PCR conditions. DNA was extracted a

PCR conditions. DNA was extracted as described above and microbial diversity of the samples was determined by using of PCR-DGGE (Luo
et al., 2010). Briefly, a 233-bp fragment including a
40-bp GC-clamp of bacterial DNA was amplified using the universal bacterial primers 341f + GC (5

-GC
clamp-TACGGGAGGCAGCAG-3

) and 518r (5

-GC
clamp-ATTACCGCGGCTGCTGG-3

) (Muyzeret al.,
1993). PCR was performed using 2.5μL10×Ex Taq
buffer (20 mmol L
−1
Mg2+
, Takara, China), 1 μL2.5
mmol L−1
dNTP mixture, 0.3μL 5 unitsμL
−1
Ex Taq
polymerase (Takara), 1μL of each primer (10 pmol
μL
−1
), 1μL diluted template and H2O in the total volume of 25μL. Bacterial PCR was performed using the
following cycle conditions: 94
◦
C for 5 min, followed by
30 cycles of 94
◦
C for 30 s, 61
◦
C for 30 s and 72
◦
Cfor
15 s, and then 72
◦
C for 10 min. For the fungi, the primer pair NS1 (5
-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3

)
and the fungus-special primer GC fungi (5

-GC clampATTCCCCGTTACCCGTTG-3

) (Das et al., 2007)
were used to amplify a 370-bp fragment, including a
40-bp GC-clamp. Cycle conditions in the fungal PCR
were as follows: 94
◦
C for 5 min, followed by 30 cycles
of 94
◦
C for 30 s, 58
◦
C for 30 s and 72
◦
C for 25 s,
and 72
◦
C for 10 min. The amount of DNA in each
sample was estimated by image analysis using GeneTools (SynGene, UK) on digital images of the agarose
gels obtained with GeneSnap (SynGene) to ensure that
equal amounts of DNA from the samples were loaded
onto the DGGE gel.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

PCR conditions. DNA was extracted as described above and microbial diversity of the samples was determined by using of PCR-DGGE (Luoet al., 2010). Briefly, a 233-bp fragment including a40-bp GC-clamp of bacterial DNA was amplified using the universal bacterial primers 341f + GC (5-GCclamp-TACGGGAGGCAGCAG-3) and 518r (5-GCclamp-ATTACCGCGGCTGCTGG-3) (Muyzeret al.,1993). PCR was performed using 2.5μL10×Ex Taqbuffer (20 mmol L−1Mg2+, Takara, China), 1 μL2.5mmol L−1dNTP mixture, 0.3μL 5 unitsμL−1Ex Taqpolymerase (Takara), 1μL of each primer (10 pmolμL−1), 1μL diluted template and H2O in the total volume of 25μL. Bacterial PCR was performed using thefollowing cycle conditions: 94◦C for 5 min, followed by30 cycles of 94◦C for 30 s, 61◦C for 30 s and 72◦Cfor15 s, and then 72◦C for 10 min. For the fungi, the primer pair NS1 (5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3)and the fungus-special primer GC fungi (5-GC clampATTCCCCGTTACCCGTTG-3) (Das et al., 2007)were used to amplify a 370-bp fragment, including a40-bp GC-clamp. Cycle conditions in the fungal PCRwere as follows: 94◦C for 5 min, followed by 30 cyclesof 94◦C for 30 s, 58◦C for 30 s and 72◦C for 25 s,and 72◦C for 10 min. The amount of DNA in eachsample was estimated by image analysis using GeneTools (SynGene, UK) on digital images of the agarosegels obtained with GeneSnap (SynGene) to ensure thatจำนวนเท่าของดีเอ็นเอจากตัวอย่างถูกโหลดลงเจ DGGE

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

PCR เงื่อนไข ดีเอ็นเอถูกสกัดที่อธิบายข้างต้นและความหลากหลายของจุลินทรีย์กลุ่มตัวอย่างถูกกำหนดโดยการใช้ PCR-DGGE (Luo
et al., 2010) สั้น ๆ , 233 bp ส่วนรวมทั้ง
40 bp GC-ยึดของดีเอ็นเอของแบคทีเรียถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ของแบคทีเรียสากล 341f + GC
(5?
-GC
ยึด
TACGGGAGGCAGCAG-3?)
และ 518r
(5?
-GC
ยึด ATTACCGCGGCTGCTGG -3?) (Muyzeret al., 1993) PCR ได้รับการดำเนินการโดยใช้2.5μL10× Ex Taq บัฟเฟอร์ (20 มิลลิโมล L -1 Mg2 +, Takara, จีน) 1 μL2.5มิลลิโมลL-1 ผสม dNTP, 0.3μL 5 unitsμL -1 Ex Taq โพลิเมอร์ (Takara) 1μLของแต่ละ ไพรเมอร์ (10 pmol ไมโครลิตร-1) 1μLเจือจางแม่แบบและ H2O ในปริมาณรวมของ25μL PCR แบคทีเรียได้รับการดำเนินการโดยใช้เงื่อนไขรอบต่อไปนี้: 94 ◦ C เป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย30 รอบ 94 ◦ C เป็นเวลา 30 วินาที 61 ◦ C เป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 ◦ Cfor 15 s แล้ว 72 ◦ C เป็นเวลา 10 นาที . สำหรับเชื้อราคู่ไพรเมอร์ NS1 (5? -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3?) และไพรเมอร์เชื้อราพิเศษเชื้อรา GC (5? -GC clampATTCCCCGTTACCCGTTG-3?) (ดา et al., 2007) ถูกนำมาใช้เพื่อขยาย 370- ส่วน bp รวมทั้งGC-ยึด 40 bp เงื่อนไขวงจรใน PCR เชื้อรามีดังนี้94 ◦ C เป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 30 รอบ94 ◦ C เป็นเวลา 30 วินาที 58 ◦ C เป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 ◦ C เป็นเวลา 25 วินาทีและ72 ◦ C เป็นเวลา 10 นาที . ปริมาณของดีเอ็นเอในแต่ละตัวอย่างถูกประเมินโดยการวิเคราะห์ภาพโดยใช้ GeneTools (SynGene สหราชอาณาจักร) บนภาพดิจิตอลของ agarose เจลได้รับกับ GeneSnap (SynGene) เพื่อให้แน่ใจว่าปริมาณที่เท่ากันของดีเอ็นเอจากตัวอย่างที่ถูกโหลดลงบนเจลDGGE

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เงื่อนไข PCR ดีเอ็นเอตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและจากความหลากหลายของตัวอย่างที่ถูกกำหนดโดยการใช้ของดีเอ็นเอ 9 แถบบ่งชี้ ( Luo
et al . , 2010 ) สั้น , 233 BP ส่วนรวมทั้ง
40 BP GC หนีบดีเอ็นเอของแบคทีเรียเป็นแบคทีเรียชนิดอื่นที่ใช้สากล 341f GC ( 5

-
 clamp-tacgggaggcagcag-3 GC

) และ 518r ( 5

-
 clamp-attaccgcggctgctgg-3 GC

) (
muyzeret al . , 1993 )ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสโดยใช้ 2.5 μ l10 ×อดีตได้ดี
บัฟเฟอร์ ( 20 mmol l
− 1
mg2
, Takara , จีน ) , 1 μ l2.5
mmol l − 1
dntp ผสม , 0.3 μ L 5 หน่วยμ L
− 1

( อดีตได้ดีโดยทาการะ ) 1 μผมของแต่ละคน รองพื้น ( 10 pmol
L

μ− 1 ) 1 μฉันเจือจางแม่แบบและ H2O ในปริมาตรรวม 25 μลิตรแบคทีเรียโดยการใช้เงื่อนไขต่อไปนี้ : 94

รอบ◦
C เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย


◦ 94 30 รอบ นาน 30 วินาที◦ 61

C 30 และ 72


◦ C เป็นเวลา 15 วินาที แล้ว◦ 72

C นาน 10 นาที สำหรับเชื้อรา ไพรเมอร์คู่ 1 ( 5  gtagtcatatgcttgtctc-3

-

 ) และเชื้อราเชื้อรารองพื้นพิเศษ GC ( 5

-
 GC clampattccccgttacccgttg-3
) ( ดาส et al . , 2007 )
ถูกใช้เพื่อขยายขนาด 370 BP รวมทั้งยึดเป็น
40 BP GC . ภาพจักรยานใน
เชื้อรา ดังนี้

◦ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 30 รอบ 94

◦
C 30 s 58

◦เป็นเวลา 30 วินาที ◦ 72

C 25 S ,


◦ 72 C 10 นาที ปริมาณของ DNA ในแต่ละ
ตัวอย่างโดยประมาณ การวิเคราะห์ภาพที่ใช้ genetools ( syngene , UK ) บนภาพดิจิตอลของโรส
เจลได้ กับ genesnap ( syngene ) เพื่อให้แน่ใจว่า
จํานวนเงินเท่ากับดีเอ็นเอจากตัวอย่างการทดลองโหลด
ลงบนเจล