Recombinant expression and protein

Recombinant expression and protein purification

E. coli BL21 (DE3) Omp8 Rosetta host strain was transformed with the plasmid pET23d(+)/chiP. Expression and preparation of the recombinant ChiP followed the protocols described by Garavito and Rosenbusch [15] and Rosenbusch [16]. In brief, transformed cells were grown at 37°C in Luria-Bertani (LB) liquid medium containing 100 µg.mL−1 ampicillin and 25 µg mL−1 kanamycin. At an OD600 reading of 0.5–0.7, IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside) was added to a final concentration of 0.5 mM. Cell growth was continued for a further 6 h and cells were then harvested by centrifugation at 4,500×g at 4°C for 20 min. The cell pellet was resuspended in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.5 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2, 10 µg.mL−1 DNase I and 10 µg mL−1 RNase A. Cells were lysed on ice by sonication for 10 min (30% duty cycle; amplitude setting 20%) using a Sonopuls Ultrasonic homogenizer with a 6-mm-diameter probe. The recombinant VhChiP was extracted from the peptidoglycan layer with sodium dodecyl sulphate (SDS) based on the method of Lugtenberg and Alphen [17]. Briefly, SDS was added to the cell suspension to a final concentration of 2% (v/v) and incubation was carried out for 1 h at 60°C with gentle shaking. The crude extract was then centrifuged at 40,000×g for 60 min at 4°C. The pellet, which at this stage included the cell envelopes, was re-suspended in 20 mM phosphate buffer, pH 7.4, containing 0.125% (v/v) octyl-POE (n-octyl polyoxyethylene; ALEXIS Biochemicals, Lausanne, Switzerland), using a Potter-Elvehjem homogenizer. The suspension was incubated at 37°C with gentle shaking for 1 h and then centrifuged at 100 000×g at 4°C for 40 min. The new pellet, now rich in outer membranes, was resuspended in 20 mM phosphate buffer, pH 7.4 containing 5% (v/v) octyl-POE and the suspension incubated at 37°C for 60 min. Insoluble material was removed by centrifugation at 100,000×g at 20°C for 40 min. After exchange of the detergent to 0.2% (v/v) LDAO (lauryldimethylamine oxide; Sigma-Aldrich Pte. Ltd., Singapore) by dialysis, the VhChiP-rich sample was subjected to ion-exchange chromatography using a Hitrap Q HP prepacked column (5×1 mL) connecting to an ÄKTA Prime plus FPLC system (GE Healthcare Life Sciences, Life Sciences Instruments, ITS (Thailand) Co., Ltd., Bangkok, Thailand). Bound proteins were eluted with a linear gradient of 0–1 M KCl in the phosphate buffer, containing 0.2% (v/v) LDAO. Purity of the eluted proteins was confirmed by SDS-PAGE. Fractions containing only VhChiP were pooled and the protein concentration was determined using the Pierce BCA protein assay kit (Bio-Active Co., Ltd., Bangkok, Thailand).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Recombinant นิพจน์และโปรตีนบริสุทธิ์E. coli BL21 (DE3) Omp8 Rosetta โฮสต์พันธุ์ซ้อนกับ plasmid pET23d (+) / ชิ นิพจน์และการเตรียมการของ recombinant ชิตามโพรโทคอลที่อธิบาย โดย Garavito และ Rosenbusch [15] และ Rosenbusch [16] สังเขป รับการเปลี่ยนแปลงเซลล์ที่ปลูกที่ 37° C ในสื่อของเหลว Luria-Bertani (ปอนด์) ที่ประกอบด้วย 100 โกคอ µg.mL−1 และ mL−1 25 µg กานามัยซิน เวลาอ่านที่ OD600 ของ 0.5 – 0.7, IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside) ถูกสุดท้ายเข้มข้น 0.5 mM เติบโตของเซลล์ได้อย่างต่อเนื่องสำหรับการเพิ่มเติม 6 h และเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวแล้ว โดยหมุนเหวี่ยงที่ 4, 500 × g ที่ 4° C 20 นาที เม็ดเซลล์ถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 20 มม.ทริสเรทติ้ง HCl, pH 8.0, 2.5 มม. MgCl2, CaCl2, 10 µg.mL−1 DNase 0.1 mM ผมและ 10 µg mL−1 RNase A. เซลล์ได้นาทีที่ 37uc บนน้ำแข็ง โดย sonication สำหรับ 10 นาที (รอบ 30% คลื่นตั้ง 20%) ใช้เครื่อง homogenizer อัลตราโซนิก Sonopuls กับโพรบ 6 มม. Recombinant VhChiP ถูกแยกจากชั้นเปบทิโดไกลแคนกับโซเดียมซัลเฟต dodecyl (SDS) ตามวิธีของ Lugtenberg และอัลเฟน [17] สั้น ๆ SDS ถูกระงับเซลล์เพื่อสุดท้ายเข้มข้น 2% (v/v) และกกไข่ได้ดำเนินการสำหรับ h 1 ที่ 60° C ด้วยการสั่นเบา ๆ สารสกัดจากน้ำมันดิบแล้วได้ผลิตภัณฑ์ที่ 40, 000 × g สำหรับ 60 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส เม็ด ซึ่งในขั้นตอนนี้รวมซองเซลล์ ถูกเลื่อนออกไปอีกในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 20 มม. 0.125% (v/v) octyl-POE (n octyl polyoxyethylene ที่ประกอบด้วยค่า pH 7.4 ผมชีวเคมี โลซาน สวิตเซอร์แลนด์), ใช้เครื่อง homogenizer พอตเตอร์ Elvehjem ช่วงล่างรับการกกที่ 37° C ด้วยการสั่นเบา ๆ สำหรับ 1 h แล้ว จาก 100 000 × g ที่ 4° C เป็นเวลา 40 นาที เม็ดใหม่ ตอนนี้อุดมไปด้วยเยื่อหุ้มชั้นนอก ถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 20 มม. ค่า pH 7.4 ประกอบด้วย 5% (v/v) octyl-POE และระงับรับการกกที่ 37° C สำหรับ 60 นาทีละลายวัสดุถูกเอาออก โดยการหมุนเหวี่ยงที่ 100, 000 × g ที่ 20° C เป็นเวลา 40 นาที หลังจากแลกเปลี่ยนผงซักฟอกไป 0.2% (v/v) LDAO (lauryldimethylamine ออกไซด์ Sigma Aldrich จำกัด จำกัด สิงคโปร์) โดยการฟอกไต ตัวอย่าง VhChiP ที่อุดมไปด้วยได้ภายใต้การแลกเปลี่ยนไอออน chromatography ใช้ Hitrap Q HP ทริดจ์คอลัมน์ (5 × 1 mL) เชื่อมต่อกับระบบนายก ÄKTA บวก FPLC (GE สุขภาพวิทยาศาสตร์ อุปกรณ์วิทยาศาสตร์ ของ (ประเทศไทย) จำกัด กรุงเทพฯ ประเทศไทย) โปรตีนที่ถูกผูกไว้ที่ eluted ด้วยการไล่ระดับเส้น 0 – 1 M KCl ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.2% (v/v) LDAO ที่ประกอบด้วย ยืนยันความบริสุทธิ์ของโปรตีน eluted SDS-หน้า เศษส่วนที่ประกอบด้วยเพียง VhChiP ถูกพู และกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน Pierce BCA (ใช้งานทางชีวภาพ Co., Ltd. กรุงเทพ ประเทศไทย)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ recombinant โปรตีนอี coli BL21 (DE3) Omp8 Rosetta ความเครียดโฮสต์ถูกเปลี่ยนด้วยพลาสมิด pET23d (+) / ชิป การแสดงออกและการเตรียมความพร้อมของชิป recombinant ตามโปรโตคอลอธิบายโดย Garavito และ Rosenbusch [15] และ Rosenbusch [16] ในช่วงสั้น ๆ เซลล์กลายเป็นผู้ใหญ่ที่ 37 ° C ใน Luria-Bertani (ปอนด์) อาหารเหลวที่มี 100 μg.mL-1 ampicillin และ 25 ไมโครกรัม ML-1 กานามัยซิ ที่อ่าน OD600 ของ 0.5-0.7, IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside) ถูกเพิ่มเพื่อให้ได้ความเข้มข้น 0.5 มิลลิเมตร เจริญเติบโตของเซลล์ได้อย่างต่อเนื่องไปอีก 6 ชั่วโมงและเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวแล้วโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 4,500 ×กรัมที่ 4 ° C เป็นเวลา 20 นาที เม็ดเซลล์ถูก resuspended ในบัฟเฟอร์ที่มี 20 มิลลิเมตร Tris-HCl พีเอช 8.0, 2.5 มิลลิ MgCl2 0.1 มิลลิ CaCl2 10 μg.mL-1 DNase I และ 10 ไมโครกรัม ML-1 RNase เซลล์ A. ถูก lysed บนน้ำแข็งโดย sonication เป็นเวลา 10 นาที (รอบหน้าที่ 30%; การตั้งค่าความกว้าง 20%) โดยใช้ homogenizer Sonopuls อัลตราโซนิกที่มีการสอบสวน 6 มิลลิเมตรเส้นผ่าศูนย์กลาง VhChiP recombinant ถูกสกัดจากชั้น peptidoglycan กับโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) ตามวิธีการของ Lugtenberg และ Alphen ม [17] สั้น ๆ , SDS ถูกเพิ่มเข้าไปในเซลล์แขวนลอยที่จะมีความเข้มข้นสุดท้ายของ 2% (v / v) และบ่มได้ดำเนินการเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 60 ° C ที่มีความอ่อนโยนสั่น สารสกัดหยาบถูกปั่นแล้ว 40,000 ×กรัมเป็นเวลา 60 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส เม็ดซึ่งในขั้นตอนนี้รวมซองมือถือเป็นอีกครั้งที่ลอยอยู่ใน 20 มิลลิเมตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.4 ที่มี 0.125% (v / v) octyl-POE (N-octyl polyoxyethylene; ALEXIS ชีวเคมี, โลซานวิตเซอร์แลนด์) ใช้ homogenizer พอตเตอร์ Elvehjem การระงับการถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 ° C มีอ่อนโยนเขย่าเป็นเวลา 1 ชั่วโมงและจากนั้นหมุนเหวี่ยงที่ 100 000 ×กรัมที่ 4 ° C เป็นเวลา 40 นาที เม็ดใหม่ตอนนี้ที่อุดมไปด้วยในเยื่อหุ้มด้านนอกถูก resuspended ใน 20 มิลลิเมตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.4 ที่มี 5% (v / v) octyl-POE และระงับบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 60 นาที วัสดุที่ไม่ละลายน้ำถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 100,000 ×กรัมที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 40 นาที หลังจากการแลกเปลี่ยนของผงซักฟอก 0.2% (v / v) LDAO (lauryldimethylamine ออกไซด์. Sigma-Aldrich Pte Ltd. ประเทศสิงคโปร์) โดยการฟอกเลือดตัวอย่าง VhChiP ที่อุดมไปด้วยได้ภายใต้การแลกเปลี่ยนไอออนโครมาใช้ prepacked คอลัมน์ Hitrap Q HP (5 × 1 มิลลิลิตร) เชื่อมต่อกับ Akta นายกรัฐมนตรีบวกระบบ FPLC (GE Healthcare Life Sciences, Life Sciences เครื่องดนตรี, ITS (Thailand) Co. , Ltd. , Bangkok, Thailand) โปรตีนที่ถูกผูกไว้กับถูกชะลาดเชิงเส้นของ 0-1 M KCl ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟตที่มี 0.2% (v / v) LDAO ความบริสุทธิ์ของโปรตีนชะได้รับการยืนยันโดยวิธี SDS-PAGE เศษส่วนที่มีเพียง VhChiP ถูกรวบรวมและความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยใช้ชุดเพียร์ซ BCA โปรตีนทดสอบ (ไบโอแอคทีฟ จำกัด , Bangkok, Thailand)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแสดงออกของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ และบำบัดน้ำเสียE . coli BL21 ( DE3 ) omp8 Rosetta เจ้าภาพสายพันธุ์ถูกเปลี่ยนด้วย pet23d พลาสมิด ( + ) / ชิป การแสดงออกและการเตรียมการของชิปยีนตามโปรโตคอลและอธิบายโดย garavito rosenbusch [ 15 ] และ rosenbusch [ 16 ] ในช่วงสั้น ๆ , แปลงปลูกที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลซีในลุเรียแบร์ตานิ ( LB ) เหลว ( 100 µ g.ml − 1 แอมพิซิลินและ 25 µกรัมต่อมิลลิลิตร− 1 ทั้งสอง ที่ od600 อ่าน 0.5 - 0.7 ( ไอโซเอนไซม์บีตา - d-thiogalactoside ) คือการเพิ่มความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.5 มิลลิเมตร การเจริญเติบโตของเซลล์ได้ต่อเนื่องอีก 6 H และเซลล์แล้วเก็บเกี่ยวโดยปั่นที่ 4500 × g 4 °องศาเซลเซียส 20 นาที เซลล์เม็ดเป็น resuspended ในบัฟเฟอร์ที่มี HCL หรือ 20 มม. pH 8.0 , MgCl2 2.5 มม. ผลิต 0.1 มม. 10 µ g.ml − 1 และ 10 กรัมต่อµตรวจหา ADNase − 1 เลส . เซลล์มี lysed บนน้ำแข็งโดย sonication เป็นเวลา 10 นาที ( 30% รอบหน้าที่ ; ขนาดตั้ง 20 % ) ใช้ sonopuls Ultrasonic Homogenizer กับ 6-mm-diameter สอบสวน การ vhchip รีคอมบิแนนท์สกัดจากเปปติโดไกลแคนชั้นด้วยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS ) ตามวิธีของ lugtenberg และ alphen [ 17 ] สั้น ๆ , SDS ถูกเพิ่มไปยังเซลล์แขวนลอยในความเข้มข้นสุดท้าย 2% ( v / v ) และระยะเวลาดำเนินการเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 60 องศา C อ่อนโยนสั่น สกัดไฟฟ้าแล้ว 40000 ×กรัม 60 นาทีที่ 4 องศา เม็ด ซึ่งในขั้นตอนนี้ ได้แก่ เซลล์ ซองจดหมาย เป็นอีกครั้งที่แขวนลอยในบัพเฟอร์ฟอสเฟต 20 mm pH 7.4 ที่ 0.125 % ( v / v ) ลูกโคโพ ( n-octyl พอลีออกซีเอทิลีน ; อเล็กซิส อัลลิซิน , Lausanne , สวิตเซอร์แลนด์ ) , การใช้ ช่างปั้น elvehjem Homogenizer . ถูกระงับบ่มที่ 37 ° C อ่อนโยนสั่นเป็นเวลา 1 ชั่วโมง และระดับที่ 100 000 × g 4 ° C 40 นาที เม็ดใหม่ ตอนนี้รวยในเยื่อหุ้มชั้นนอก คือ resuspended 20 มม. ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7.4 ที่ประกอบด้วย 5% ( v / v ) และช่วงล่าง บ่มที่ไมโทคอนโพ 37 ° C เป็นเวลา 60 นาที ไม่ละลายวัสดุถูกเอาออกโดยการเหวี่ยงแยกที่ 100000 × G 20 ° C เป็นเวลา 40 นาที หลังจากแลกผงซักฟอก 0.2% ( v / v ) ldao ( lauryldimethylamine ออกไซด์ ; ซิกม่า Aldrich จำกัด สิงคโปร์ ) โดยวิธีฟอกไต vhchip ภายใต้การแลกเปลี่ยนไอออน chromatography รวยตัวอย่างโดยใช้คอลัมน์ hitrap Q HP prepacked ( 5 × 1 มิลลิลิตร ) ต่อที่ IKEA ได้รับนายกรัฐมนตรีพลัส fplc ระบบ ( วิทยาศาสตร์ , GE Healthcare ชีวิตชีวิตวิทยาศาสตร์เครื่องมือของมัน ( ประเทศไทย ) จำกัด , กรุงเทพมหานคร , ประเทศไทย ) ผูกพันโปรตีน มีตัวอย่าง มีความลาดชันเชิงเส้น 0 – 1 M KCl ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่มี 0.2% ( v / v ) ldao . ความบริสุทธิ์ของตัวอย่างที่ได้รับการยืนยันโดย SDS-PAGE โปรตีน . เศษส่วนที่มีเพียง vhchip ถูกรวมและโปรตีนตั้งใจใช้แทง BCA โปรตีนต่อชุด ( ไบโอแอคทีฟ จำกัด กรุงเทพมหานคร ประเทศไทย )