Molecular methodsFin tissue samples

Molecular methods

Fin tissue samples were frozen in 95% ethanol at −80°C until used. Total genomic DNA was extracted from the alcohol-preserved tissue with the proteinase K digestion and sodium dodecyl sulfate (SDS) extraction, high salt or phenol isolation and isopropanol precipitation procedure [20]. Three mitochondrial genes (16S, COI [cytochrome oxidase gene subunit I] and the complete Cyt b [cytochrome b],) and one nuclear protein-coding gene (Rag2) were amplified using polymerase chain reaction (PCR) with primer sequences given in Table S2.

All the mitochondrial and nuclear DNA PCR-amplifications, performed in 50 μl volume (37 μl of double distilled water, 5 μl of 10× PCR reaction buffer, 3 μl of 2.5mM dNTPs, 2 μl of BSA [bovine serum albumin], 1 μ of a 10 μM solution of each primer, 2.0 U Taq DNA polymerase [Sangon Inc., Shanghai, China] and about 100 ng of DNA template), were carried out using the following procedures: an initial denaturing step of 5 min at 94°C, followed by 35 cycles with denaturing 30 s at 94°C, annealing 60 s at 55°C, 50°C, 50°C and 55°C (for 16S, COI, Cyt b and Rag2, respectively), extending 60 s at 72°C and a final extension step of 10 min conducted at 72°C. After electrophoresis through a 1.5% agarose gel, all amplified DNA fragments were purified using UNIQ-10 spin column DNA gel extraction kit (Sangon Inc., Shanghai, China) according to manufacturers' instructions. Using the corresponding primers (Table S2), each fragment was sequenced in both directions with the BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) on an ABI 3730 automated sequencer.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีการระดับโมเลกุลตัวอย่างเนื้อเยื่อหูถูกแช่ใน 95% เอทานอลที่ −80 ° C จนกว่าจะใช้ รวม genomic DNA ที่สกัดจากเนื้อเยื่อเก็บแอลกอฮอล์สกัด proteinase K ย่อยอาหารและโซเดียม dodecyl ซัลเฟต (SDS) เกลือสูง หรือวางแยกและ isopropanol ฝนขั้นตอน [20] ยีน mitochondrial สาม (16S, COI [ย่อยยีน cytochrome oxidase ฉัน] และสมบูรณ์ Cyt b [cytochrome b],) และหนึ่งยีนสแตนนิวเคลียร์รหัสโปรตีน (Rag2) ได้ขยายการใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ใน S2 ตารางลำดับรองพื้นดำเนินการทั้งหมดที่นิวเคลียร์ และ mitochondrial DNA PCR-amplifications, μl ปริมาณ 50 (μl 37 คู่น้ำกลั่น μl 5 บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา PCR × 10, μl 3 ของ dNTPs 2.5mM, μl 2 ของบีเอสเอ [วัว serum albumin], μ 1 ของโซลูชัน 10 μM ละพื้น 2.0 U Taq DNA พอลิเมอเรส [Sangon Inc. เซี่ยงไฮ้ จีน] และ 100 ng ของดีเอ็นเอต้นแบบ) ได้ดำเนินการโดยใช้ขั้นตอนต่อไปนี้: เป็นขั้นตอน denaturing แรก 5 นาทีที่ 94° C ตามรอบ 35 กับ denaturing 30 s ที่ 94° C การอบเหนียว 60 s ที่ 55° C, 50° C, 50° C และ 55° C (สำหรับ 16S, COI, Cyt b และ Rag2 ตามลำดับ), ขยาย 60 s ที่ 72° C และ 10 นาทีขั้นสุดท้ายส่วนขยายดำเนินที่ 72 องศาเซลเซียส หลังจาก electrophoresis ผ่าน agarose วุ้น 1.5% ทุกชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เอาต์ได้บริสุทธิ์ใช้ UNIQ-10 หมุนคอลัมน์ดีเอ็นเอเจลแยกชุด (Sangon Inc. เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ใช้ไพรเมอร์ที่สอดคล้องกัน (ตาราง S2), แต่ละส่วนถูกเรียงลำดับในทั้งสองทิศทางด้วยการ BigDye เทอร์มิเนเตอร์วงจรลำดับเบสชุด (ใช้ Biosystems) บน sequencer ที่ 3730 ABI อัตโนมัติ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธีโมเลกุลครีบตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกแช่แข็งในเอทานอล 95% ที่ -80 องศาเซลเซียสจนใช้ ดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมดถูกสกัดจากเนื้อเยื่อของเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ที่เก็บรักษาไว้กับการย่อยอาหารโปร K และโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) สกัดเกลือสูงหรือแยกฟีนอลและ isopropanol ขั้นตอนฝน [20] สามยีนยล (16S, COI [subunit ยีน cytochrome เดส I] และสมบูรณ์ Cyt ข [cytochrome b]) และเป็นหนึ่งในยีนโปรตีนเข้ารหัสนิวเคลียร์ (Rag2) ถูกขยายโดยใช้วิธี polymerase chain reaction (PCR) ไพรเมอร์ที่มีลำดับในตาราง S2. ทั้งหมดยลดีเอ็นเอและนิวเคลียร์ PCR-amplifications ดำเนินการในปริมาณ 50 ไมโครลิตร (37 ไมโครลิตรน้ำกลั่นคู่ 5 ไมโครลิตร 10 × PCR บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 3 ไมโครลิตรของ 2.5mm dNTPs 2 ไมโครลิตรของบีเอสเอ [อัลบูมิซีรั่มวัว] 1 μของ 10 ไมครอนวิธีการแก้ปัญหาของแต่ละไพรเมอร์, 2.0 U Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ [Sangon อิงค์, เซี่ยงไฮ้, จีน] และประมาณ 100 นาโนกรัมของแม่แบบดีเอ็นเอ) ได้ดำเนินการโดยใช้วิธีการต่อไปนี้: ขั้นตอนเริ่มต้นของ denaturing 5 นาที ที่ 94 ° C ตามด้วย 35 รอบกับ denaturing 30 วินาทีที่ 94 องศาเซลเซียสอบ 60 s ที่ 55 ° C, 50 ° C, 50 ° C และ 55 ° C (สำหรับ 16S, COI, Cyt ขและ Rag2 ตามลำดับ) ขยาย 60 s ที่ 72 องศาเซลเซียสและเป็นขั้นตอนสุดท้ายของการขยายเวลา 10 นาทีดำเนินการที่ 72 ° C หลังจากผ่าน electrophoresis เจล agarose 1.5% ทุกชิ้นส่วนดีเอ็นเอขยายบริสุทธิ์โดยใช้ UNIQ-10 ดีเอ็นเอคอลัมน์หมุนชุดสกัดเจล (Sangon อิงค์, เซี่ยงไฮ้, จีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การใช้ไพรเมอร์ที่สอดคล้องกัน (ตารางที่ S2) แต่ละส่วนก็ติดใจในทั้งสองทิศทางกับ Terminator BigDye ชุดลำดับวงจร (Applied Biosystems) ในซีเควน ABI 3730 อัตโนมัติ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โมเลกุลวิธี

รอตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกแช่แข็งใน 95% เอทานอล ที่ 80 ° C −จนใช้ รวม genomic DNA ที่สกัดจากแอลกอฮอล์ รักษาเนื้อเยื่อกับโปรเค การย่อยอาหารและโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS ) สกัดเกลือสูงหรือการแยกฟีนอลและไอโซโพรพานอลด้วยกระบวนการ [ 20 ] สามการยีน ( 16S ,ลำปาง [ นกลุมพูยีนซึ่งผม ] และ [ b ] สมบูรณ์ cyt B - ) และนิวเคลียร์โปรตีนยีนนะครับ ( rag2 ) ขยายโดยใช้วิธีพีซีอาร์ ( PCR ) ด้วยไพรเมอร์ลำดับไว้ในโต๊ะ S2

ทุกอุตสาหกรรมและนิวเคลียร์ DNA PCR amplifications ดำเนินการใน 50 μ L ปริมาณ ( 37 μลิตรคู่น้ำกลั่น 5 μ L 10 × PCR ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ 3 μ dntps 2.5 ลิตร ,2 μ L ของ BSA [ อัลบูมิน ] , 1 μของ 10 μ M โซลูชั่นของแต่ละสี 2.0 คุณแทค DNA polymerase [ แสงอ่อนอิงค์ , เซี่ยงไฮ้ , จีน ] ประมาณ 100 ng ) เป็นแม่แบบดีเอ็นเอ โดยใช้ขั้นตอนต่อไปนี้ : เริ่มต้นี่ขั้น 5 นาทีที่ 94 ° C ตามด้วย 35 รอบด้วยี่ 30 s ที่ 94 ° C , การอบ 60 s ที่ 55 องศา C 50 ° C 50 ° C และ 55 ° C ( ( คง cyt B และ rag2 , , ,2 ) ขยาย 60 72 ° C และสุดท้ายขั้นตอนการขยาย 10 นาทีที่ 72 องศา หลังจากผ่านเจลอิเล็ก , 1.5% , ขยายดีเอ็นเอเป็นบริสุทธิ์ใช้ uniq-10 ปั่นคอลัมน์การสกัดดีเอ็นเอเจล ชุดจีน แสงอ่อน ( เซี่ยงไฮ้ ) ตามที่ผู้ผลิตแนะนำ โดยใช้ไพรเมอร์ที่สอดคล้องกัน ( ตาราง S1 )แต่ละส่วนเป็นลำดับในทั้งสองทิศทาง กับ bigdye Terminator รอบชุดจัดลำดับ ( Applied Biosystems ) บน ABI 940 มูลค่า .