Page: 1of 5 4868J. Dairy Sci. 95 :

Page:
1
of 5
4868J. Dairy Sci. 95 :4868–4872http://dx.doi.org/ 10.3168/jds.2012-5445 © American Dairy Science Association®, 2012 . ABSTRACT Yogurt starter cultures may consist of multiple strains of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (LB) and Streptococcus thermophilus (ST). Conventional plating methods for monitoring LB and ST levels dur-ing yogurt manufacture do not allow for quantification of individual strains. The objective of the present work was to develop a quantitative PCR method for quan-tification of individual strains in a commercial yogurt starter culture. Strain-specific primers were designed for 2 ST strains (ST DGCC7796 and ST DGCC7710), 1 LB strain (DGCC4078), and 1 Lactobacillus delbrueckiissp. lactis strain (LL; DGCC4550). Primers for the individual ST and LB strains were designed to target unique DNA sequences in clustered regularly inter-spersed short palindromic repeats. Primers for LL were designed to target a putative mannitol-specific IIbC component of the phosphotransferase system. Follow-ing evaluation of primer specificity, standard curves re-lating cell number to cycle threshold were prepared for each strain individually and in combination in yogurt mix, and no significant differences in the slopes were observed. Strain balance data was collected for yogurt prepared at 41 and 43°C to demonstrate the potential application of this method. Key words:starter culture , Streptococcus thermophi-lus , Lactobacillus delbrueckii, real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) Technical Note Yogurt starter cultures typically consist of multiple strains of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus (LB) and Streptococcus thermophilus (ST; Auclair and Acco-las, 1983). Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus and ST strains can differ with regard to optimum growth temperature and the production of acid, aroma, flavor compounds, and exopolysaccharide produced during fermentation (Imhof et al., 1995; Tamime and Rob-inson, 1999; Broadbent et al., 2003). Thus, particular strains are selected for commercial starter cultures so that under a specific set of conditions (e.g., yogurt mix formulation and temperature), the strain balance achieved promotes rapid acidification while produc-ing a product with the desired organoleptic qualities (Chandan and O’Rell, 2006). At times, it may be necessary or desirable to change the yogurt mix formulation or fermentation conditions, but such modifications can alter the growth profile and balance of individual strains (Radke-Mitchell and Sandine, 1986). Conventional plating methods for fol-lowing ST and LB levels during yogurt manufacture require 48 to 72 h and do not allow for enumeration of individual strains because strains of the same species or subspecies are phenotypically very similar (IDF, 1988). In such cases, molecular techniques such as quantita-tive PCR (qPCR), which can discriminate between individual strains, would improve our understanding of the relationship between strain balance and product quality. The objective of this study was to develop a qPCR method for monitoring individual strains in a commercial starter culture during yogurt manufacture. Development of a qPCR method for monitoring indi-vidual strains is contingent on identification of unique sequences, which can be used as targets for primers. Clustered regularly interspersed short palindromic re-peat (CRISPR) sequences, which have been shown to be prevalent in the genomes of lactic acid bacteria in-cluding Lactobacillus spp. and Streptococcus spp., have been shown to be highly variable, allowing differentia-tion at the strain level (Horvath et al., 2008, 2009). The CRISPR sequences consist of alternating repeat sequences, which are short and highly conserved, and spacers, which are highly variable. In ST strains, repeat sequences are typically 36 bp in length, whereas repeats for LB are usually between 28 and 30 bp in length (Horvath et al., 2008, 2009). Repeats are separated by spacers, whose sequences are commonly derived from bacteriophage and other foreign DNA and confer resis-tance to phage attack (Barrangou et al., 2007). Differ-ences in the number of repeats and spacers as well as the arrangement and sequence of the spacers have been observed in ST strains (Horvath et al., 2008). Technical note: Development of a quantitative PCR method for monitoring strain dynamics during yogurt manufacture D. M. Miller , E. G. Dudley , and R. F. Roberts 1 Department of Food Science, The Pennsylvania State University, University Park 16802 Received February 19, 2012. Accepted April 15, 2012. 1 Corresponding author: [e-mail]
Journal of Dairy Science Vol. 95 No. 9, 2012TECHNICAL NOTE: QUANTITATIVE PCR METHOD FOR STARTER CULTURE STRAINS4869In this study, 2 commercial ST strains (DGCC7796 and 7710), 1 LB strain, (DGCC4078), and 1 Lacto-bacillus delbrueckii ssp. lactis strain (LL; DGCC4550) were obtained from Danisco USA Inc. (Madison, WI). The ST strains were propagated at 37°C in M17 broth with lactose [Becton Dickinson and Co. (BD), Franklin Lakes, NJ]. The LB and LL strains were cultivated in acidified de Man, Rogosa, and Sharpe (MRS) broth (pH 5.4; BD) and incubated at 37°C under anaerobic conditions (10% carbon dioxide, 5% hydrogen, and 85% nitrogen). Stock cultures were prepared from overnight cultures by combining equal quantities of broth and 20% glycerol (wt/vol; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) and were stored at −80°C.Primers for the individual ST strains were de-signed to target CRISPR loci previously identified in these strains (GenBank accession no. EF434468 and EF434469; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/; Table 1; Barrangou et al., 2007). The primer set for LB was designed to target a CRISPR locus based on sequence information provided by the culture supplier. Because a CRISPR sequence was not available for LL, primers were designed to target a sequence in the phos-photransferase system, mannitol-specific IIbC compo-nent gene (GenBank accession no. AF496224.1). Prim-ers were designed with Primer-Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC = BlastHome), and primer specificity was evaluated in silico and by conventional PCR. Agarose gel elec-trophoresis was used to confirm that a single amplicon of the correct size was produced for the target strain and no cross-reaction occurred with each strain-specific primer set and the nontarget strains in that particular starter culture (data not shown).Quantitative PCR experiments were conducted to identify the optimal annealing temperature and primer concentration for each primer set (data not shown). The optimized qPCR reaction mix consisted of iQ SYBR Green Super Mix (50 μL; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA), primers at a final concentration of 50 nM, and nuclease-free water for a final reaction volume of 100 μL. Aliquots (25 μL) of the reaction mix were dispensed in triplicate wells, and qPCR was conducted with an iQ5 real-time PCR detection system (Bio-Rad Laboratories Inc.). Optimized qPCR condi-tions consisted of 95°C for 5 min, followed by 35 cycles of 95°C for 30 s, 64.6°C for 30 s, and 72°C for 10 s. Following qPCR, melting curve analysis was conducted at temperatures ranging from 55 to 95°C, with a 0.5°C increase every 30 s. Agarose gel electrophoresis was used to verify that a single reaction product of the ex-pected size was produced, and cross-reaction with other strains in the starter culture was not observed (data not shown).Standard curves were prepared with individual strains spiked in the yogurt mix. The yogurt mix was prepared by combining 7:1 water and nonfat, dry milk powder in a large stainless steel canister (final concen-tration 12.5% milk solids-not-fat). The mix was heated to 200°F (93.3°C) for 45 min with constant agitation and then cooled and stored at 4°C.Aliquots of individual strains grown in M17 with lac-tose or acidified MRS broth (45 mL) were transferred to sterile, 50-mL centrifuge tubes and centrifuged for 5 min at 1,250 × g (Beckman GPR centrifuge; Beck-man Instruments Inc., Fullerton, CA). The supernatant was discarded and the pelleted cells were resuspended in 0.1% Polypeptone (BD) to yield cell concentrations of approximately 109 cfu/mL. Serial dilutions were prepared in 0.1% Polypeptone (BD) and cell concen-trations were determined by plating. Serial dilutions of ST strains were plated in duplicate on M17 agar Table 1. Strain-specific primers for commercial starter culture strains and Lactobacillus farciminis (LF) ATCC 29644TTarget microorganism1Primer name2Sequence (5c→3c)GC content (%)Tm3(°C)Expected product (bp)ST DGCC77967796fGGTCTGTAATTTCATTCCCTCGT43.454.8877796rCCGCATGTGTTTAGAGAAACC47.654.1ST DGCC77107710fCGAGGAGCTATTGGCACAAC55.056.1857710rCAGTGGTCAGCAGATTGTCA50.054.9LBLBfTGGGGGTGATCCTTTGTTATGG50.057.086LBrGGCGCTGGCCAAAAGGAT61.159.2LLLLfTGGTTTCAGCCAAGGATGCC55.058.381LLrACAGCAGCAACGACAAAGGA50.057.4LF4LFfGAGAGGTCT ACTCTCAAACTCGT47.855.484LFrTATCGCGCAGTTTTCGGTGT50.057.31ST DGCC7796 and ST DGCC7710 = Streptococcus thermophilus (ST) strains; LB = Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus; LL = Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis.2f = forward primer; r = reverse primer.3Melting temperature.4This strain was used as an external control and was not part of the commercial starter culture.
4870MILLER ET AL.Journal of Dairy Science Vol. 95 No. 9, 2012with lactose (BD) and incubated at 37°C for 48 h (IDF, 1988). Serial dilutions of LB and LL strains were pla

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

หน้า: 15 4868J. นม Sci. 95:4868-4872 http://dx.doi.org/ 10.3168/jds.2012-5445 © สมาคมวิทยาศาสตร์นมอเมริกัน® 2012 วัฒนธรรมสตาร์ทโยเกิร์ตนามธรรมอาจประกอบด้วยหลายสายพันธุ์แลคโตบาซิลลัส delbrueckii ssp. bulgaricus (ปอนด์) และอุณหภูมิ thermophilus (เซนต์) วิธีการชุบธรรมดาตรวจสอบปอนด์และเซนต์ระดับ dur ing โยเกิร์ตผลิตไม่อนุญาตสำหรับนับของแต่ละสายพันธุ์ วัตถุประสงค์ของการทำงานปัจจุบันคือการ พัฒนาเชิงปริมาณวิธี PCR สำหรับควน-tification ของแต่ละสายพันธุ์ในวัฒนธรรมโยเกิร์ตพาณิชย์สตาร์ท ต้องใช้เฉพาะไพรเมอร์ถูกออกแบบสำหรับสายพันธุ์เซนต์ 2 (DGCC7796 เซนต์และเซนต์ DGCC7710), 1 ปอนด์ต้องใช้ (DGCC4078), และ delbrueckiissp แลคโตบาซิลลัส 1 lactis สายพันธุ์ (LL DGCC4550) ไพรเมอร์สำหรับสายพันธุ์เซนต์และปอนด์ในแต่ละถูกออกแบบมาเพื่อเป้าหมายเฉพาะดีเอ็นเอลำดับในจับกลุ่มเป็นประจำ spersed อินเตอร์สั้น palindromic ทำซ้ำ ไพรเมอร์สำหรับจะถูกออกแบบมาเพื่อเป้าหมาย putative mannitol เฉพาะ IIbC คอมโพเนนต์ของระบบ phosphotransferase ประเมินตาม ing specificity รองพื้น เส้นโค้งมาตรฐาน re-lating เซลล์เลขรอบขีดจำกัดได้เตรียมต้องใช้แต่ละทีละ และ ในชุดผสมโยเกิร์ต และไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในลาดสุภัค ต้องใช้ดุลข้อมูลถูกรวบรวมสำหรับโยเกิร์ตที่เตรียมไว้ที่ 41 และ 43 ° C แสดงให้เห็นถึงการใช้วิธีการนี้อาจเกิดขึ้น กุญแจคำ: สตาร์ทวัฒนธรรม อุณหภูมิ thermophi lus แลคโตบาซิลลัส delbrueckii พอลิเมอเรสเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ปฏิกิริยาลูกโซ่ (qPCR) เทคนิคหมายเหตุโยเกิร์ตสตาร์ทวัฒนธรรมโดยทั่วไปประกอบด้วยของหลายสายพันธุ์แลคโตบาซิลลัส delbrueckii ssp. bulgaricus (ปอนด์) และอุณหภูมิ thermophilus (เซนต์ Auclair และลูกค้าหรืลา 1983) แลคโตบาซิลลัส delbrueckii ssp. bulgaricus และสายพันธุ์เซนต์สามารถแตกต่างกันตามอุณหภูมิที่เจริญเติบโตเหมาะสมและการผลิตของกรด กลิ่น รสสาร และ exopolysaccharide ที่ผลิตในระหว่างการหมัก (Imhof และ al., 1995 Tamime และร็อบ inson, 1999 บรอดเบนท์และ al., 2003) ดังนั้น เฉพาะสายพันธุ์มีเลือกสำหรับสตาร์ทพาณิชย์วัฒนธรรมนั้นภายใต้ชุดเฉพาะของเงื่อนไข (เช่น กำหนดผสมโยเกิร์ตและอุณหภูมิ), ดุลต้องใช้ประสบความสำเร็จส่งเสริมยูอย่างรวดเร็วในขณะที่ผลิตภัณฑ์เซรามิค-ing ผลิตภัณฑ์ที่ มีคุณภาพ organoleptic ระบุ (Chandan และ O'Rell, 2006) บางครั้ง มันอาจจะจำเป็น หรือสมควรเปลี่ยนโยเกิร์ตผสมหมักหรือกำหนดเงื่อนไข ได้ปรับเปลี่ยนดังกล่าวสามารถเปลี่ยนแปลงค่าการเจริญเติบโตและยอดดุลของแต่ละสายพันธุ์ (Radke Mitchell และ Sandine, 1986) ปกติชุบวิธี fol ควายเหล็กระดับเซนต์และปอนด์ในระหว่างการผลิตโยเกิร์ตต้อง h 48-72 และไม่อนุญาตให้การแจงนับของแต่ละสายพันธุ์เพราะสายพันธุ์ของชนิดเดียวกันหรือชนิดย่อย phenotypically คล้าย ( 1988 idf) บาง ในกรณี เทคนิคโมเลกุลเช่น quantita tive PCR (qPCR), ซึ่งสามารถเหยียดระหว่างแต่ละสายพันธุ์ ต้องปรับปรุงเราเข้าใจความสัมพันธ์ระหว่างคุณภาพของผลิตภัณฑ์และยอดต้องใช้ วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้ได้พัฒนาวิธี qPCR การตรวจสอบแต่ละสายพันธุ์ในวัฒนธรรมเชิงพาณิชย์เริ่มต้นในระหว่างการผลิตโยเกิร์ต พัฒนาวิธีการในการตรวจสอบสายพันธุ์ indi vidual qPCR จะผูกพันกับระบุลำดับเฉพาะ ซึ่งสามารถใช้เป็นเป้าหมายสำหรับไพรเมอร์ จับกลุ่มเป็นลำดับกระจายสั้น palindromic re-พรุ (CRISPR) ซึ่งมีการแสดงให้แพร่หลายใน genomes โอแลคโตบาซิลลัสใน cluding ของแบคทีเรียกรดแลกติกและโออุณหภูมิ มีการแสดงจะผันแปรสูง ทำให้สเตรชัน differentia ที่ต้องใช้ระดับ (Horvath et al., 2008, 2009) ลำดับที่ CRISPR ประกอบด้วยสลับซ้ำลำดับ ซึ่งสั้น และคำนำ และ spacers ซึ่งมีความผันแปรสูง ในสายพันธุ์เซนต์ ทำซ้ำลำดับ 36 ปกติ bp ยาว ในขณะที่การทำซ้ำสำหรับปอนด์มักอยู่ระหว่าง bp 28 และ 30 ยาว (Horvath et al., 2008, 2009) ทำซ้ำจะถูกคั่น ด้วย spacers ลำดับที่มาจากแบคทีและดีเอ็นเอต่างประเทศอื่น ๆ โดยทั่วไป และประสาท resis-tance การโจมตี phage (Barrangou et al., 2007) แตกต่างกัน ences ในจำนวนการทำซ้ำ และ spacers ตลอดจนการจัดเรียงและลำดับของ spacers ที่มีได้พบในสายพันธุ์เซนต์ (Horvath et al., 2008) หมายเหตุทางเทคนิค: การพัฒนาเชิงปริมาณวิธี PCR สำหรับการตรวจสอบต้องใช้ dynamics ระหว่างโยเกิร์ตผลิต D. ม.มิลเลอร์ E. G. Dudley และอาร์เอฟโรเบิตส์ 1 แผนกอาหาร วิทยาศาสตร์ เพนซิลวาเนียมหาวิทยาลัยรัฐ มหาวิทยาลัยสวน 16802 เมื่อ 19 กุมภาพันธ์ 2012 ที่ได้รับการ ยอมรับเมื่อ 15 เมษายน 2012 1 Corresponding ผู้เขียน: [e-mail] สมุดรายวันของโคนม 9 หมายเลขวิทยาศาสตร์ปี 95, 2012TECHNICAL หมายเหตุ: STRAINS4869In เชิงปริมาณ PCR วิธีสำหรับ STARTER วัฒนธรรมศึกษา เซนต์พาณิชย์ 2 สายพันธุ์ (DGCC7796 และ 7710), ต้องใช้ป. 1, (DGCC4078), และ 1 คัด Lacto delbrueckii ssp. lactis ต้องใช้ (จะ DGCC4550) ได้รับจาก Danisco Inc. ประเทศสหรัฐอเมริกา (เมดิสัน WI) สายพันธุ์เซนต์ถูกเผยแพร่ที่ 37° C ในซุป M17 ด้วยแล็กโทส [NJ Becton สันและบริษัท (BD), แฟรงคลินทะเลสาบ ] สายพันธุ์ปอนด์และจะถูกปลูกในเด acidified ซุปแมน Rogosa และ Sharpe (นาง) (pH 5.4 BD) และ incubated ที่ 37 ° C ภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจน (ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ 10%, 5% ไฮโดรเจน และ 85% ไนโตรเจน) วัฒนธรรมที่หุ้นถูกเตรียมจากวัฒนธรรมค้างคืน โดยรวมปริมาณเท่าซุปและกลีเซอร 20% (wt/vol Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) และถูกเก็บไว้ที่ −80 องศาเซลเซียส ไพรเมอร์สำหรับสายพันธุ์เซนต์ละได้ถูกยกเลิกไป loci CRISPR เป้าหมายที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ ในสายพันธุ์เหล่านี้ (GenBank ทะเบียนไม่ EF434468 และ EF434469 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/; ตารางที่ 1 Barrangou et al., 2007) พื้นที่ตั้งสำหรับปอนด์ถูกออกแบบให้เป้าหมายโลกัสโพล CRISPR การลำดับข้อมูลโดยซัพพลายเออร์วัฒนธรรม เนื่องจากไม่มีลำดับ CRISPR สำหรับ LL ไพรเมอร์ออกแบบมาเพื่อเป้าหมายลำดับในระบบ phos photransferase, mannitol เฉพาะ IIbC compo nent ยีน (GenBank ทะเบียนไม่ AF496224.1) . พริมสกู๊ปถูกออกแบบ ด้วยพื้นระเบิด (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC = BlastHome), และ specificity พื้นถูกประเมิน ใน silico และ PCR แบบเดิม Agarose เจ elec-trophoresis ถูกใช้เพื่อยืนยันว่า amplicon เดี่ยวขนาดถูกผลิตขึ้นสำหรับพันธุ์เป้าหมาย และ cross-reaction ไม่เกิดขึ้นกับแต่ละชุดต้องใช้เฉพาะสีรองพื้นและสายพันธุ์ nontarget ในวัฒนธรรมที่เฉพาะสตาร์ท (ข้อมูลไม่แสดง) ได้ดำเนินการเชิงปริมาณ PCR ทดลองระบุสูงสุดหลอมอุณหภูมิและสีรองพื้นความเข้มข้นในแต่ละชุดสีรองพื้น (ข้อมูลไม่แสดง) ผสมปฏิกิริยา qPCR เพิ่มประสิทธิภาพประกอบด้วย iQ SYBR Green ซูเปอร์ผสม (50 μL เฮอร์คิวลิส แคลิฟอร์เนีย Bio-Rad Laboratories Inc.), ไพรเมอร์ที่เข้มข้นสุดท้ายของ 50 nM และ nuclease ฟรีน้ำปริมาตรปฏิกิริยาสุดท้ายของ 100 μL Aliquots (25 μL) ของผสมปฏิกิริยามีคำในบ่อ triplicate และ qPCR ได้ดำเนินการกับ iQ5 แบบ real-time PCR ตรวจหาระบบ (Bio Rad Laboratories Inc.) เพิ่มประสิทธิภาพ qPCR เบาะ ๆ ว่าพวกเขา-tions ประกอบด้วย 95° C สำหรับ 5 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 ของ 95° C สำหรับ 30 s, 64.6° C สำหรับ 30 s และ 72 องศาเซลเซียส 10 s ละลายการวิเคราะห์โค้งถูกดำเนินต่อ qPCR ที่อุณหภูมิตั้งแต่ 55 ° C 95 มีการเพิ่มขึ้น 0.5° C ทุก 30 s ได้ Agarose เจ electrophoresis ถูกใช้เพื่อตรวจ สอบว่า มีผลิตผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาเดียวขนาด pected อดีต cross-reaction กับสายพันธุ์อื่น ๆ ใน starter ที่สังเกต (ข้อมูลไม่แสดง) เส้นโค้งมาตรฐานได้พร้อมสายพันธุ์ละ spiked ในผสมโยเกิร์ต ผสมโยเกิร์ตถูกเตรียม โดยผสมน้ำ 7:1 และ nonfat แห้งนมผงในป๊อบอัพเอาสเตนเลสขนาดใหญ่ (สุดท้าย concen-tration 12.5% ของแข็งไม่ใช่เนย) ผสมที่อุณหภูมิ 200° F (93.3° C) สำหรับ 45 นาทีมีอาการกังวลต่อค่าคงที่ และระบายความร้อนด้วย แล้วเก็บที่ 4 องศาเซลเซียส โอนย้ายไปหลอดฆ่าเชื้อ 50 mL เครื่องหมุนเหวี่ยง และ centrifuged ใน 5 นาทีที่ 1250 × g (Beckman GPR เครื่องหมุนเหวี่ยง aliquots ของแต่ละสายพันธุ์ปลูกใน M17 tose ลัคหรือ acidified นางซุป (45 มล.) Beck-man เครื่องมือ Inc. ฟูลเลอร์ตัน CA) Supernatant ถูกละทิ้ง และเซลล์ pelleted ถูก resuspended ใน 0.1% Polypeptone (BD) ให้เซลล์ความเข้มข้นของประมาณ 109 cfu/mL Dilutions ประจำถูกเตรียมใน 0.1% Polypeptone (BD) และเซลล์ concen-trations ถูกกำหนด โดยชุบ Dilutions ประจำของสายพันธุ์เซนต์ถูกชุบในซ้ำใน agar M17 ตารางที่ 1 Strain-specific primers for commercial starter culture strains and Lactobacillus farciminis (LF) ATCC 29644TTarget microorganism1Primer name2Sequence (5c→3c)GC content (%)Tm3(°C)Expected product (bp)ST DGCC77967796fGGTCTGTAATTTCATTCCCTCGT43.454.8877796rCCGCATGTGTTTAGAGAAACC47.654.1ST DGCC77107710fCGAGGAGCTATTGGCACAAC55.056.1857710rCAGTGGTCAGCAGATTGTCA50.054.9LBLBfTGGGGGTGATCCTTTGTTATGG50.057.086LBrGGCGCTGGCCAAAAGGAT61.159.2LLLLfTGGTTTCAGCCAAGGATGCC55.058.381LLrACAGCAGCAACGACAAAGGA50.057.4LF4LFfGAGAGGTCT ACTCTCAAACTCGT47.855.484LFrTATCGCGCAGTTTTCGGTGT50.057.31ST DGCC7796 and ST DGCC7710 = Streptococcus thermophilus (ST) strains; ปอนด์ =แลคโตบาซิลลัส delbrueckii ssp. bulgaricus จะ = lactis.2f ssp. delbrueckii แลคโตบาซิลลัส =รองพื้นไปข้างหน้า r =ย้อนกลับต้องใช้ temperature.4This primer.3Melting ใช้เป็นตัวควบคุมภายนอก และเป็นส่วนหนึ่งของวัฒนธรรมเชิงพาณิชย์สตาร์ทไม่4870MILLER ET AL สมุดรายวันของโคนม 9 หมายเลขวิทยาศาสตร์ปี 95, 2012with แล็กโทส (BD) และ incubated ที่ 37° C สำหรับ 48 h ( 1988 idf บาง) Dilutions ประจำของสายพันธุ์ปอนด์และจะมีปลา

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

หน้า:
1
จาก 5
4868J นมวิทย์ 95: 4868-4872http: //dx.doi.org/ 10.3168 / jds.2012-5445 ©อเมริกันนมสมาคมวิทยาศาสตร์ 2012 โยเกิร์ตบทคัดย่อวัฒนธรรมที่เริ่มต้นอาจประกอบด้วยหลายสายพันธุ์ของแลคโตบาซิลลัส delbrueckii เอสเอส bulgaricus (LB) และ Streptococcus thermophilus (ST) วิธีการชุบธรรมดาสำหรับการตรวจสอบ LB และระดับ ST เธไอเอ็นจีผลิตโยเกิร์ตไม่อนุญาตให้มีปริมาณของแต่ละสายพันธุ์ วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้คือการพัฒนาวิธี PCR เชิงปริมาณสำหรับ Quan-tification สายพันธุ์ในแต่ละวัฒนธรรมโยเกิร์ตเริ่มต้นในเชิงพาณิชย์ ไพรเมอร์สายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงได้รับการออกแบบสำหรับ 2 สายพันธุ์ ST (ST DGCC7796 และ ST DGCC7710) 1 สายพันธุ์ LB (DGCC4078) และแลคโตบาซิลลัส 1 delbrueckiissp สายพันธุ์ lactis (LL; DGCC4550) ไพรเมอร์สำหรับบุคคล ST และสายพันธุ์ LB ถูกออกแบบมาเพื่อเป้าหมายลำดับดีเอ็นเอที่ไม่ซ้ำกันในคลัสเตอร์อย่างสม่ำเสมอระหว่าง spersed palindromic สั้นซ้ำ ไพรเมอร์สำหรับ LL ถูกออกแบบมาเพื่อกำหนดเป้าหมายเป็นส่วนประกอบ IIbC สมมุติแมนนิทอลเฉพาะของระบบ phosphotransferase การประเมินผลการปฏิบัติตามไอเอ็นจีจำเพาะของไพรเมอร์โค้งมาตรฐานใหม่ lating จำนวนเซลล์เกณฑ์วงจรถูกเตรียมไว้สำหรับสายพันธุ์ที่เป็นรายบุคคลแต่ละคนและในการรวมกันในการผสมโยเกิร์ตและไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความลาดชันถูกตั้งข้อสังเกต ข้อมูลสมดุลสายพันธุ์ที่ถูกเก็บรวบรวมจัดทำโยเกิร์ตที่ 41 และ 43 ° C ถึงแสดงให้เห็นถึงศักยภาพของการประยุกต์ใช้วิธีการนี้ คำสำคัญ: วัฒนธรรมเริ่มต้น Streptococcus thermophi-LUs, Lactobacillus delbrueckii เวลาจริงลูกโซ่โพลิเมอร์ปฏิกิริยาเชิงปริมาณ (qPCR) เทคนิคหมายเหตุวัฒนธรรมโยเกิร์ตเริ่มต้นมักจะประกอบด้วยหลายสายพันธุ์ของแลคโตบาซิลลัส delbrueckii เอสเอส bulgaricus (LB) และ Streptococcus thermophilus (ST; Auclair และ Acco-ลาส, 1983) Lactobacillus delbrueckii เอสเอส bulgaricus และสายพันธุ์ ST สามารถแตกต่างกันในเรื่องเกี่ยวกับอุณหภูมิการเจริญเติบโตที่เหมาะสมและการผลิตกรดกลิ่นสารรสชาติและสร้าง Exopolysaccharide ผลิตในระหว่างการหมัก (Imhof, et al, 1995;. Tamime และร็อบ-inson 1999. บรอดเบนท์, et al, 2003 ) ดังนั้นสายพันธุ์โดยเฉพาะอย่างยิ่งได้รับการแต่งตั้งให้เป็นวัฒนธรรมที่เริ่มต้นในเชิงพาณิชย์เพื่อที่อยู่ภายใต้ชุดเฉพาะของเงื่อนไข (เช่นสูตรผสมโยเกิร์ตและอุณหภูมิ), ความสมดุลของสายพันธุ์ที่ได้รับการส่งเสริมเป็นกรดอย่างรวดเร็วในขณะที่ produc ไอเอ็นจีผลิตภัณฑ์ที่มีคุณภาพทางประสาทสัมผัสที่ต้องการ (Chandan และโอ 'เรลล์, 2006) ในบางครั้งก็อาจจะจำเป็นหรือพึงปรารถนาที่จะเปลี่ยนสูตรผสมโยเกิร์ตหรือเงื่อนไขการหมัก แต่การปรับเปลี่ยนดังกล่าวสามารถเปลี่ยนแปลงรายละเอียดการเจริญเติบโตและความสมดุลของแต่ละสายพันธุ์ (Radke-มิตเชลล์และ Sandine, 1986) วิธีการชุบธรรมดาสำหรับ Fol-ควายเหล็กระดับ ST และปอนด์ในระหว่างการผลิตโยเกิร์ตต้องใช้ 48-72 ชั่วโมงและไม่อนุญาตให้มีการแจงนับของแต่ละสายพันธุ์เพราะสายพันธุ์ของสายพันธุ์เดียวกันหรือชนิดย่อยลักษณะภายนอกคล้ายกันมาก (IDF, 1988) ในกรณีเช่นเทคนิคโมเลกุลเช่น PCR-quantita เชิง (qPCR) ซึ่งสามารถแยกแยะระหว่างสายพันธุ์ของแต่ละบุคคลจะปรับปรุงความเข้าใจของเราของความสัมพันธ์ระหว่างความเครียดความสมดุลและคุณภาพของผลิตภัณฑ์ วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาวิธีการตรวจสอบ qPCR สายพันธุ์ในแต่ละวัฒนธรรมที่เริ่มต้นการค้าในระหว่างการผลิตโยเกิร์ต การพัฒนาวิธีการตรวจสอบ qPCR สายพันธุ์-indi vidual ผูกพันกับบัตรประจำตัวของลำดับไม่ซ้ำกันซึ่งสามารถใช้เป็นเป้าหมายของไพรเมอร์ คลัสเตอร์ palindromic กระจายอย่างสม่ำเสมอในระยะสั้นอีกครั้งพรุ (CRISPR) ลำดับซึ่งได้รับการแสดงที่จะเป็นที่แพร่หลายในจีโนมของแบคทีเรียกรดแลคติกใน-cluding Lactobacillus spp และ Streptococcus spp. ได้รับการแสดงที่จะเป็นตัวแปรที่ช่วยให้ความแตกต่าง-การในระดับความเครียด (Horvath et al., 2008, 2009) ลำดับ CRISPR ประกอบด้วยสลับวนเวียนซ้ำซึ่งเป็นระยะสั้นและอนุรักษ์สูงและอวกาศซึ่งเป็นตัวแปร ในสายพันธุ์ ST ลำดับซ้ำโดยทั่วไปจะมี 36 bp ยาวในขณะที่ซ้ำสำหรับ LB มักจะมีระหว่างวันที่ 28 และ 30 bp ยาว (Horvath et al., 2008, 2009) ซ้ำจะถูกแยกออกจากอวกาศที่มีลำดับจะได้มาจากดีเอ็นเอทั่วไป bacteriophage ต่างประเทศและอื่น ๆ และมอบ resis-ในระยะการโจมตีของฟาจ (Barrangou et al., 2007) แตกต่าง-ences ในจำนวนของซ้ำและอวกาศเช่นเดียวกับการจัดเรียงและลำดับของ spacers ได้รับการปฏิบัติในสายพันธุ์ ST (Horvath et al., 2008) ทราบเทคนิค: การพัฒนาวิธี PCR เชิงปริมาณสำหรับการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงสายพันธุ์ระหว่างการผลิตโยเกิร์ตมิลเลอร์ DM, EG ดัดลีย์และโรเบิร์ต RF 1 ภาควิชาวิทยาศาสตร์การอาหาร, เพนซิล State University, University Park 16802 ที่ได้รับวันที่ 19 กุมภาพันธ์ 2012 ได้รับการยอมรับ 15 เมษายน 2012 . 1 ผู้เขียนที่สอดคล้องกัน: [e-mail]
วารสารวิทยาศาสตร์ฉบับนม 95 ฉบับที่ 9, 2012TECHNICAL หมายเหตุ: เชิงปริมาณโดยวิธี PCR สำหรับการเริ่มต้นเพาะเลี้ยง STRAINS4869In การศึกษาครั้งนี้ 2 สายพันธุ์การค้า ST (DGCC7796 และ 7710) 1 สายพันธุ์ LB (DGCC4078) และ 1 Lacto-บาซิลลัส delbrueckii เอสเอส สายพันธุ์ lactis (LL; DGCC4550) ที่ได้รับจาก Danisco สหรัฐอเมริกา Inc (Madison, WI) สายพันธุ์ที่ได้รับการแพร่กระจาย ST ที่ 37 ° C ในน้ำซุปที่มีแลคโตส M17 [Becton ดิกคินสันและ จำกัด (BD), แฟรงคลินเลคส์, นิวเจอร์ซีย์] ปอนด์และสายพันธุ์ LL ได้รับการปลูกฝังในแมนเดกรด, Rogosa และชาร์ป (MRS) น้ำซุป (pH 5.4; BD) และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจน (10% ก๊าซคาร์บอนไฮโดรเจน 5% และไนโตรเจน 85%) . วัฒนธรรมหุ้นที่เตรียมจากวัฒนธรรมในชั่วข้ามคืนโดยการรวมปริมาณที่เท่ากันของน้ำซุปและกลีเซอรีน 20% (น้ำหนัก / ปริมาตร; Sigma-Aldrich คอร์ปเซนต์หลุยส์) และได้รับการจัดเก็บไว้ที่ -80 ° C.Primers สำหรับสายพันธุ์แต่ละ ST อยู่ de-เซ็นสัญญากับตำแหน่งเป้าหมาย CRISPR ระบุก่อนหน้านี้ในสายพันธุ์เหล่านี้ (ภาคยานุวัติ GenBank ไม่มี EF434468 และ EF434469. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/; ตารางที่ 1. Barrangou et al, 2007) ไพรเมอร์ที่กำหนดไว้สำหรับ LB ถูกออกแบบมาเพื่อกำหนดเป้าหมายสถานที่ CRISPR บนพื้นฐานของข้อมูลลำดับการให้บริการโดยผู้จัดจำหน่ายวัฒนธรรม เพราะลำดับ CRISPR ก็ไม่สามารถใช้ได้สำหรับ LL, ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบเพื่อกำหนดเป้าหมายลำดับในระบบ phos-photransferase ที่ mannitol เฉพาะยีน Compo-nent IIbC (ภาคยานุวัติ GenBank ไม่มี. AF496224.1) ERS-Prim ได้รับการออกแบบด้วยไพรเมอร์ระเบิด (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC = BlastHome) และความจำเพาะไพรเมอร์ได้รับการประเมินใน silico และ PCR แบบเดิม . Agarose เจลไฟฟ้า-trophoresis ถูกใช้ในการยืนยันว่า amplicon เดียวของขนาดที่ถูกต้องถูกผลิตสำหรับสายพันธุ์เป้าหมายและไม่ข้ามปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นกับแต่ละชุดไพรเมอร์สายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงและสายพันธุ์ nontarget ในวัฒนธรรมเริ่มต้นโดยเฉพาะที่ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) การทดลอง .Quantitative PCR ได้ดำเนินการในการระบุอุณหภูมิการหลอมที่ดีที่สุดและความเข้มข้นของไพรเมอร์สำหรับแต่ละชุดไพรเมอร์ (ไม่ได้แสดงข้อมูล) เพิ่มประสิทธิภาพการผสมปฏิกิริยา qPCR ประกอบด้วย iQ SYBR ซูเปอร์สีเขียวผสม (50 ไมโครลิตร; Bio-Rad Laboratories Inc. , ดาว, CA) ไพรเมอร์ที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 50 นาโนเมตรและ Nuclease ฟรีน้ำปริมาณปฏิกิริยาสุดท้ายของ 100 ไมโครลิตร . aliquots (25 ไมโครลิตร) ของปฏิกิริยาผสมถูกจ่ายในบ่อเพิ่มขึ้นสามเท่าและ qPCR ได้ดำเนินการกับ iQ5 แบบ real-time PCR ระบบตรวจจับ (Bio-Rad Laboratories Inc. ) เพิ่มประสิทธิภาพ qPCR tions-สภาพประกอบด้วย 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 35 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 30 วินาที, 64.6 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วินาที ต่อไปนี้ qPCR การวิเคราะห์โค้งละลายได้ดำเนินการที่อุณหภูมิตั้งแต่ 55-95 องศาเซลเซียสกับ 0.5 องศาเซลเซียสที่เพิ่มขึ้นทุก 30 วินาที ข่าวคราว Agarose ถูกใช้ในการตรวจสอบว่าผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาเดียวของขนาดที่อดีตไม่คาดคิดถูกผลิตและข้ามทำปฏิกิริยากับสายพันธุ์อื่น ๆ ในวัฒนธรรมเริ่มต้นก็ไม่เห็น (ไม่ได้แสดงข้อมูล) .Standard โค้งได้จัดทำกับสายพันธุ์ของแต่ละคนถูกแทงใน โยเกิร์ตผสม ผสมโยเกิร์ตที่ได้รับการจัดทำขึ้นโดยการรวม 7: 1 น้ำและไม่มีน้ำมันนมผงแห้งในกระป๋องสแตนเลสขนาดใหญ่ (สุดท้าย concen-เคี้ยว 12.5% ​​ของแข็งที่ไม่ไขมันนม) ผสมถูกความร้อนถึง 200 ° F (93.3 ° C) เป็นเวลา 45 นาทีกับการกวนอย่างต่อเนื่องและเย็นแล้วและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศา C.Aliquots สายพันธุ์ที่ปลูกในแต่ละ M17 ด้วยครั่ง-Tose หรือน้ำซุป MRS กรด (45 มิลลิลิตร) ถูกย้าย ที่จะผ่านการฆ่าเชื้อ 50 มิลลิลิตรหลอด centrifuge และปั่นเป็นเวลา 5 นาทีที่ 1,250 × g (เบคค์ GPR centrifuge; เบ็คคนเครื่องมืออิงค์ฟุลเลอร์, CA) สารละลายทิ้งและเซลล์เม็ดถูก resuspended ใน 0.1% Polypeptone (BD) เพื่อให้ได้ความเข้มข้นของเซลล์ประมาณ 109 โคโลนี / มิลลิลิตร เจือจางอนุกรมได้จัดทำขึ้น 0.1% Polypeptone (BD) และเซลล์ concen-trations ถูกกำหนดโดยการชุบ เจือจางอนุกรมสายพันธุ์ ST ถูกชุบซ้ำกันใน M17 วุ้นตารางที่ 1 ไพรเมอร์สายพันธุ์เฉพาะสำหรับสายพันธุ์เชื้อในเชิงพาณิชย์และแลคโตบาซิลลัส farciminis (LF) ATCC 29644TTarget microorganism1Primer name2Sequence (5c → 3c) เนื้อหา GC (%) TM3 (° C) ที่คาดว่าจะ ผลิตภัณฑ์ (bp) ST DGCC77967796fGGTCTGTAATTTCATTCCCTCGT43.454.8877796rCCGCATGTGTTTAGAGAAACC47.654.1ST ACTCTCAAACTCGT47.855.484LFrTATCGCGCAGTTTTCGGTGT50.057.31ST DGCC7796 และ ST DGCC7710 Streptococcus thermophilus = (ST) สายพันธุ์; LB = Lactobacillus delbrueckii เอสเอส bulgaricus; LL = Lactobacillus delbrueckii เอสเอส lactis.2f = ไพรเมอร์ไปข้างหน้า; r = ย้อนกลับความเครียด primer.3Melting temperature.4This ถูกใช้เป็นตัวควบคุมภายนอกและไม่ได้เป็นส่วนหนึ่งของวัฒนธรรมเริ่มต้นในเชิงพาณิชย์.
4870MILLER ET AL.Journal ของนมวิทยาศาสตร์ฉบับ 95 ฉบับที่ 9, 2012with แลคโตส (BD) และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง (IDF, 1988) เจือจางอนุกรมของสายพันธุ์และ LB LL เป็นปลา

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หน้า :
1
5
4868j ผลิตภัณฑ์นมและสภาวะโลกร้อน 95 : 4868 – 4872http://dx.doi.org/ 10.3168/jds.2012-5445 สงวนลิขสิทธิ์อเมริกันสมาคมวิทยาศาสตร์ผลิตภัณฑ์นม® 2012 นามธรรมโยเกิร์ตเริ่มต้นวัฒนธรรมอาจประกอบด้วยหลายสายพันธุ์ Lactobacillus delbrueckii ssp . bulgaricus ( ปอนด์ ) และ Streptococcus เทอร์มอฟิลัส ( ST )วิธีการตรวจสอบแบบชุบปอนด์และเซนต์ระดับผลิตโยเกิร์ตไอเอ็นจีน่ะไม่อนุญาตให้สำหรับการบอกจำนวนของสายพันธุ์ของแต่ละบุคคล วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้คือ เพื่อพัฒนาวิธี PCR เชิงปริมาณเพื่อ tification เฉวียนของสายพันธุ์ในแต่ละโยเกิร์ตพาณิชย์เริ่มต้นวัฒนธรรม โดยเฉพาะสายพันธุ์ที่ถูกออกแบบมาสำหรับ 2 สายพันธุ์ ( St dgcc7796 เซนต์และเซนต์ dgcc7710 )ปอนด์ 1 สายพันธุ์ ( dgcc4078 ) และ 1 delbrueckiissp Lactobacillus . lactis สายพันธุ์ ( ll ; dgcc4550 ) ไพรเมอร์สำหรับแต่ละสายพันธุ์และเซนต์ปอนด์ถูกออกแบบมาเพื่อเป้าหมายเฉพาะลำดับ DNA ในกลุ่มเสมอ อินเตอร์ spersed สั้นพาลินโดรมิควนกลับมาที่เดิม ไพรเมอร์สำหรับจะถูกออกแบบมาเพื่อเป้าหมายเฉพาะ iibc mannitol ซึ่งเป็นส่วนประกอบของระบบ phosphotransferase .ติดตามประเมินผลอิงไพรเมอร์ต่อมาตรฐานเส้นโค้ง Re lating จํานวนเซลล์วงจรเกณฑ์เตรียมสำหรับแต่ละบุคคลและความเครียดในการผสมโยเกิร์ต และไม่มีความแตกต่างในความลาดชันลดลง ข้อมูลความสมดุลความเครียดคือเก็บโยเกิร์ตที่เตรียมที่ 41 และ 43 องศา C เพื่อแสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ในการใช้วิธีนี้ คำสำคัญ : วัฒนธรรมเริ่มต้นบ thermophi lus , Lactobacillus delbrueckii รายงานปริมาณการใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ( qpcr ) เทคนิค หมายเหตุ โยเกิร์ตเริ่มต้นวัฒนธรรมมักจะประกอบด้วยหลายสายพันธุ์ Lactobacillus delbrueckii ssp . bulgaricus ( ปอนด์ ) และ Streptococcus เทอร์มอฟิลัส ( เซนต์ ; และ ( ซีโอโอแคลร์ , 1983 ) แลคโตบาซิลัส delbrueckii ssp .bulgaricus และเซนต์สายพันธุ์สามารถแตกต่างกันเกี่ยวกับอุณหภูมิการเจริญเติบโตที่เหมาะสมและการผลิตกรด กลิ่นรส , สารและใช้ผลิตในระหว่างการหมัก ( imhof et al . , 1995 ; tamime ปล้น inson , 1999 ; บรอดเบนต์ et al . , 2003 ) ดังนั้น สายพันธุ์ โดยเฉพาะไว้สำหรับการเริ่มต้นทางการค้า วัฒนธรรม ดังนั้นภายใต้ชุดของเงื่อนไขที่เฉพาะเจาะจง ( เช่นโยเกิร์ตสูตรผสมและอุณหภูมิ ) , ความเครียดสมดุลความเป็นกรดส่งเสริมอย่างรวดเร็วในขณะที่ produc ing ผลิตภัณฑ์ที่ต้องการคุณภาพทางประสาทสัมผัสและ Chandan o'rell , 2006 ) ในบางครั้ง อาจเป็นสิ่งที่จำเป็นหรือต้องการเปลี่ยนสูตรโยเกิร์ตผสมหรือสภาวะการหมักแต่การเติบโตดังกล่าวสามารถเปลี่ยนโปรไฟล์และความสมดุลของแต่ละสายพันธุ์ ( และรัดเก้ มิเชล sandine , 1986 ) ปกติวิธีชุบสีขาว lowing ST และปอนด์ระดับระหว่างโยเกิร์ตผลิตต้อง 48 ถึง 72 ชั่วโมง และไม่อนุญาตให้สำหรับการ สายพันธุ์ แต่ละสายพันธุ์ของชนิดเดียวกัน หรือเพราะเป็น phenotypically คล้ายกับชนิดย่อย ( IDF , 1988 ) ในบางกรณีเทคนิคระดับโมเลกุล เช่น quantita tive PCR ( qpcr ) ซึ่งสามารถแยกแยะระหว่างสายพันธุ์ แต่ละตัว จะช่วยปรับปรุงความเข้าใจของความสัมพันธ์ระหว่างความสมดุลความเครียดและคุณภาพของผลิตภัณฑ์ การวิจัยครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาวิธีการตรวจสอบ qpcr สายพันธุ์ในแต่ละวัฒนธรรมในช่วงเริ่มต้นธุรกิจไอศกรีมผลิตการพัฒนาวิธีการตรวจสอบ qpcr indi vidual สายพันธุ์คือการกำหนดลำดับเฉพาะ ซึ่งสามารถใช้เป็นเป้าหมายสำหรับรองพื้น กลุ่มเป็นประจำสลับสั้น พาลินโดรมิคเป็นพรุ ( crispr ) ลำดับ ซึ่งแสดงให้เป็นที่แพร่หลายในจีโนมของแบคทีเรียกรดแลคติกใน cluding Lactobacillus spp . ) และ Streptococcus spp .ที่ได้แสดงเป็นตัวแปรอย่างมากที่ช่วยให้ differentia tion ในระดับความเครียด ( ฮอร์วาธ et al . , 2008 , 2009 ) การ crispr ลำดับประกอบด้วยสลับลำดับซ้ำที่สั้น และมีการอนุรักษ์และ spacers ซึ่งเป็นตัวแปรอย่างมาก เซนต์ สายพันธุ์ลำดับที่ 36 BP ซ้ำมักจะมีความยาวและทำซ้ำสำหรับปอนด์มักจะระหว่าง 28 และ 30 BP ในความยาว ( ฮอร์วาธ et al . , 2008 , 2009 ) ที่ซ้ำกันจะถูกแยกออกโดย spacers ที่มีลำดับมักมาจากโรงพยาบาลและดีเอ็นเอต่างประเทศอื่น ๆและปรึกษารีซิซไปว่าโจมตี ( barrangou et al . , 2007 )แตกต่าง ences ในจํานวนซ้ำและ spacers เช่นเดียวกับการจัดเรียงลำดับของ spacers และได้พบในเซนต์ สายพันธุ์ ( ฮอร์วาธ et al . , 2008 ) หมายเหตุทางเทคนิค : การพัฒนาวิธี PCR เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงเชิงปริมาณความเครียดในระหว่างการผลิต ดี เอ็ม มิลเลอร์ โยเกิร์ต เช่น ดัดลีย์ และ R . F . โรเบิร์ต 1 ภาควิชาวิทยาศาสตร์การอาหาร , Pennsylvania State University ,มหาวิทยาลัยพาร์ค 16802 ได้รับกุมภาพันธ์ 19 , 2012 ยอมรับ เมษายน 15 , 2012 1 ผู้ที่สอดคล้องกัน : [e-mail]
วารสารวิทยาศาสตร์น้ำนมฉบับที่ 95 ฉบับที่ 9 , หมายเหตุ 2012technical : วิธี PCR สำหรับ strains4869in ปริมาณเชื้อจุลินทรีย์การศึกษา 2 St พาณิชย์ ( dgcc7796 สายพันธุ์และสายพันธุ์ 7710 ) 1 ปอนด์ ( dgcc4078 ) และแลคโตบาซิ delbrueckii 1 ssp . lactis สายพันธุ์ ( ll ;dgcc4550 ) ที่ได้รับจาก danisco อเมริกาอิงค์ ( Madison , WI ) เริ่มต้นที่ 37 ° C จำนวนสายพันธุ์ ในน้ำซุปด้วย m17 แล็กโตส [ เบคตอนดิกคินสันและ บริษัท ( BD ) , Franklin Lakes , NJ ) โดยปอนด์และจะสายพันธุ์ปลูกในที่ปรับ rogosa เดอแมน และ ชาร์ป ( นาง ) น้ำ ( pH 5.4 ; BD ) บ่มที่ 37 ° C ภายใต้สภาวะไร้อากาศ ( 10 % 5 % ไฮโดรเจนคาร์บอนไดออกไซด์และ 85% ไนโตรเจน )หุ้นวัฒนธรรมที่เตรียมจากวัฒนธรรมในชั่วข้ามคืน โดยรวมเท่ากับปริมาณของน้ำซุปและ 20 % กลีเซอรอล ( wt / Vol ; ซิกม่า Aldrich Corp . , St . Louis , MO ) และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 80 องศา บริษัท เวสเทิร์น c.primers สำหรับสายพันธุ์ ST แต่ละตัว เดอ ลงนามเพื่อเป้าหมายของ crispr ก่อนหน้านี้ระบุในสายพันธุ์เหล่านี้ ( และไม่พบการ ef434468 ef434469 ; ตารางที่ 1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ ; ;barrangou et al . , 2007 ) ไพรเมอร์ตั้งปอนด์ถูกออกแบบมาเพื่อเป้าหมาย crispr ความเชื่อตามข้อมูลลำดับโดยวัฒนธรรมของซัพพลายเออร์ เพราะ crispr ลำดับไม่พร้อมใช้งานสำหรับจะโดยออกแบบมาเพื่อเป้าหมายลำดับใน phos photransferase ระบบ mannitol เฉพาะ iibc คอมโปถาวร ยีน ( ขนาดเข้าไม่ af496224.1 )พริม ERS ถูกออกแบบด้วยระเบิด ไพรเมอร์ ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi ? link_loc = blasthome ) และไพรเมอร์ชนิดถูกประเมินสำหรับและโดยวิธีปกติเจลผลไม้ trophoresis ถูกใช้เพื่อยืนยันว่าเป็นเดี่ยวและขนาดถูกต้อง เป็นการผลิตเพื่อเป้าหมายความเครียดและไม่มีปฏิกิริยาข้ามเกิดขึ้นกับแต่ละสายพันธุ์และสายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงเช่นชุด nontarget ในที่เฉพาะเจาะจงกล้าเชื้อ ( ข้อมูลไม่แสดง )โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อระบุการทดลองเชิงปริมาณที่เหมาะสมสำหรับแต่ละความเข้มข้นและอุณหภูมิการอบอ่อนรองพื้นไพรเมอร์ชุด ( ข้อมูลไม่แสดง ) เพิ่มประสิทธิภาพ qpcr ปฏิกิริยาผสมประกอบด้วยไอคิว SYBR เขียวผสม ( 50 μล. ชีวภาพราดห้องปฏิบัติการอิงค์ , Hercules , CA ) , ไพรเมอร์ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 50 nm และนิวเคลียสน้ำฟรีสำหรับปริมาตรปฏิกิริยาสุดท้ายของ 100 μ Lเฉยๆ ( 25 μ L ) ของปฏิกิริยาที่ผสมอยู่ในบ่อเริ่มงานทำสำเนาสามฉบับ และ qpcr ดำเนินการกับ iq5 เรียลไทม์พีซีอาร์ ระบบตรวจจับ ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ Inc . ) เหมาะ qpcr condi tions จำนวน 95 องศา C เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 35 รอบ 95 องศา C 30 S , 64.6 ° C เป็นเวลา 30 วินาที และ 72 ° C เป็นเวลา 10 วินาที ตาม qpcr ละลายการวิเคราะห์ทางโค้ง ทำการศึกษาที่อุณหภูมิตั้งแต่ 55 ถึง 95 องศา Cกับ 0.5 ° C เพิ่มขึ้นทุกๆ 30 วินาที เจลอิเลคโตรโฟรีซีสถูกใช้เพื่อตรวจสอบว่าผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาเดียวของ pected EX ขนาดทดลองผลิต และปฏิกิริยาข้ามกับสายพันธุ์อื่น ๆ ในการเริ่มต้นเลี้ยงไม่ได้สังเกต ( ข้อมูลไม่แสดง ) เส้นโค้งมาตรฐานเตรียมกับสายพันธุ์แต่ละ spiked ในโยเกิร์ตผสม โยเกิร์ตผสมเตรียมโดยการรวม 7 : 1 น้ำ และไม่มีไขมันน้ำนมผงแห้งในถังสแตนเลสขนาดใหญ่ ( สุดท้าย concen มลภาวะ 12.5% ของแข็งนมไม่อ้วน ) ส่วนผสมก็ร้อนถึง 200 องศา F ( 93.3 ° C ) 45 นาที และคงไม่เย็นแล้วเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศา c.aliquots ของแต่ละสายพันธุ์ที่ปลูกใน m17 ด้วยครั่ง หรือปรับ tose MRS broth ( 45 ml ) คือ หมัน , 50 ml ขายขาดไฟฟ้าสำหรับ 5 นาทีที่ 1× 250 กรัม ( แบคแมน gpr centrifuge ; เบ็คแมนเครื่องมืออิงค์ ฟูลเลอร์ตัน ( CA ) และน่านถูกทิ้งและอยู่ในเซลล์เม็ด resuspended 0.1% polypeptone ( BD ) ผลผลิตเซลล์ความเข้มข้นประมาณ 109 CFU / ml วิธีการเตรียมอนุกรมใน 0.1% polypeptone ( BD ) และเซลล์ concen trations ถูกกำหนดโดยการชุบซีเรียลเจือจางเซนต์สายพันธุ์ชุบซ้ำบน m17 วุ้นในตาราง 1 สายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงเพื่อเริ่มต้นการค้าวัฒนธรรมและดีเอ็นเอสายพันธุ์ Lactobacillus farciminis ( LF ) และ 29644ttarget microorganism1primer name2sequence ( 5C → keyboard - key - name 3C ) GC content ( % ) tm3 ( ° C ) ที่คาดว่าผลิตภัณฑ์ ( BP ) dgcc77967796fggtctgtaatttcattccctcgt43.454.8877796rccgcatgtgtttagagaaacc47.654 ST .