Zinc finger nucleases (ZFN) are pow

Zinc finger nucleases (ZFN) are powerful tools for editing genes in cells. Here we use ZFNs to interrogate the biological function of ADPGK, which encodes an ADP-dependent glucokinase (ADPGK), in human tumour cell lines. The hypothesis we tested is that ADPGK utilises ADP to phosphorylate glucose under conditions where ATP becomes limiting, such as hypoxia. We characterised two ZFN knockout clones in each of two lines (H460 and HCT116). All four clones had frameshift mutations in all alleles at the target site in exon 1 of ADPGK, and were ADPGK-null by immunoblotting. ADPGK knockout had little or no effect on cell proliferation, but compromised the ability of H460 cells to survive siRNA silencing of hexokinase-2 under oxic conditions, with clonogenic survival falling from 21±3% for the parental line to 6.4±0.8% (p = 0.002) and 4.3±0.8% (p = 0.001) for the two knockouts. A similar increased sensitivity to clonogenic cell killing was observed under anoxia. No such changes were found when ADPGK was knocked out in HCT116 cells, for which the parental line was less sensitive than H460 to anoxia and to hexokinase-2 silencing. While knockout of ADPGK in HCT116 cells caused few changes in global gene expression, knockout of ADPGK in H460 cells caused notable up-regulation of mRNAs encoding cell adhesion proteins. Surprisingly, we could discern no consistent effect on glycolysis as measured by glucose consumption or lactate formation under anoxia, or extracellular acidification rate (Seahorse XF analyser) under oxic conditions in a variety of media. However, oxygen consumption rates were generally lower in the ADPGK knockouts, in some cases markedly so. Collectively, the results demonstrate that ADPGK can contribute to tumour cell survival under conditions of high glycolytic dependence, but the phenotype resulting from knockout of ADPGK is cell line dependent and appears to be unrelated to priming of glycolysis in these lines. © 2013 Richter et al.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สังกะสี nucleases นิ้ว (ZFN) เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับแก้ไขยีนในเซลล์ ที่นี่เราใช้ ZFNs เพื่อไต่สวนการทำงานทางชีวภาพของ ADPGK ซึ่งจแมป glucokinase ADP-ขึ้นอยู่กับ (ADPGK), ในบรรทัดของเซลล์เนื้องอกที่มนุษย์ สมมติฐานที่เราทดสอบเป็นว่า ADPGK utilises ADP phosphorylate น้ำตาลในสภาวะที่ ATP จะจำกัด เช่น hypoxia เราประสบการ์โคลนชนะน็อกโดยเทคนิค ZFN สองในแต่ละบรรทัดสองบรรทัด (H460 และ HCT116) โคลนทั้งหมดสี่มี frameshift กลายพันธุ์ alleles ทั้งหมดที่เว็บไซต์เป้าหมายใน exon 1 ของ ADPGK และมี ADPGK เป็น null โดย immunoblotting ชนะน็อกโดยเทคนิค ADPGK มีผลน้อย หรือไม่มีเซลล์การงอก แต่ทำลายความสามารถของเซลล์ H460 เพื่อความอยู่รอด siRNA silencing hexokinase-2 ภายใต้เงื่อนไข oxic มีรอด clonogenic ลดลงจาก 21±3% สำหรับบรรทัดหลัก 6.4±0.8% (p = 0.002) และ 4.3±0.8% (p = 0.001) สำหรับ knockouts สอง ที่ความไวเพิ่มขึ้นคล้ายการฆ่าเซลล์ clonogenic ถูกพบภายใต้ anoxia ไม่เปลี่ยนแปลงเช่นตรวจพบเมื่อมีโบว์ลิ่งออก ADPGK ในเซลล์ HCT116 บรรทัดโดยผู้ปกครองไม่น้อยสำคัญกว่า H460 anoxia และ silencing hexokinase-2 ในขณะที่ของ ADPGK ในเซลล์ HCT116 เกิดการเปลี่ยนแปลงบางอย่างในยีนส่วนกลาง ของ ADPGK ใน H460 เซลล์เกิดขึ้นควบคุมบรรยากาศของ mRNAs ที่เข้ารหัสโปรตีนยึดเกาะเซลล์ จู่ ๆ เราไม่สามารถแยกแยะผล glycolysis วัดจากปริมาณการใช้น้ำตาลกลูโคสหรือก่อ lactate ภายใต้ anoxia ไม่สอดคล้องกัน หรือยู extracellular อัตรา (คุณอัญชนา analyser) ภายใต้เงื่อนไข oxic ในความหลากหลายของสื่อ อย่างไรก็ตาม อัตราการใช้ออกซิเจนต่ำโดยทั่วไปใน knockouts ADPGK ในบางกรณีอย่างเด่นชัดเพื่อให้ โดยรวม ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า ADPGK สามารถนำไปสู่ความอยู่รอดของเซลล์เนื้องอกภายใต้เงื่อนไขของการพึ่งพา glycolytic สูง แต่ phenotype ที่เกิดจากของ ADPGK เป็นรายการเซลล์ขึ้น และปรากฏให้เห็นด้วยของ glycolysis ในบรรทัดเหล่านี้ © 2013 ถือ et al

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

nucleases นิ้วสังกะสี (ZFN) เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการแก้ไขยีนในเซลล์ ที่นี่เราใช้ ZFNs การสอบปากคำฟังก์ชันทางชีวภาพของ ADPGK ซึ่ง encodes glucokinase ADP ขึ้นอยู่กับ (ADPGK) ในมนุษย์สายพันธุ์เซลล์เนื้องอก สมมติฐานที่เราทดสอบก็คือว่า ADPGK ใช้ ADP จะ phosphorylate กลูโคสภายใต้เงื่อนไขที่เอทีพีจะกลายเป็นข้อ จำกัด เช่นการขาดออกซิเจน เราสองลักษณะ ZFN โคลนที่น่าพิศวงในแต่ละเส้นสองเส้น (H460 และ HCT116) ทั้งสี่โคลนมีการกลายพันธุ์ frameshift ในอัลลีลทั้งหมดในเว็บไซต์เป้าหมายในเอกซ์ซอน 1 จาก ADPGK และเป็น ADPGK โมฆะโดย immunoblotting ADPGK ที่น่าพิศวงมีผลน้อยหรือไม่มีเลยในการเพิ่มจำนวนเซลล์ แต่ทำลายความสามารถของเซลล์ H460 เพื่อความอยู่รอดของสมร siRNA hexokinase-2 ภายใต้เงื่อนไข Oxic กับการอยู่รอด clonogenic ลดลงจาก 21 ± 3% สำหรับสายผู้ปกครอง 6.4 ± 0.8% (P = 0.002) และ 4.3 ± 0.8% (p = 0.001) สำหรับสอง knockouts ความไวที่เพิ่มขึ้นคล้ายกับการฆ่าเซลล์ clonogenic พบภายใต้การล้มเหลว ไม่มีการเปลี่ยนแปลงดังกล่าวถูกพบเมื่อ ADPGK ถูกเคาะออกมาในเซลล์ HCT116 ซึ่งสายผู้ปกครองที่มีความสำคัญน้อยกว่าที่จะล้มเหลว H460 และ hexokinase-2 สมร ในขณะที่ที่น่าพิศวงของ ADPGK ในเซลล์ HCT116 ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงบางอย่างในการแสดงออกของยีนในระดับโลกที่น่าพิศวงของ ADPGK ใน H460 เซลล์ที่เกิดขึ้นเด่นระเบียบของ mRNAs เข้ารหัสโปรตีนยึดเกาะเซลล์ น่าแปลกที่เราสามารถมองเห็นผลที่สอดคล้องกับ glycolysis วัดจากการบริโภคน้ำตาลหรือนมภายใต้รูปแบบการล้มเหลวหรืออัตรากรด extracellular (วิเคราะห์ซีฮอร์ XF) ภายใต้เงื่อนไขที่ Oxic ในความหลากหลายของสื่อ แต่อัตราการใช้ออกซิเจนโดยทั่วไปต่ำกว่าใน knockouts ADPGK ในบางกรณีเพื่อให้โดดเด่น รวมผลแสดงให้เห็นว่า ADPGK สามารถนำไปสู่​​การอยู่รอดของเซลล์มะเร็งอยู่ภายใต้เงื่อนไขของการพึ่งพาอาศัย glycolytic สูง แต่ต้นที่เกิดจากการที่น่าพิศวงของ ADPGK เป็นสายพันธุ์ของเซลล์ขึ้นและดูเหมือนจะไม่เกี่ยวข้องกับรองพื้นของ glycolysis ในบรรทัดเหล่านี้ © 2013 ริกเตอร์และอัล

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

nucleases สังกะสีนิ้ว ( zfn ) เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการตัดต่อยีนในเซลล์ ที่นี่เราใช้ zfns สอบปากคำฟังก์ชันทางชีวภาพของ adpgk ซึ่งเข้ารหัสเป็น ADP ขึ้นอยู่กับไคเนส ( adpgk ) ในเซลล์เนื้องอกในมนุษย์ สมมติฐานที่เราทดสอบที่ใช้เพื่อ phosphorylate adpgk ADP ATP กลายเป็นกลูโคส ภายใต้เงื่อนไขที่จำกัด เช่น สมองขาดอ๊อกซิเจนเรานับสองโคลนมหัศจรรย์ zfn ในแต่ละสองเส้น ( h460 และ hct116 ) ทั้งหมด 4 โคลนมีการกลายพันธุ์ในยีนทั้งหมด 3 ที่เป้าหมายเว็บไซต์ใน exon 1 adpgk และ adpgk null แพง . adpgk น็อกไม่มีผลหรือมีผลเพียงเล็กน้อยต่อการทำลายเซลล์ แต่ในเซลล์ เพื่อความอยู่รอดของบริษัท h460 ปิดปากของ hexokinase-2 ภายใต้สภาวะออกซิก ,กับ clonogenic การอยู่รอดลดลงจาก 21 ± 3% สำหรับบรรทัดของผู้ปกครอง 6.4 ± 0.8% ( p = 0.002 ) และ 4.3 ± 0.8% ( p = 0.001 ) สำหรับสอง knockouts . ลักษณะความไวเพิ่มขึ้น clonogenic เซลล์จะพบว่าภายใต้การขาดอากาศหายใจ ไม่มีการเปลี่ยนแปลงดังกล่าวถูกพบเมื่อ adpgk ถูกเคาะออกมาใน hct116 เซลล์ที่บรรทัดผู้ปกครองน้อยอ่อนไหวกว่าที่ h460 ให้ข้อมูลข่าวสารและ hexokinase-2 ปิดปาก .ในขณะที่น่าพิศวงของ adpgk hct116 เซลล์ที่เกิดการเปลี่ยนแปลงในไม่กี่ในการแสดงออกของยีนที่น่าพิศวงของโลก adpgk ใน h460 เซลล์ทำให้เด่นขึ้นการควบคุมของรหัสการเข้ารหัสเซลล์พังผืดโปรตีน จู่ ๆ เราอาจจะมองเห็นไม่สอดคล้องต่อไกลโคไลซิสเป็นวัดโดยการบริโภคกลูโคสหรือการขาดอากาศหายใจและใต้ ,หรือสามารถสร้างอัตรา ( Seahorse XF Analyser ) ภายใต้สภาวะออกซิกในสื่อที่หลากหลาย อย่างไรก็ตาม อัตราการใช้ออกซิเจนโดยทั่วไปลดลงใน adpgk knockouts ในบางกรณีอย่างเด่นชัดมาก โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ที่แสดงให้เห็นว่า adpgk สามารถสนับสนุนการอยู่รอดของเซลล์เนื้องอก ภายใต้เงื่อนไขของการพึ่งพาสูง glycolytic ,แต่การน็อกของ adpgk เป็นเซลล์ที่เกิดจากเส้น และดูเหมือนจะไม่เกี่ยวข้องกับรองพื้นของไกลโคไลซิสในบรรทัดเหล่านี้ สงวนลิขสิทธิ์ 2555 ริกเตอร์ et al .