We describe a simple calcium phosph

We describe a simple calcium phosphate transfection protocol and neo marker vectors that achieve highly efficient transformation of mammalian cells. In this protocol, the calcium phosphate-DNA complex is formed gradually in the medium during incubation with cells and precipitates on the cells. The crucial factors for obtaining efficient transformation are the pH (6.95) of the buffer used for the calcium phosphate precipitation, the CO2 level (3%) during the incubation of the DNA with the cells, and the amount (20 to 30 ,ug) and the form (circular) of DNA. In sharp contrast to the results with circular DNA, linear DNA is almost inactive. Under these conditions, 50% of mouse L(A9) cells can be stably transformed with pcDneo, a simian virus 40-based neo (neomycin resistance) marker vector. The NIH3T3, C127, CV1, BHK, CHO, and HeLa cell lines were transformed at efficiencies of 10 to 50% with this vector and the neo marker-incorporated pcD vectors that were used for the construction and transduction of cDNA expression libraries as well as for the expression of cloned cDNA in mammalian cells.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เราอธิบายแบบง่ายแคลเซียมฟอสเฟต transfection โพรโทคอลและนีโอเครื่องหมายเวกเตอร์ที่บรรลุการเปลี่ยนแปลงที่มีประสิทธิภาพสูงของเซลล์ mammalian ในโพรโทคอลนี้ คอมเพล็กซ์แคลเซียมฟอสเฟตดีเอ็นเอจะเกิดขึ้นเรื่อย ๆ ในสื่อในระหว่างการบ่มเซลล์ และ precipitates ในเซลล์ ปัจจัยสำคัญสำหรับการได้รับการเปลี่ยนแปลงที่มีประสิทธิภาพ (6.95) pH ของบัฟเฟอร์ที่ใช้สำหรับฝนแคลเซียมฟอสเฟต ระดับ CO2 (3%) ในระหว่างการฟักตัวของดีเอ็นเอ เซลล์ ยอด (20 ถึง 30 ยูจี) และแบบฟอร์ม (กลม) ของดีเอ็นเอได้ ในความคมชัดคมชัดเพื่อผลลัพธ์ที่มีดีเอ็นเอแบบวงกลม เส้นดีเอ็นเอไม่ได้ใช้งานเกือบ ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ 50% ของเซลล์ L(A9) เมาส์สามารถ stably ที่แตกต่าง pcDneo ไวรัสสิมิลัน 40 ใช้ neo (นีโอมัยซินทน) เครื่องหมายเวกเตอร์ NIH3T3, C127, CV1, BHK ช่อ และเซลล์ HeLa บรรทัดถูกแปลงที่มีประสิทธิภาพ 10-50% นี้เวกเตอร์และเวกเตอร์รวมเครื่องหมาย pcD นีโอที่ใช้สำหรับการก่อสร้างและ transduction cDNA นิพจน์รีเช่นสำหรับนิพจน์ของ cDNA โคลนใน mammalian เซลล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เราอธิบายแคลเซียมฟอสเฟตง่ายโปรโตคอล transfection และเครื่องหมายเวกเตอร์ใหม่ที่ประสบความสำเร็จการเปลี่ยนแปลงที่มีประสิทธิภาพสูงของเซลล์ที่เลี้ยงลูกด้วยนม ในโปรโตคอลนี้ซับซ้อนแคลเซียมฟอสเฟตดีเอ็นเอจะค่อยๆก่อตัวขึ้นในระดับปานกลางในระหว่างการเพาะเซลล์และตกตะกอนในเซลล์ ปัจจัยที่สำคัญอย่างยิ่งสำหรับการได้รับการเปลี่ยนแปลงที่มีประสิทธิภาพมีความเป็นกรดด่าง (6.95) ของบัฟเฟอร์ที่ใช้สำหรับการตกตะกอนแคลเซียมฟอสเฟตระดับ CO2 (3%) ในระหว่างการบ่มของดีเอ็นเอกับเซลล์และจำนวนเงินที่ (20-30, ไมโครกรัม) และรูปแบบ (วงกลม) ของดีเอ็นเอ ในทางตรงกันข้ามคมชัดในการผลกับดีเอ็นเอวงกลมดีเอ็นเอเชิงเส้นไม่ได้ใช้งานเกือบ ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ 50% ของ L เมาส์ (A9) เซลล์สามารถเปลี่ยนเสถียรกับ pcDneo ไวรัสเหมือนลิง 40-based ใหม่ (ต้านทาน NEOMYCIN) เครื่องหมายเวกเตอร์ NIH3T3, C127, CV1, BHK, CHO และ HeLa เซลล์ถูกเปลี่ยนที่มีประสิทธิภาพจาก 10 ถึง 50% กับเวกเตอร์นี้และเครื่องหมายจดทะเบียนใหม่เวกเตอร์ PCD ที่ถูกนำมาใช้สำหรับการก่อสร้างและพลังงานของห้องสมุดการแสดงออกของยีนเช่นเดียวกับ สำหรับการแสดงออกของยีนในเซลล์โคลนเลี้ยงลูกด้วยนม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เราอธิบายง่ายแคลเซียมฟอสเฟตสำหรับโปรโตคอลและนีโอเครื่องหมายเวกเตอร์ที่บรรลุการเปลี่ยนแปลงที่มีประสิทธิภาพสูงของ mammalian เซลล์ ในขั้นตอนนี้ , แคลเซียมฟอสเฟตดีเอ็นเอที่ซับซ้อนจะเกิดขึ้นค่อยๆในกลางระหว่างการบ่มเพาะกับเซลล์ และตะกอนที่เกิดขึ้นในเซลล์ ปัจจัยที่สำคัญสำหรับการได้รับที่มีประสิทธิภาพการแปลงเป็นด่าง ( pH 695 ) ของบัฟเฟอร์ที่ใช้สำหรับแคลเซียมฟอสเฟตตกตะกอนระดับ CO2 ( 3% ) ในระหว่างการบ่มของ DNA กับเซลล์และปริมาณ ( 20 - 30 ไมโครกรัม ) และรูป ( วงกลม ) ของดีเอ็นเอ ในคมชัดกับผลลัพธ์กับวงกลมดีเอ็นเอดีเอ็นเอเส้นเกือบจะไม่ได้ใช้งาน ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ , 50% ของเมาส์หนู ( A9 ) เซลล์สามารถเปลี่ยนกับ pcdneo อย่างถาวร ,นีโอ เป็นลิงจากไวรัส ( มีเดียวิกิต้านทาน ) เวกเตอร์เครื่องหมาย การ nih3t3 c127 cv1 BHK , , , , โชล่าเซลล์ และเปลี่ยนแปลงในประสิทธิภาพของ 10 ถึง 50% ที่มีเวกเตอร์และเวกเตอร์เครื่องหมายจดทะเบียนของกรมควบคุมมลพิษนีโอที่ถูกใช้สำหรับการก่อสร้างและการแปรของห้องสมุดการแสดงออกยีนเช่นเดียวกับการแสดงออกของยีนในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม
โคลน .