2. Materials andmethods2.1. Larval

2. Materials andmethods
2.1. Larval supply and rearing protocol
Beluga specimens used in the present study were obtained by
the hormonally-induced (LHRHa2) spawning of 2 females that were
fertilized with the milt of 3 males at the Shahid Marjani Sturgeon
Center (Gorgan, Iran). Eggs were incubated in Yushchenko incubators
at 11–12 °C in a closed freshwater recirculation system. After
eight days of incubation, hatching took place (hatching rate: 68%)
and 1800 newly hatched larvae (body weight, BW: 15.6 ± 0.7 mg;
total length, TL: 11.2 ± 0.4 mm) were placed in three 500 l circular
fiberglass tanks connected to a flow-through freshwater system.
Malformation rate at hatching (11.2 mm TL) was 6.1%. During the
larval rearing period, water temperature, dissolved oxygen, pH
and flow rate were 16.5 ± 0.2 °C, 10.7 ± 0.3 mg/l, 7.8 ± 0.1 and
5.7 ± 0.4 l/min, respectively. Larvaewere reared under natural photoperiod
(37°4′30.62″ N, 54°40′10.45″ E). All tank surfaces were
scrubbed and the bottom of the tank siphoned to remove uneaten
feed and feces 3 times a day.
The feeding protocol used for H. huso larval rearing fromhatching to
the juvenile stage is summarized in Fig. 1. In brief, larvae were fed by a
mixture of Artemia nauplii (EG, INVE, Belgium) and Daphnia sp. from12
to 25 dph (199.2–432.5 degree days post hatch, ddph) (500–800
nauplii/larvae/day). A short co-feeding phase based on Cladocerans
and a compound diet (BioMar, Denmark; D1—particle size = 0.5 mm)
was conducted from 25 to 30 dph (432.5–534 ddph), whereas from
this age onward, fish were fed only with the inert feed (BioMar,
Denmark; D2—particle size = 0.8 mm) at a feeding rate of 30 and
20% of stocked fish biomass respectively. The compound diet was
given to larvae from 4-6 times per day and feed ration and particle
size were progressively adjusted for fish size from 25 to 50 dph
(432.5–906.5 ddph).
Proximate composition (dry matter) of live prey (Artemia nauplii
and Daphnia sp.) was determined in 3 samples per type of live prey.
Crude protein was determined by the Kjeldahl method (N × 6.25)
using an automatic Kjeldahl system (Behrotest WD 40, Germany) and
crude fat content was determined by Soxhlet method (Folch et al.,
1957). Total protein and lipid content in Artemia were 65.6 ± 1.4%
and 15.1 ± 0.2%, respectively, whereas Daphnia sp. contained 52.6 ±
1.9% of proteins and 11.1 ± 0.1% of lipids. The proximate composition
of compound diets (D1 and D2) was 63 and 58% of total protein, 11
and 15% of total lipids, and 11.6 and 11.5% total carbohydrate respectively
(data provided by feed manufacturer).
2.2. Fish growth measurements and sampling schedule
In order to determine larval growth in weight (BW) and total length
(TL), fish (n = 40)were daily sampled randomly prior to feeding in the
morning using a pipette with a large opening from hatching to 18 dph
(306 ddph), whereas samples were collected every 2 days from 18 to
50 dph (306–906.5 ddph). Sampled larvae were sacrificed with an
overdose of tricaine methanosulphonate (MS-222, Sigma-Aldrich,
Fig. 1. Feeding protocol and larval growth in total length and wet weight in Beluga (Huso
huso) fromhatching until 50 dph (906.5 ddph). Symbols: ○, bodyweight; Δ, total length.
At each sampling point, data represent mean value and its respective standard deviation
calculated from 40 specimens




Munich, Germany), rinsed in distilled water, and their TL and BW measured
to the nearest 0.01 mm and 0.1 g, respectively. Fish TL was measured
by means of a stereomicroscope equipped with a drawing tube
and micrometer (Zeizz, Oberkochen, Germany) and BW was determined
with an analytical microbalance (Mettler Toledo, XS 205,
Switzerland). Furthermore, dead larvae were removed and counted
2–3 times per day. From this data, cumulativemortality was calculated.
Larval malformation rate at hatching was 6.1%.
Samples (n = 100) for analysis of the digestive enzyme activities
were taken at hatching, 7, 14, 18, 23, 28, 35, 42 and 50 dph (0, 111.3,
235.2, 306, 400.2, 490, 612.5, 756 and 906.5 ddph respectively). No
food was added to the rearing tank the night prior to sampling, and larvaewere
sampled in the earlymorning tominimize the effects of exogenous
enzymes from live food in fish guts (Kolkovski, 2001) using a
pipette with a large opening. Sampled fish were washed in distilled
water, flash-frozen in liquid nitrogen and stored at−80 °C until further
analyses.
2.3. Sample preparation and enzyme determination
From hatching till 18 dph (306 ddph) the whole body of each larva
and from this age onward, the complete digestive system with the
exception of the intestine for pancreatic and gastric enzymes and
separated intestine for brush border enzyme were dissected over a
cold (0–4 °C) glass plate according to Cahu and Zambonino-Infante
(1994). Then, all samples except for the intestine were homogenized
(1: 9, w: v) in a buffer (100 mM Tris–HCl, 0.1 mM EDTA, 0.1% triton
X-100, pH = 7.8)with an electric homogenizer (Heidolph Instruments,
Germany). Tissue homogenateswere centrifuged at 30,000 g for 30 min
at 4 °C (Centrikon H-401 centrifuge, Kontron) and the supernatant
was collected and frozen at −80 °C until its analysis. In addition,
enterocytes' brush border extracts were prepared as described by
Crane et al. (1979). In brief, the intestinal regions of the digestive tract
were homogenized in 30 v/w fractions of Tris (2 mM)–mannitol
(50 mM), pH 7.0 for 30 s with an electric homogenizer (Heidolph
Instruments, Germany). Then, tissue homogenates were centrifuged at
9000 g for 10 min after the addition of 0.1 M CaCl2. The supernatants
were transferred to newvials and stored frozen (−80 °C) until analysis
of enzyme activity or protein content.
Pepsin (E.C.3.4.23.1) activity quantification was conducted according
to Rungruangsak and Utne (1981) using casein as substrate. In
brief, 200 μl of the crude enzyme extract wasmixed with 200 μl of substrate
(1% cazein solution in 60 mM HCl) and incubated for 10 min at
37 °C. The reaction was stopped with 1 ml of 5% trichloroacetic acid,
and after 30 min, tubes were centrifuged at 5000 g for 20 min at 4 °C.
Afterwards, 0.5 μl of the supernatant was incubated with 0.5 M NaOH
(1 ml) and Folin–Ciocalteu reagent (0.3 ml) for 10 min at 25 °C and
the absorbance of the supernatant measured at 720 nm. The range of
tyrosine standard curve was 0–50 μg tyrosine ml−1. One unit of pepsin
was defined as the μg of tyrosine released per minute and ml at 37 °C.
Trypsin (E.C.3.4.21.4) activity was measured with N-α-benzoyld
larginine-p-nitroanilide (BAPNA) as substrate. BAPNA (1 mM in 50 mM
Tris–HCl, 20 mM CaCl2, pH 7.5) was incubated with the enzyme extract
at 37 °C. Changes in absorbance were read at 410 nm for 10 min
(Erlanger et al., 1961). Chymotrypsin (EC. 3.4.21.1) activity wasmeasured
by using 0.1 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide (SAPNA) in 50 mM
Tris–HCl and 20 mMCaCl2 (pH = 7.5). The crude enzyme extract was incubated
with substrate at 37 °C and changes in absorbance (410 nm)
recorded for 3 min (Erlanger et al., 1961). Trypsin and chymotrypsin activity
units were expressed as change in absorbance per minute per mg
soluble protein and calculated by the following equation:
Unit=mg protein ¼ ðAbs410=minÞ  1000  ml of reaction mixture
8800 mg protein in reaction mixture :
Alpha-amylase (E.C.3.2.1.1) activity was determined according to
Worthington (1991) using starch as substrate. In brief, starch (1%)
was diluted in a 0.02 M Na2HPO4 and 0.006 M NaCl buffer (pH = 6.9)
and incubated with the enzyme crude extract for 4 min at 25 °C. Then,
0.5 ml of 1% dinitrosalicylic acid (DNS) solution was added and boiled
for 5 min. After boiling, 5 ml of distilledwaterwas added to the mixture
and the absorbance of the solution measured at 540 nm. Blanks were
similarly prepared, but without the crude enzyme extracts. Maltose
(0.3–5 μmol ml−1) was used for the preparation of the standard
curve. The α-amylase specific activity was defined by the μmol of maltose
produced per min per mg protein at 25 °C.
Lipase (E.C.3.1.1) activity was determined using nitrophenyl
myristate as substrate. Each assay (0.5 ml) contained 0.53 mM
p-nitrophenyl myristate, 0.25 mM 2-methoxyethanol, 5 mM sodium
cholate and 0.25 M Tris–HCl (pH = 9.0). Samples were incubated for
15 min at 30 °C, and the reaction was stopped by the addition of
0.7 ml of acetone/n-heptane (5:2, v/v). The reactionmixture was vigorously
mixed and centrifuged at 6080 g for 2 min and the absorbance of
the aqueous solution read at 405 nm. One unit of lipase was defined as
1 μmol of n-nitrophenol released per min (Iijima et al., 1998).
Alkaline phosphatase (E.C.3.1.3.1) from purified enterocytes' brush
borders was quantified at 37 °C using 4-nitrophenyl phosphate
(PNPP) as substrate in 30 mM Na2CO3 buffer (pH = 9.8). One unit
(U) was defined as 1 μg BTEE released per min per ml of brush border
homogenate at 407 nm (Bessey et al., 1946).
Total soluble protein was measured by the Bradford (1976) method
using bovine serum albumin as a standard. Enzyme activities were
expressed as specific activity (U mg/protein). All samples were analyzed
in triplicate (biological replicates) and each of them in triplicate
(methodological replicate).
2.4. Statistical analysis
Data were checked for normality (Kolmogorov–Smirnov test) and
homogeneity of variances (Bartlett's test) prior to their comparison.
All data are expressed as the mean ± SD (n = 3). Digestive enzyme
activities among different sampling times (ddph) were compared by
means of a one-way ANOVA, and themean

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุ andmethods2.1. larval ซัพพลายและการเพาะเลี้ยงโพรโทคอลปลาสเตอร์เจียนขาวไว้เป็นตัวอย่างใช้ในการศึกษาปัจจุบันได้รับโดยการเกิด hormonally (LHRHa2) วางไข่ของหญิง 2 ที่มีปฏิสนธิกับ milt ของชาย 3 ที่ปลาสเตอร์เจียน Marjani หิทศูนย์ (อาวาร์ อิหร่าน) ไข่ถูก incubated ใน Yushchenko ผลิตและที่ 11 – 12 ° C ในระบบปิดปลา recirculation หลังจากวันที่แปดของคณะทันตแพทยศาสตร์ ฟักไข่เกิดขึ้น (อัตราฟักไข่: 68%)และ 1800 เพิ่งฟักตัวอ่อน (ตัวน้ำหนัก BW: ไม่เกิน 15.6 ± 0.7 มก.รวมความยาว TL: 11.2 ± 0.4 mm) ไว้ในวง 500 l 3ถังไฟเบอร์เชื่อมต่อการไหลผ่านน้ำจืดระบบอัตรา malformation ที่ฟัก (11.2 mm TL) เป็น 6.1% ในระหว่างการเพาะเลี้ยงระยะเวลา อุณหภูมิน้ำ ส่วนยุบ larval ออกซิเจน ค่า pHและอัตราการไหล 16.5 ± 0.2 ° C, 10.7 ± 7.8 ± 0.1, 0.3 mg/l และ5.7 ± 0.4 l/min ตามลำดับ Larvaewere ผลิตภัณฑ์ภายใต้ช่วงแสงธรรมชาติ(37 ° 4′30 62″ N, 54 ° 40′10. 45″ อี) พื้นผิวของถังทั้งหมดได้scrubbed และด้านล่างของถัง siphoned เอา uneatenอาหารและอุจจาระวันละ 3 ครั้งโพรโทคอลอาหารใช้สำหรับ H. huso larval แม่ fromhatching ไปเวทีเยาวชนสรุปใน Fig. 1 สังเขป ตัวอ่อนถูกเลี้ยงโดยการส่วนผสมของ Artemia nauplii (EG, INVE เบลเยียม) และ Daphnia sp. from12การดีพีเอช 25 (ปริญญา 199.2 – 432.5 วันไปรษณีย์แฮทช์ ddph) (500-800nauplii/ตัว อ่อน/วัน) ระยะร่วมอาหารสั้นตาม Cladoceransและอาหารผสม (BioMar เดนมาร์ก ล่าสุดโดย — ขนาดอนุภาค = 0.5 mm)ได้ดำเนินการจาก 25 ไป 30 ดีพีเอช (432.5 – 534 ddph), ในขณะที่จากยุคนี้เป็นต้นไป ปลาถูกเลี้ยง ด้วยอาหาร inert (BioMarเดนมาร์ก D2 คือขนาดอนุภาค = 0.8 mm) ราคาอาหาร 30 และ20% ของเก็บปลาชีวมวลตามลำดับ อาหารผสมให้ตัวอ่อนจาก 4 - 6 ครั้งต่อวัน และอาหารอาหารและอนุภาคขนาดมีความก้าวหน้าปรับขนาดปลา 25 50 ดีพีเอช(432.5 – 906.5 ddph)องค์ประกอบ (เรื่องแห้ง) เคียงของเหยื่อสด (Artemia naupliiและ Daphnia sp) กำหนดใน 3 ตัวอย่างต่อชนิดของเหยื่อสดกำหนดน้ำมันโปรตีน ด้วยวิธี Kjeldahl (N × 6.25)ใช้ระบบ Kjeldahl การอัตโนมัติ (Behrotest WD 40 เยอรมนี) และไขมันน้ำมันถูกกำหนด โดยวิธี Soxhlet (Folch et al.,1957) รวมเนื้อหาโปรตีนและไขมันใน Artemia 65.6 ± 1.4%15.1 ± 0.2% ตามลำดับ ในขณะที่ Daphnia sp.อยู่ 52.6 ±1.9% ของโปรตีนและ 11.1 ± 0.1% ของโครงการ องค์ประกอบเคียงของผสมอาหาร (ง 1 และ D2) ถูก 63 และ 58% ของโปรตีนทั้งหมด 11และ 15% ของโครงการทั้งหมด และ 11.6 และ 11.5% รวมคาร์โบไฮเดรตตามลำดับ(ข้อมูลสำหรับผู้ผลิตอาหารสัตว์)2.2 การวัดการเจริญเติบโตและกำหนดการสุ่มตัวอย่างปลาเพื่อกำหนดเติบโต larval น้ำหนัก (BW) และความยาวรวม(TL), ปลา (n = 40) มีความทุกวันสุ่มก่อนการให้อาหารในการตอนเช้าใช้เปตต์แบบเปิดขนาดใหญ่จากฟักไข่ให้ 18 ดีพีเอช(306 ddph), ในขณะที่ตัวอย่างถูกเก็บทุก 2 วันจาก 18 ไป50 ดีพีเอช (306-906.5 ddph) ตัวอย่างตัวอ่อนได้เสียสละด้วยการใช้ยาเกินขนาดของ tricaine methanosulphonate (MS-222 ซิก-AldrichFig. 1 อาหารโพรโทคอลและเติบโต larval ยาวรวมและปลาสเตอร์เจียนขาว (Huso น้ำหนักเปียกfromhatching huso) จนถึง 50 ดีพีเอช (906.5 ddph) สัญลักษณ์: ○ bodyweight Δยอด ความยาวทั้งหมดในแต่ละจุดเก็บตัวอย่าง ข้อมูลแสดงค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของแต่ละคำนวณไว้เป็นตัวอย่างที่ 40มิวนิค เยอรมัน), rinsed ในน้ำกลั่น และ TL และ BW ของวัดมม. 0.01 และ 0.1 g ตามลำดับ มีวัดปลา TLโดย stereomicroscope พร้อมหลอดรูปวาดและกำหนด BW และไมโครมิเตอร์ (Zeizz, Oberkochen เยอรมนี)มีการวิเคราะห์ microbalance (Mettler Toledo, XS 205สวิตเซอร์แลนด์) นอกจากนี้ ตัวอ่อนตายถูกเอาออก และนับ2 – 3 ครั้งต่อวัน จากข้อมูลนี้ มีคำนวณ cumulativemortality6.1% อัตรา larval malformation ที่ฟักไข่ได้ตัวอย่าง (n = 100) สำหรับการวิเคราะห์ของกิจกรรมของเอนไซม์ย่อยอาหารถ่ายในขณะที่ฟักไข่ 7, 14, 18, 23, 28, 35, 42 และ 50 ดีพีเอช (0, 111.3235.2, 306, 400.2, 490, 612.5, 756 และ 906.5 ddph ตามลำดับ) ไม่ใช่อาหารเพิ่มถัง rearing คืนก่อนสุ่มตัวอย่าง และ larvaewereความใน earlymorning tominimize ผลของบ่อยเอนไซม์จากอาหารสดในปลากล้า (Kolkovski, 2001) โดยใช้การประหยัดพื้นที่ ด้วยเปิดขนาดใหญ่ ตัวอย่างปลาถูกล้างในกลั่นน้ำ แฟลชแช่ในไนโตรเจนเหลวและเก็บ at−80 ° C เป็นต้นไปวิเคราะห์2.3 ตัวอย่างกำหนดเตรียมและเอนไซม์จากฟักจนถึง 18 ดีพีเอช (306 ddph) หนอนแต่ละตัวทั้งหมดและจากนี้อายุเป็นต้นไป ระบบย่อยอาหารให้สมบูรณ์ด้วยการข้อยกเว้นสำหรับเอนไซม์ในกระเพาะอาหาร และตับอ่อนลำไส้ และลำไส้แยกสำหรับแปรงเส้นขอบเอนไซม์ถูก dissected ผ่านการเย็น (0-4 ° C) แก้วจานตาม Cahu และ Zambonino อองฟองต์(1994) แล้ว ตัวอย่างทั้งหมดยกเว้นลำไส้ถูก homogenized เป็นกลุ่ม(1:9 ไร w: v) ในบัฟเฟอร์ (100 มม.ตรี – HCl, EDTA ไตรตั้น 0.1 0.1 มม.X-100, pH = 7.8) ด้วย homogenizer การไฟฟ้า (เครื่องมือ Heidolphเยอรมนี) เนื้อเยื่อ homogenateswere centrifuged ที่ g 30000 สำหรับ 30 นาทีที่ 4 ° C (Centrikon H-401 เครื่องหมุนเหวี่ยง Kontron) และ supernatantถูกรวบรวม และน้ำแข็งที่ −80 ° C จนถึงการวิเคราะห์การ นอกจากนี้enterocytes' แปรงขอบบางส่วนได้เตรียมไว้ตามที่อธิบายไว้โดยเครนและ al. (1979) อย่างย่อ แคว้นทางเดินอาหารลำไส้มี homogenized เป็นกลุ่ม 30 v/w บางส่วนของทริสเรทติ้ง (มม. 2) – mannitol(50 mM), ค่า pH 7.0 สำหรับ 30 s ด้วย homogenizer การไฟฟ้า (Heidolphเครื่องมือ เยอรมนี) แล้ว มี centrifuged homogenates เนื้อเยื่อที่g 9000 ใน 10 นาทีหลังจากการเพิ่ม 0.1 M CaCl2 Supernatantsโอนย้ายไปที่ newvials และเก็บแช่แข็ง (−80 ° C) จนถึงการวิเคราะห์ของเอนไซม์โปรตีนหรือกิจกรรมเนื้อหาเพพซิน (E.C.3.4.23.1) กิจกรรมนับได้ดำเนินการตามRungruangsak และ Utne (1981) ใช้เคซีนเป็นพื้นผิว ในย่อ μl 200 ของ wasmixed สารสกัดจากเอนไซม์ดิบ ด้วย μl 200 ของพื้นผิว(1% cazein โซลูชันใน 60 มม. HCl) และ incubated สำหรับที่ 10 นาที37 องศาเซลเซียส หยุดปฏิกิริยา ด้วย 1 มล.ของ 5% trichloroacetic กรดและหลังจาก 30 นาที หลอดถูก centrifuged ที่ g 5000 สำหรับ 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียสภายหลัง μl 0.5 ของ supernatant ถูก incubated กับ 0.5 M NaOH(1 ml) และรีเอเจนต์ Folin-Ciocalteu (0.3 มล.) ใน 10 นาทีที่ 25 ° C และวัด absorbance ของ supernatant 720 nm ช่วงของเส้นโค้งมาตรฐาน tyrosine 0 – 50 μg tyrosine ml−1 หน่วยหนึ่งของเพพซินถูกกำหนดเป็น μg ของ tyrosine ออกต่อนาทีและ ml ที่ 37 องศาเซลเซียสกิจกรรมทริปซิน (E.C.3.4.21.4) ถูกวัด ด้วย N-α-benzoyldlarginine-p-nitroanilide (BAPNA) เป็นพื้นผิว BAPNA (1 มม. 50 มม.Tris–HCl, CaCl2, 20 มม.ค่า pH 7.5) ถูก incubated สกัดจากเอนไซม์ที่ 37 องศาเซลเซียส มีอ่านเปลี่ยนแปลง absorbance ที่ 410 nm สำหรับ 10 นาที(Erlanger et al., 1961) Wasmeasured กิจกรรม chymotrypsin (EC. 3.4.21.1)โดยใช้ 0.1 มม. Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide (ซัพนา) ใน 50 มม.ทริสเรทติ้ง – HCl และ 20 mMCaCl2 (ค่า pH = 7.5) สารสกัดจากเอนไซม์ดิบถูก incubatedมีพื้นผิวที่ 37 ° C และเปลี่ยนแปลง absorbance (410 nm)บันทึกใน 3 นาที (Erlanger et al., 1961) ทริปซินและ chymotrypsinหน่วยถูกแสดงเป็นการเปลี่ยนแปลง absorbance ต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีนที่ละลายน้ำได้ และคำนวณได้ โดยสมการต่อไปนี้:หน่วย =มิลลิกรัมโปรตีน¼ ðAbs410 = minÞ 1000 ml ของส่วนผสมของปฏิกิริยาส่วนผสมของปฏิกิริยา: 8800 มิลลิกรัมโปรตีนกำหนดตามกิจกรรม (E.C.3.2.1.1) แอลฟา-amylaseธธิง (1991) ใช้แป้งเป็นพื้นผิว อย่างย่อ แป้ง (1%)ถูกทำให้เจือจางใน 0.02 M Na2HPO4 และ 0.006 M NaCl บัฟเฟอร์ (pH = 6.9)และ incubated สกัดจากเอนไซม์ดิบสำหรับ 4 นาทีที่ 25 องศาเซลเซียส แล้ว0.5 ml ของโซลูชัน (DNS) กรด dinitrosalicylic 1% เพิ่ม และต้มใน 5 นาที หลังจากเดือด 5 ml ของ distilledwaterwas เพิ่มลงในส่วนผสมและวัด absorbance ของโซลูชันที่ 540 nm มีช่องว่างเตรียมทำนองเดียวกัน แต่ไม่ มีเอนไซม์ดิบสารสกัด Maltose(0.3 – 5 μmol ml−1) ใช้สำหรับการจัดทำมาตรฐานเส้นโค้ง Α-amylase กิจกรรมถูกกำหนด โดย μmol ของ maltoseผลิตต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีนที่ 25 องศาเซลเซียสกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปส (E.C.3.1.1) ถูกกำหนดโดยใช้ nitrophenylmyristate เป็นพื้นผิว วิเคราะห์แต่ละ (0.5 ml) อยู่ 0.53 มม.p nitrophenyl myristate โซเดียม 5 mM, 0.25 mM 2-methoxyethanolcholate และ 0.25 M ตรี – HCl (ค่า pH = 9.0) ตัวอย่างที่ incubated สำหรับ15 นาทีที่ 30 ° C และปฏิกิริยาถูกหยุดลง โดยการเพิ่มมล 0.7 ของอะซี โตน/n-heptane (5:2, v/v) Reactionmixture เป็นดั่งผสม และ centrifuged ที่ 6080 g 2 นาทีและ absorbance ของละลายที่อ่านที่ 405 nm หน่วยหนึ่งของเอนไซม์ไลเปสที่ถูกกำหนดเป็นΜmol 1 ของ n-nitrophenol ออกต่อนาที (Iijima et al., 1998)อัลคาไลน์ฟอสฟาเตสที่ (E.C.3.1.3.1) จากบริสุทธิ์ enterocytes แปรงเส้นขอบถูก quantified ที่ 37 ° C ใช้ฟอสเฟต 4-nitrophenyl(PNPP) เป็นพื้นผิวใน 30 มม. Na2CO3 บัฟเฟอร์ (pH = 9.8) หนึ่งหน่วย(U) ถูกกำหนดเป็น 1 μg BTEE ออกต่อนาทีต่อ ml แปรงเส้นขอบhomogenate ที่ 407 nm (Bessey et al., 1946)โปรตีนที่ละลายน้ำทั้งหมดถูกวัด โดยวิธีแบรดฟอร์ด (1976)ใช้วัว serum albumin เป็นมาตรฐาน กิจกรรมของเอนไซม์ได้แสดงเป็นกิจกรรมเฉพาะ (mg U โปรตีน) มีวิเคราะห์ตัวอย่างทั้งหมดtriplicate (เหมือนกับชีวภาพ) และแต่ละของพวกเขาใน triplicate(methodological จำลอง)2.4. สถิติวิเคราะห์ข้อมูลถูกตรวจสอบ normality (การทดสอบน่าเป็น – Smirnov) และhomogeneity ของผลต่าง (การทดสอบของในบาร์ตเลต) ก่อนการเปรียบเทียบข้อมูลทั้งหมดจะแสดงในรูปเฉลี่ย± SD (n = 3) เอนไซม์ย่อยอาหารกิจกรรมระหว่างการสุ่มตัวอย่างที่แตกต่างเวลา (ddph) ได้เปรียบเทียบโดยหมายถึงการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว และ themean

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุ andmethods
2.1 การจัดหาและการเลี้ยงตัวอ่อนโปรโตคอล
ตัวอย่าง Beluga ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ได้จากการ
เหนี่ยวนำให้เกิดฮอร์โมน (LHRHa2) วางไข่ของ 2 หญิงที่ได้รับการ
ปฏิสนธิกับน้ำเชื้อของเพศที่ 3 Shahid Marjani ปลาสเตอร์เจียน
เซ็นเตอร์ (Gorgan อิหร่าน) ไข่ถูกบ่มในตู้อบหลักปฏิบัติ
ที่ 11-12 ° C ในระบบหมุนเวียนน้ำจืดปิด หลังจาก
แปดวันของการบ่มฟักเกิดขึ้น (อัตราการฟัก: 68%)
และ 1,800 ตัวอ่อนที่เพิ่งฟัก (น้ำหนักตัว BW: 15.6 ± 0.7 มิลลิกรัม
ยาวทั้งหมด, TL: 11.2 ± 0.4 มม) อยู่ในสาม l 500 วงกลม
ไฟเบอร์กลาส รถถังที่เชื่อมต่อกับระบบน้ำจืดที่ไหลผ่าน.
อัตราจุกที่ฟัก (11.2 มม TL) เป็น 6.1% ในช่วง
ระยะเวลาการเลี้ยงตัวอ่อนอุณหภูมิของน้ำ, ปริมาณออกซิเจนละลายน้ำมีค่า pH
และอัตราการไหลอยู่ที่ 16.5 ± 0.2 ° C, 10.7 ± 0.3 มิลลิกรัม / ลิตร, 7.8 ± 0.1 และ
5.7 ± 0.4 ลิตร / นาทีตามลำดับ Larvaewere เลี้ยงภายใต้แสงธรรมชาติ
(37 ° 4'30.62 "N, 54 ° 40'10.45" E) พื้นผิวถังทั้งหมดถูก
ขัดและด้านล่างของถังดูดเพื่อลบกะหรี่
อาหารสัตว์และอุจจาระวันละ 3 ครั้ง.
โปรโตคอลที่ใช้สำหรับการให้อาหารเอชกระดูกแข็งอนุบาล fromhatching เพื่อ
เวทีเด็กและเยาวชนได้สรุปไว้ในรูป 1. ในช่วงสั้น ๆ ตัวอ่อนได้รับการเลี้ยงดูโดย
ส่วนผสมของอาร์ทีเมีย (เช่น INVE, เบลเยียม) และไรน้ำ from12
ถึง 25 DPH (199.2-432.5 องศาวันที่โพสต์ฟัก ddph) (500-800
อาร์ที / ลูกน้ำ / วัน) ขั้นตอนการร่วมให้อาหารระยะสั้นขึ้นอยู่กับไรแดง
และอาหารผสม (BIOMAR, เดนมาร์กขนาด D1-อนุภาค = 0.5 มม)
ได้ดำเนินการ 25-30 DPH (432.5-534 ddph) ในขณะที่จาก
วัยนี้เป็นต้นไปปลาเป็นอาหารเท่านั้น กับฟีดเฉื่อย (BIOMAR,
เดนมาร์กขนาด D2-อนุภาค = 0.8 มิลลิเมตร) อัตราการเลี้ยงลูกด้วยนม 30 และ
20% ของชีวมวลปลา stocked ตามลำดับ อาหารสารประกอบถูก
มอบให้กับตัวอ่อน 4-6 ครั้งต่อวันและสูตรอาหารและอนุภาค
ขนาดมีการปรับก้าวหน้าขนาดปลา 25-50 DPH
(432.5-906.5 ddph).
วิเคราะห์องค์ประกอบทางเคมี (แห้ง) ของเหยื่อสด (อาร์ทีเมีย
และไรน้ำ.) ได้กำหนดใน 3 ตัวอย่างต่อประเภทของเหยื่อสด.
โปรตีนถูกกำหนดโดยวิธี Kjeldahl (ยังไม่มี× 6.25)
โดยใช้ระบบ Kjeldahl อัตโนมัติ (Behrotest WD 40, เยอรมนี) และ
ปริมาณไขมันดิบถูกกำหนดโดยวิธีการวิธีการสกัดแบบ (Folch et al.,
1957) โปรตีนรวมและไขมันในอาร์ทีเมีย 65.6 ± 1.4%
และ 15.1 ± 0.2% ตามลำดับในขณะที่ไรน้ำ มีอยู่ 52.6 ±
1.9% ของโปรตีนและ 11.1 ± 0.1% ของไขมัน องค์ประกอบใกล้เคียง
ของอาหารผสม (D1 และ D2) เป็น 63 และ 58% ของโปรตีนทั้งหมด, 11
และ 15% ของไขมันทั้งหมดและ 11.6 และ 11.5% คาร์โบไฮเดรตรวมตามลำดับ
(ข้อมูลจาก บริษัท ผู้ผลิตอาหารสัตว์).
2.2 การวัดการเจริญเติบโตของปลาและกำหนดเวลาการเก็บตัวอย่าง
เพื่อตรวจสอบการเจริญเติบโตของตัวอ่อนในน้ำหนัก (BW) และความยาวทั้งหมด
(TL) ปลา (n = 40) ได้รับการสุ่มเก็บตัวอย่างทุกวันก่อนที่จะมีการให้อาหารใน
ช่วงเช้าโดยใช้ปิเปตด้วยการเปิดขนาดใหญ่จากการฟักไข่ 18 DPH
(306 ddph) ในขณะที่กลุ่มตัวอย่างที่ถูกเก็บรวบรวมทุก 2 วันจาก 18 ถึง
50 DPH (306-906.5 ddph) ตัวอ่อนตัวอย่างถูกเสียสละกับ
ยาเกินขนาดของ tricaine methanosulphonate (MS-222, Sigma-Aldrich,
รูป. 1. โปรโตคอลการให้อาหารและการเจริญเติบโตของตัวอ่อนในความยาวทั้งหมดและน้ำหนักเปียกใน Beluga (Huso
huso) fromhatching จนถึง 50 DPH (906.5 ddph). สัญลักษณ์ :. ○, น้ำหนัก; Δ, ความยาวทั้งหมด
ในแต่ละจุดเก็บตัวอย่างข้อมูลที่แสดงค่าเฉลี่ยและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของแต่ละ
คำนวณจาก 40 ตัวอย่างมิวนิค, เยอรมนี) ล้างในน้ำกลั่นและ TL และ BW ของพวกเขาวัดที่ใกล้ที่สุด 0.01 มิลลิเมตรและ 0.1 กรัมตามลำดับ ปลา TL วัดโดยวิธีการของสเตอริโอพร้อมกับหลอดภาพวาดและไมโครเมตร (Zeizz, Oberkochen, เยอรมนี) และ BW ถูกกำหนดด้วยไมโครวิเคราะห์ (Mettler Toledo, XS 205, วิตเซอร์แลนด์) นอกจากนี้ตัวอ่อนตายถูกถอดออกและนับ2-3 ครั้งต่อวัน จากข้อมูลนี้ cumulativemortality ที่คำนวณได้. อัตราจุกตัวอ่อนที่ฟักเป็น 6.1%. ตัวอย่าง (n = 100) สำหรับการวิเคราะห์การทำงานของเอนไซม์ย่อยอาหารถูกนำมาที่ฟัก, 7, 14, 18, ​​23, 28, 35, 42 และ 50 DPH (0, 111.3, 235.2, 306, 400.2, 490, 612.5, 906.5 และ 756 ddph ตามลำดับ) ไม่มีอาหารถูกบันทึกอยู่ในถังเลี้ยงคืนก่อนที่จะมีการเก็บตัวอย่างและ larvaewere ตัวอย่างใน earlymorning tominimize ผลกระทบจากภายนอกเอนไซม์จากอาหารสดในความกล้าปลา (Kolkovski, 2001) โดยใช้ปิเปตด้วยการเปิดขนาดใหญ่ ตัวอย่างปลาถูกล้างในกลั่นน้ำแฟลชแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ 80 องศาเซลเซียสจนกระทั่งต่อการวิเคราะห์. 2.3 การเตรียมตัวอย่างและความมุ่งมั่นของเอนไซม์จากฟักจนถึง 18 DPH (306 ddph) ร่างกายของแต่ละตัวอ่อนและจากวัยนี้เป็นต้นไประบบการย่อยอาหารที่สมบูรณ์แบบด้วยข้อยกเว้นของลำไส้สำหรับตับอ่อนและเอนไซม์ในกระเพาะอาหารและลำไส้แยกแปรงเอนไซม์ชายแดนถูกชำแหละ ในช่วงเย็น (0-4 ° C) แผ่นกระจกตาม Cahu และ Zambonino-Infante (1994) จากนั้นกลุ่มตัวอย่างทั้งหมดยกเว้นสำหรับลำไส้ถูกหดหาย(1: 9, w: V) ในบัฟเฟอร์ (100 มิลลิ Tris-HCl, 0.1 มิลลิ EDTA, 0.1% Triton X-100, ค่า pH = 7.8) กับโฮโมจีไนไฟฟ้า (Heidolph เครื่องดนตรี, เยอรมนี) เนื้อเยื่อ homogenateswere หมุนเหวี่ยงที่ 30,000 กรัมเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 4 ° C (Centrikon H-401 centrifuge, Kontron) และใสถูกเก็บรวบรวมและแช่แข็งที่ -80 ° C จนการวิเคราะห์ นอกจากนี้enterocytes 'สารสกัดจากชายแดนแปรงได้จัดทำขึ้นตามที่อธิบายไว้โดยเครนและคณะ (1979) ในช่วงสั้น ๆ ภูมิภาคในลำไส้ของระบบทางเดินอาหารถูกหดหายใน 30 V / w เศษส่วนของ Tris (2 มิลลิ) -mannitol (50 มิลลิเมตร), ค่า pH 7.0 สำหรับ 30 วินาทีกับโฮโมจีไนไฟฟ้า (Heidolph เครื่องดนตรี, เยอรมนี) จากนั้น homogenates เนื้อเยื่อถูกหมุนเหวี่ยงที่9000 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีหลังจากที่นอกเหนือจาก 0.1 M CaCl2 supernatants ถูกย้ายไป newvials และจัดเก็บแช่แข็ง (-80 ° C) จนถึงการวิเคราะห์ของเอนไซม์หรือโปรตีน. Pepsin (EC3.4.23.1) ปริมาณกิจกรรมที่ได้ดำเนินการตามที่จะ Rungruangsak และ Utne (1981) โดยใช้เคซีนเป็นสารตั้งต้น ในช่วงสั้น ๆ 200 ไมโครลิตรของสารสกัดจากเอนไซม์ wasmixed กับ 200 ไมโครลิตรของพื้นผิว(1% วิธีการแก้ปัญหาใน cazein 60 มิลลิเมตร HCl) และบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่37 องศาเซลเซียส ปฏิกิริยาจะถูกหยุดอยู่กับที่ 1 มิลลิลิตร 5% กรดไตรคลอโร, และหลังจาก 30 นาที, หลอดถูกหมุนเหวี่ยงที่ 5000 กรัมเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 ° C. หลังจากนั้น 0.5 ไมโครลิตรของสารละลายถูกบ่ม 0.5 M NaOH (1 มิลลิลิตร) และ น้ำยา Folin-Ciocalteu (0.3 ml) เป็นเวลา 10 นาทีที่ 25 ° C และการดูดกลืนแสงของสารละลายวัดที่ 720 นาโนเมตร ช่วงของซายน์โค้งมาตรฐาน 0-50 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร tyrosine-1 หนึ่งหน่วยของน้ำย่อยถูกกำหนดเป็นไมโครกรัมของซายน์การปล่อยตัวต่อนาทีและ ml ที่ 37 ° C. Trypsin (EC3.4.21.4) กิจกรรมได้รับการวัดที่มี N-α-benzoyld larginine-P-nitroanilide (Bapna) เป็นสารตั้งต้น Bapna (1 มิลลิใน 50 mM Tris-HCl, 20 มิลลิ CaCl2 ค่า pH 7.5) ถูกบ่มด้วยสารสกัดจากเอนไซม์ที่อุณหภูมิ 37 ° C การเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงที่ถูกอ่านได้ที่ 410 นาโนเมตรเป็นเวลา 10 นาที(Erlanger et al., 1961) chymotrypsin (EC. 3.4.21.1) กิจกรรม wasmeasured โดยใช้ 0.1 มิลลิ Suc-Ala-Ala-Pro เพ-P-nitroanilide (Sapna) ใน 50 mM Tris-HCl และ 20 mMCaCl2 (pH = 7.5) สารสกัดจากเอนไซม์ถูกบ่มกับสารตั้งต้นที่ 37 องศาเซลเซียสและการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสง (410 นาโนเมตร) บันทึกไว้เป็นเวลา 3 นาที (Erlanger et al., 1961) trypsin และกิจกรรม chymotrypsin หน่วยกำลังแสดงการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีนที่ละลายน้ำและคำนวณโดยสมการต่อไปนี้: หน่วย = โปรตีนมิลลิกรัม¼ðAbs410 = มิ้นท์? 1000? มิลลิลิตรปฏิกิริยาส่วนผสมโปรตีน 8800 มิลลิกรัมผสมปฏิกิริยา: อัลฟาอะไมเลส (EC3.2.1.1) กิจกรรมที่ถูกกำหนดขึ้นมาตามวอร์ชิงตัน (1991) ใช้แป้งเป็นสารตั้งต้น ในช่วงสั้น ๆ แป้ง (1%) ถูกเจือจางใน 0.02 M Na2HPO4 และ 0.006 M บัฟเฟอร์โซเดียมคลอไรด์ (pH = 6.9) และบ่มด้วยสารสกัดจากเอนไซม์ 4 นาทีที่ 25 ° C แล้ว0.5 มล 1% dinitrosalicylic กรด (DNS) การแก้ปัญหาถูกเพิ่มเข้ามาและต้มเป็นเวลา 5 นาที หลังจากที่เดือด 5 มิลลิลิตร distilledwaterwas เพิ่มส่วนผสมและการดูดกลืนแสงของการแก้ปัญหาวัดที่ 540 นาโนเมตร ช่องว่างที่ถูกจัดทำขึ้นในทำนองเดียวกัน แต่ไม่มีสารสกัดเอนไซม์ มอลโตส(0.3-5 ไมโครโมลมล-1) ถูกนำมาใช้ในการจัดทำมาตรฐานทางโค้ง αอะไมเลสกิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงได้รับการกำหนดโดยไมโครโมลของมอลโตสที่ผลิตต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีนที่ 25 ° C. เอนไซม์ไลเปส (EC3.1.1) กิจกรรมที่ถูกกำหนดโดยใช้ nitrophenyl myristate เป็นสารตั้งต้น แต่ละการทดสอบ (0.5 ml) มี 0.53 มิลลิP-nitrophenyl myristate, 0.25 มิลลิ 2 methoxyethanol โซเดียม 5 มิลลิคอลเลตและ 0.25 M Tris-HCl (pH = 9.0) ตัวอย่างที่ถูกบ่มเป็นเวลา15 นาทีที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสและปฏิกิริยาก็หยุดโดยนอกเหนือจาก0.7 มิลลิลิตรของอะซิโตน / n-heptane (5: 2, v / v) reactionmixture เป็นแรงผสมและหมุนเหวี่ยงที่ 6080 กรัมเป็นเวลา 2 นาทีและการดูดกลืนแสงของสารละลายอ่านได้ที่ 405 นาโนเมตร หนึ่งหน่วยของเอนไซม์ไลเปสที่ถูกกำหนดให้เป็น1 ไมโครโมล n-nitrophenol ปล่อยออกมาต่อนาที (Iijima et al., 1998). phosphatase อัลคาไลน์ (EC3.1.3.1) จาก enterocytes บริสุทธิ์ 'แปรงชายแดนได้รับการวัดที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสโดยใช้ 4-nitrophenyl ฟอสเฟต(PNPP) เป็นสารตั้งต้นในการบัฟเฟอร์ 30 มิลลิ Na2CO3 (pH = 9.8) หนึ่งหน่วย(U) ถูกกำหนดเป็น 1 ไมโครกรัม BTEE ปล่อยออกมาต่อนาทีต่อมิลลิลิตรชายแดนแปรงhomogenate ที่ 407 นาโนเมตร (Bessey et al., 1946). โปรตีนที่ละลายน้ำทั้งหมดโดยวัดจากแบรดฟอ (1976) วิธีการใช้ซีรั่มอัลบูมิวัวเป็น มาตรฐาน กิจกรรมของเอนไซม์ถูกแสดงเป็นกิจกรรมที่เฉพาะเจาะจง (U mg / โปรตีน) ตัวอย่างทั้งหมดถูกนำมาวิเคราะห์ในเพิ่มขึ้นสามเท่า (ซ้ำชีวภาพ) และแต่ละของพวกเขาในการเพิ่มขึ้นสามเท่า(วิธีการทำซ้ำ). 2.4 การวิเคราะห์ทางสถิติข้อมูลการตรวจสอบปกติ (ทดสอบ Kolmogorov-Smirnov) และความสม่ำเสมอของความแปรปรวน (ทดสอบของบาร์ตเลตต์) ก่อนที่จะมีการเปรียบเทียบของพวกเขา. ข้อมูลทั้งหมดจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD (n = 3) เอนไซม์ย่อยอาหารกิจกรรมในหมู่ครั้งสุ่มตัวอย่างที่แตกต่างกัน (ddph) ถูกนำมาเปรียบเทียบโดยวิธีการทางเดียว ANOVA และ themean