min. The following steps for genomic

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การเตรียมดีเอ็นเอจากตัวอย่างโดยตรงดีเอ็นเอออกจากชิ้นงานถูกสกัดโดยใช้การชุดมินิ QIAamp ดีเอ็นเอ (Qiagen GmbH, Hilden เยอรมนี)ตามคำแนะนำของผู้ผลิตสั้น ๆ ตัวอย่างถูกจัดเก็บในหลอด microfuge มล. 2และ 200 ll ชุดอุปกรณ์บัฟเฟอร์อัล ด้วย proteinase K (20 lg)แก้ไขเพิ่มตัวอย่าง และผสม 15 s ปฏิกิริยาได้รับการกกที่ 56° C 10 นาที และ 200 llเอทานอลถูก หลังจากหมุนเหวี่ยงสำหรับ 10 s ที่13 000 g, 450 lysate จะโอนย้ายไป QIAampดีเอ็นเอขนาดเล็กหมุนคอลัมน์ แล้ว จากอีกที่13 000 g 10 นาที คอลัมน์ถูกลบ และ500 ll ของบัฟเฟอร์ชุด AW1 และ AW2 เพิ่มต่างหากแต่ละดี ตาม ด้วยหมุนเหวี่ยงที่จี 13 000สำหรับ 10 นาที ดีเอ็นเอถูก eluted โดยการเพิ่ม 80 llชุดบัฟเฟอร์ AE (10 มิลลิโมลต่อลิตรทริสเรทติ้ง 1-Cl, 0 5 มิลลิโมลต่อลิตร1 EDTAค่า pH 9 0), และเหวี่ยงที่จี 13 000 3 นาที ความเข้มข้นของดีเอ็นเอที่ออกกำหนด โดยแสงอ่านค่าความหนาแน่นที่ 260 nm ใช้เป็นสเปค NanoQuant(Tecan, annedorf€ M สวิตเซอร์แลนด์) การดีเอ็นเอถูกเก็บไว้ที่ 4° C จนกว่าจะใช้สำหรับการเตรียมแม่แบบดีเอ็นเอจากตัวอย่าง FFPE5-lm เนื้อเยื่อส่วนที่ตัดจากบล็อกพาราฟินและ 10 ส่วนไว้ในหลอด microfuge ปลอดเชื้อเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้ามของชิ้นงาน การใบมีด microtome ถูกแทนระหว่างบล็อก เนื้อเยื่อถูก deparaffinized โดยการเพิ่มพารา 1 มล.และตัวอย่างการรวบรวมสำหรับ 20 นาทีที่ 65 องศาเซลเซียสตัวอย่างได้จากที่ 13 000 g 5 นาทีแล้วและ supernatants ถูกละทิ้ง ไซลีนที่ตกค้างได้เอาซักตัวอย่างสอง มี 1 ml 100%เอทานอล 5 นาทีและสิ่งที่ 13 000 g สำหรับ5 นาที ขั้นตอนต่อไปนี้สำหรับออก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การเตรียมดีเอ็นเอจากตัวอย่างโดยตรง
ดีเอ็นเอจากตัวอย่างถูกสกัดโดยใช้
ชุด QIAamp ดีเอ็นเอมินิ (Qiagen GmbH, ฮิลเดน, เยอรมนี)
ตามคำแนะนำของผู้ผลิต.
สั้น ๆ , เก็บตัวอย่างใน 2? 0 มล. หลอด microfuge
และ 200 LL ของชุดกันชน AL กับโปร K (20 LG)
ถูกบันทึกอยู่ในตัวอย่างและผสม 15 วินาที ปฏิกิริยา
ถูกบ่มที่ 56 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีและ 200 LL
เอทานอลเพิ่ม หลังจากการหมุนเหวี่ยงเวลา 10 วินาทีที่
13 000 กรัม 450 LL lysate ถูกโอนไปยัง QIAamp
คอลัมน์ปั่นดีเอ็นเอมินิแล้วปั่นอีกครั้งที่
13 000 กรัมเป็นเวลา 10 นาที คอลัมน์นี้ถูกลบออกและ
500 LL ของชุดบัฟเฟอร์ AW1 และ AW2 ถูกเพิ่มแยก
แต่ละดีตามมาด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 13 000 กรัม
เป็นเวลา 10 นาที ดีเอ็นเอถูกชะโดยนอกเหนือจาก 80 ของ LL
ชุดกันชน AE (10 มิลลิโมลต่อลิตร
1 Tris-Cl, 0? 5 มิลลิโมลต่อลิตร
1 EDTA,
ค่า pH 9 0) และหมุนเหวี่ยงที่ 13 000 กรัมเป็นเวลา 3 นาที ความเข้มข้น
ของดีเอ็นเอถูกกำหนดโดยแสง
อ่านความหนาแน่นที่ 260 นาโนเมตรโดยใช้ spectrophotometer NanoQuant
(Tecan, M € annedorf วิตเซอร์แลนด์)
DNA ถูกเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสจนใช้.
สำหรับการเตรียมการของแม่แบบดีเอ็นเอจากตัวอย่าง FFPE ที่
ส่วนเนื้อเยื่อ 5 LM ถูกตัดออกจากบล็อกพาราฟิน
และ 10 ส่วนที่ถูกวางไว้ในหลอด microfuge หมัน.
เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของตัวอย่างที่
ใบ microtome ถูกแทนที่ระหว่างบล็อก เนื้อเยื่อ
ถูก deparaffinized โดยนอกเหนือจาก 1 มิลลิลิตรไซลีน
และกลุ่มตัวอย่างถูกผสมเบา ๆ 20 นาทีที่ 65 ° C.
ตัวอย่างถูกปั่นแล้วที่ 13 000 กรัมเป็นเวลา 5 นาที
และ supernatants ถูกทิ้ง ไซลีนที่เหลือถูก
ลบออกโดยการล้างตัวอย่างครั้งที่สอง 1 มล. 100%
เอทานอลเป็นเวลา 5 นาทีและเหวี่ยงที่ 13 000 กรัมสำหรับ
5 นาที ขั้นตอนต่อไปนี้สำหรับจีโนม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเตรียมดีเอ็นเอจากตัวอย่างโดยตรงดีเอ็นเอจากตัวอย่างถูกสกัดโดยใช้ชุดมินิกดีเอ็นเอ qiaamp ( QIAGEN GmbH , ฮิลเดน , เยอรมนี )ตามคำแนะนำของผู้ผลิตสั้น , ตัวอย่าง 20 ml microfuge ท่อและ 200 จะชุดกันชน อัล กับโปร K ( 20 บาท )คือเพิ่มตัวอย่างและผสมเป็นเวลา 15 วินาที ปฏิกิริยาอุณหภูมิ 56 องศา C นาน 10 นาที และ 200 จะเอทานอลที่ถูกเพิ่มเข้ามา หลังการปั่นเหวี่ยงสำหรับ 10 ที่13 , 000 กรัม 450 จะ lysate ถูกส่งไป qiaampคอลัมน์หมุนดีเอ็นเอมินิ แล้วไฟฟ้าอีกครั้ง13 , 000 กรัมต่อ 10 นาทีคอลัมน์จะถูกลบออก , และ500 ชุด และจะ aw1 บัฟเฟอร์ aw2 เพิ่มต่างหากกัน ตามด้วยการปั่นเหวี่ยงที่ 13 , 000 กรัม10 นาทีตัวอย่างดีเอ็นเอ โดยนอกเหนือจาก 80 จะชุดกันชนเอ ( 10 mmol l1 บริษัท CL 05 mmol l1 EDTA ,90 ) และระดับ pH ที่ 13 000 กรัมเป็นเวลา 3 นาที ความเข้มข้นของดีเอ็นเอถูกกำหนดโดยแสงความหนาแน่นของการอ่านที่ 260 nm ใช้วัสดุ nanoquant( ทีแคน , M จ่าย annedorf , สวิตเซอร์แลนด์ ) ที่DNA จะถูกเก็บไว้ที่ 4 ° C จนใช้สำหรับการเตรียมการของดีเอ็นเอจากตัวอย่าง ffpe แม่แบบ ,5-lm เนื้อเยื่อบางส่วนถูกตัดออกจากพาราฟินบล็อกและ 10 ส่วนที่ถูกวางไว้ในการฆ่าเชื้อ microfuge หลอดเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้ามของตัวอย่างที่เครื่องตัดชิ้นเนื้อใบมีดถูกแทนที่ระหว่างบล็อก เนื้อเยื่อเป็น deparaffinized โดยนอกเหนือจากไซลีน 1 มิลลิลิตรและตัวอย่างแบบผสมเบา ๆสำหรับ 20 นาทีที่ 65 องศาจำนวน 13 , 000 กรัมแล้วระดับที่ 5 นาทีและ supernatants ถูกละทิ้ง . ไซลีน ที่เหลือคือเอาซักอย่างสอง 100 % 1 มิลลิลิตรเอทานอลสำหรับ 5 นาทีที่ 13 000 กรัมสาร5 . ขั้นตอนต่อไปสำหรับจีโนม