Rapid advances in sequencing techno

Rapid advances in sequencing technology have changed the experimental landscape of microbial ecology. In the last 10 years, the field has moved from sequencing hundreds of 16S rRNA gene fragments per study using clone libraries to the sequencing of millions of fragments per study using next-generation sequencing technologies from 454 and Illumina. As these technologies advance, it is critical to assess the strengths, weaknesses, and overall suitability of these platforms for the interrogation of microbial communities. Here, we present an improved method for sequencing variable regions within the 16S rRNA gene using Illumina's MiSeq platform, which is currently capable of producing paired 250-nucleotide reads. We evaluated three overlapping regions of the 16S rRNA gene that vary in length (i.e., V34, V4, and V45) by resequencing a mock community and natural samples from human feces, mouse feces, and soil. By titrating the concentration of 16S rRNA gene amplicons applied to the flow cell and using a quality score-based approach to correct discrepancies between reads used to construct contigs, we were able to reduce error rates by as much as two orders of magnitude. Finally, we reprocessed samples from a previous study to demonstrate that large numbers of samples could be multiplexed and sequenced in parallel with shotgun metagenomes. These analyses demonstrate that our approach can provide data that are at least as good as that generated by the 454 platform while providing considerably higher sequencing coverage for a fraction of the cost.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ความก้าวหน้าอย่างรวดเร็วในลำดับเทคโนโลยีมีการเปลี่ยนแปลงภูมิทัศน์ทดลองของนิเวศวิทยาจุลินทรีย์ ใน 10 ปี มีย้ายฟิลด์จากลำดับเบสของ 16S rRNA บางส่วนของยีนต่อการศึกษาโดยใช้ไลบรารีโคลนลำดับล้านชิ้นส่วนต่อศึกษาโดยใช้เทคโนโลยีรุ่นต่อไปลำดับ 454 และ Illumina ตามเทคโนโลยีเหล่านี้ล่วงหน้า เป็นสำคัญเพื่อประเมินจุดแข็ง จุดอ่อน และความเหมาะสมโดยรวมของแพลตฟอร์มเหล่านี้สำหรับมืดของชุมชนจุลินทรีย์ ที่นี่ เรานำเสนอวิธีการปรับปรุงสำหรับตัวแปรภูมิภาคภายในยีน rRNA 16S ที่ใช้ของ Illumina MiSeq แพลตฟอร์ม ซึ่งในปัจจุบันสามารถผลิตจัดเป็นคู่ 250-นิวคลีโอไทด์อ่าน ลำดับเบส เราประเมินสามเหลื่อมแคว้น 16S rRNA ยีนที่แตกต่างกันในความยาว (เช่น V34, V4 และ V45) โดย resequencing ชุมชนจำลองและตัวอย่างทางธรรมชาติจากมนุษย์อุจจาระ อุจจาระเมาส์ และดิน โดย titrating ความเข้มข้นของ 16S rRNA ยีน amplicons กับเซลล์กระแส และใช้วิธีการตามคะแนนคุณภาพเพื่อแก้ไขความขัดแย้งระหว่างผู้อ่านที่ใช้ในการสร้าง contigs เราก็สามารถที่จะลดข้อผิดพลาดราคาอันดับสองเท่าของขนาด สุดท้าย เราประมวลผลตัวอย่างจากการศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นถึงว่า จำนวนตัวอย่างขนาดใหญ่สามารถเป็น multiplexed และเรียงลำดับควบคู่กับปืน metagenomes วิเคราะห์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า วิธีการของเราสามารถให้ข้อมูลที่น้อยเป็นดีที่สร้างจากแพลตฟอร์ม 454 ให้ครอบคลุมการจัดลำดับสูงมากสำหรับเศษส่วนของต้นทุน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีอย่างรวดเร็วในลำดับที่มีการเปลี่ยนแปลงภูมิทัศน์ของการทดลองของระบบนิเวศของจุลินทรีย์ ในช่วง 10 ปีที่ผ่านมาที่สนามได้ย้ายจากลำดับหลายร้อย 16S rRNA ชิ้นส่วนของยีนต่อการศึกษาการใช้ห้องสมุดโคลนกับลำดับของล้านชิ้นต่อการศึกษาโดยใช้เทคโนโลยีการจัดลำดับรุ่นต่อไปจาก 454 และ Illumina ในฐานะที่เป็นความก้าวหน้าของเทคโนโลยีเหล่านี้เป็นสิ่งสำคัญในการประเมินจุดแข็งจุดอ่อนและความเหมาะสมโดยรวมของแพลตฟอร์มเหล่านี้สำหรับการสอบสวนของชุมชนจุลินทรีย์ นี่เรานำเสนอวิธีการที่ดีขึ้นสำหรับภูมิภาคตัวแปรลำดับภายใน 16S rRNA ยีนใช้แพลตฟอร์ม MiSeq Illumina ซึ่งในขณะนี้มีความสามารถในการผลิตที่จับคู่ 250 อ่านเบื่อหน่าย เราประเมินสามภูมิภาคท​​ี่ทับซ้อนกันของยีน 16S rRNA ที่แตกต่างกันในความยาว (เช่น V34, V4 และ V45) โดย resequencing ชุมชนจำลองและธรรมชาติจากตัวอย่างอุจจาระของมนุษย์อุจจาระเมาส์และดิน โดยวิเคราะห์การความเข้มข้นของ 16S rRNA ยีน amplicons นำไปใช้กับเซลล์ไหลและการใช้วิธีการที่คะแนนตามคุณภาพในการแก้ไขความแตกต่างระหว่างคนอ่านใช้ในการสร้าง contigs เราก็สามารถที่จะลดอัตราความผิดพลาดได้มากถึงสองคำสั่งของขนาด สุดท้ายเรา reprocessed ตัวอย่างจากการศึกษาก่อนหน้าแสดงให้เห็นว่าจำนวนของกลุ่มตัวอย่างจะได้รับการ multiplexed และติดใจในแบบคู่ขนานกับ metagenomes ปืนลูกซอง การวิเคราะห์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าวิธีการของเราสามารถให้ข้อมูลที่มีอย่างน้อยดีเท่าที่สร้างขึ้นโดยแพลตฟอร์ม 454 ในขณะที่ให้ความคุ้มครองลำดับที่สูงขึ้นอย่างมากสำหรับส่วนของค่าใช้จ่าย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ก้าวหน้าอย่างรวดเร็วในระบบเทคโนโลยีมีการเปลี่ยนแปลงภูมิทัศน์ทดลองนิเวศวิทยาของจุลินทรีย์ ในช่วง 10 ปี สนามได้ย้ายจากหลายร้อยชิ้นส่วนเบส 16S rRNA ยีนต่อการศึกษาการใช้ห้องสมุดโคลนเพื่อจัดลำดับล้านเศษ ต่อโดยใช้เทคโนโลยีจากบริษัทดังกล่าวแล้ว Illumina ลำดับ . เหล่านี้เป็นเทคโนโลยีที่ก้าวหน้ามันเป็นสิ่งสำคัญที่จะประเมินจุดแข็ง จุดอ่อน และความเหมาะสมโดยรวมของแพลตฟอร์มเหล่านี้สำหรับการสอบสวนของชุมชนจุลินทรีย์ ที่นี่เรานำเสนอการปรับปรุงวิธีการลำดับเบส 16S rRNA ยีนตัวแปรภูมิภาคภายในใช้ Illumina อยู่ miseq แพลตฟอร์ม ซึ่งในปัจจุบันสามารถผลิต 250 คู่เบสและอ่านเราประเมินที่ทับซ้อนกันสามภูมิภาคของ 16S rRNA ยีนที่แตกต่างกันในความยาว ( เช่น v34 v4 , และ v45 ) โดย resequencing ชุมชนเยาะเย้ยและตัวอย่างธรรมชาติจากมนุษย์อุจจาระ เมาส์ อุจจาระ และดิน โดยความเข้มข้นของ 16S rRNA ยีน titrating amplicons ประยุกต์กับการไหลของเซลล์และการเข้าถึงคะแนนคุณภาพตามการแก้ไขความขัดแย้งระหว่างอ่านสูง เพื่อใช้สร้าง ,เราสามารถที่จะลดอัตราความผิดพลาด โดยเท่าที่สองสั่งขนาด สุดท้าย เราได้ปรับตัวอย่างจากการศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า ตัวเลขขนาดใหญ่ของคนและสามารถมัลติเพลกซ์นี้ขนานกับปืนลูกซอง metagenomes .การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงวิธีการที่เราสามารถให้ข้อมูลที่มีอย่างน้อยเท่าที่สร้างขึ้นโดย 454 แพลตฟอร์มในขณะที่ให้สูงมากการคุ้มครองสำหรับเศษส่วนของต้นทุน .