2. Materials and methods
2.1. Materials
Two reference samples were used in the current study: (1) nutraceutical-grade konjac flour (NKF) (>99% glucomannan) obtained from M&S Colloid Technology Ltd., Hong Kong and (2) low-viscosity konjac flour (LVKF) (>98% glucomannan) purchased from Megazyme International Ireland Ltd., Ireland.
3,5-DNS reagent was prepared by mixing solutions A and B. Solution A was prepared by mixing phenol (0.70 g), 10% (w/w) sodium hydroxide (1.50 ml), deionised (DI) water (5 ml) and sodium bisulphite (0.70 g). Solution B was prepared by mixing potassium sodium tartrate (22.50 g), 10% sodium hydroxide (30 ml) and 1% (w/w) 3,5-DNS (88 ml).
2.2. Preparation of crude konjac flour from fresh corm material
The corm was weighed, washed, with its epidermis removed and sliced into pieces, 2–3 mm in thickness. The corm slices were then immersed in 1% (w/v) sodium bisulphite for 1 min, followed by oven-drying at 120 °C for 40 min. The drying process was continued at 60 °C until a constant weight was obtained. The dried corm slices were subsequently ground and the resultant flour sieved (425 μm aperture) to produce CKF.
2.3. Purification of crude konjac flour
2.3.1. Method 1
CKF (2.00 g) was stirred in 50% (v/v) ethanol (200 ml) for 30 min at room temperature, followed by centrifugation (5000 × g, 30 min, 25 °C) to remove the aqueous ethanol. This procedure was repeated twice under the same conditions by stirring the pellet obtained in freshly prepared 50% (v/v) ethanol after each centrifugation. Subsequently, the resultant pellet was stirred in DI water (200 ml) for 2 h at room temperature followed by centrifugation (9000 × g, 30 min, 25 °C). This procedure was repeated twice under the same conditions by stirring the insoluble materials obtained in DI water, with the supernatants retained after each centrifugation. The supernatants collected were mixed and the volume was reduced to ∼1/3 the original volume by rotary evaporation. Glucomannan present in the solution was precipitated overnight with 95% (v/v) ethanol (600 ml) at 4 °C, followed by centrifugation (9000 × g, 40 min, 25 °C). The resultant pellet was washed twice with anhydrous ethanol (dehydration process) and subsequently isolated by vacuum filtration, before being freeze-dried for 48 h. The dried material was ground and sieved to produce PKF (referred to as PKF1 hereafter).
2.3.2. Method 2
CKF (2.00 g) was stirred in 50% (v/v) ethanol (200 ml) for 90 min at room temperature, followed by centrifugation (5000 × g, 30 min, 25 °C) to remove the aqueous ethanol. The resultant pellet was added to DI water (200 ml) and stirred for 3 h at room temperature. The solution was then diluted to 400 ml with DI water, prior to centrifugation (9000 × g, 30 min, 25 °C) to remove the insoluble materials. Subsequently, rotary evaporation was performed to reduce the volume of the filtrate to ∼1/3 the original volume, followed by KGM precipitation with 95% (v/v) ethanol (450 ml), centrifugation, dehydration, filtration and freeze drying, as described in method 1 to produce PKF (referred to as PKF2 hereafter).
2.4. Comparison of methods for assay of glucomannan content
The reproducibility and accuracy of the 3,5-DNS, phenol–sulphuric acid and enzymatic colorimetric assays were first compared by analysing CKF and LVKF samples in triplicate on different dates under the same experimental conditions. The absorbance readings were determined using a Helios α UV-visible spectrophotometer (Thermo Electron Corp., Rochester). Both glucose and mannose calibration curves were constructed for the 3,5-DNS and phenol–sulphuric acid assays, in order to compare the sensitivity of the assay systems to each reducing sugars. The 3,5-DNS method was further validated before being used for the determination of glucomannan content of PKFs.
2.4.1. 3,5-DNS colorimetric assay
2.4.1.1. Construction of standard d-glucose and d-mannose calibration curves
d-Glucose stock solution (1 mg/ml) was placed (0.40, 0.80, 1.20, 1.60 and 2.00 ml) into 25 ml volumetric flasks, respectively (using DI water as a blank). DI water was then added to the volume of 2.00 ml, followed by the addition of 3,5-DNS (1.50 ml) to each flask. Each mixture was heated for 5 min in a boiling water bath and cooled to room temperature before being diluted to 25 ml with DI water in a volumetric flask. Absorbance was then measured at 550 nm and a plot of the measured absorbance against the glucose content (mg) constructed. A d-mannose standard curve was constructed using the procedure as described for glucose.
2.4.1.2. Preparation of KGM sample solutions and colorimetric reactions
Konjac flour (0.2000 g) was added to a magnetically stirred formic acid–sodium hydroxide buffer (0.1 mol/L; 50 ml) and mixed for 4 h at room temperature. The mixture was then diluted with formic acid–sodium hydroxide buffer to 100 ml in a volumetric flask, followed by centrifugation (4500 × g, 40 min, 25 °C). The KGM sample
2. วัสดุและวิธีการ2.1. วัสดุมาทดสอบการอ้างอิงใช้ในการศึกษาปัจจุบัน: (1) เกรด nutraceutical konjac แป้ง (NKF) (> 99% glucomannan) ได้รับจาก M & S คอลลอยด์เทคโนโลยี จำกัด Hong Kong และ (2) ต่ำความหนืด konjac แป้ง (LVKF) (> glucomannan 98%) ซื้อจาก Megazyme อินเตอร์เนชั่นแนล จำกัดไอร์แลนด์ ไอร์แลนด์รีเอเจนต์ 3,5 DNS ถูกเตรียม โดยวิธีผสม A และ B. โซลูชัน A ถูกเตรียม โดยผสมวาง (0.70 กรัม), 10% (w/w) โซเดียมไฮดรอกไซด์ (1.50 มล), น้ำ (DI) deionised (5 ml) และโซเดียม bisulphite (0.70 กรัม) โซลูชั่นบีที่เตรียม โดยผสมโพแทสเซียมโซเดียม tartrate (22.50 กรัม), 10% โซเดียมไฮดรอกไซด์ (30 มล.) และ 1% (w/w) 3,5-DNS (88 ml)2.2 การเตรียมแป้งดิบ konjac จากวัสดุ corm สดCorm ได้ชั่งน้ำหนัก เครื่องซักผ้า มีหนังกำพร้าถูกเอาออก และหั่นเป็นชิ้น 2 – 3 มิลลิเมตรความหนา ชิ้น corm ได้ดื่มด่ำไปใน bisulphite โซเดียม 1% (w/v) ใน 1 นาที ตาม ด้วยเตาอบที่ 120 ° C สำหรับ 40 นาทีแล้ว ถูกต่อกระบวนการอบแห้งที่ 60 ° C จนกระทั่งน้ำหนักคงได้รับ ชิ้น corm แห้งได้ในเวลาต่อมาดินและผลแก่แป้ง sieved (425 μm รูรับแสง) เพื่อผลิต CKF2.3 การทำให้บริสุทธิ์ของแป้งดิบ konjac2.3.1. วิธีที่ 1CKF (2.00 กรัม) มีกวนในเอทานอล 50% (v/v) (200 มล.) สำหรับ 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ตาม centrifugation (5000 × g, 30 นาที 25 ° C) การเอาเอทานอลอควี ขั้นตอนนี้เป็นซ้ำสองครั้งภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน โดยกวนเม็ดได้ในเอทานอล 50% (v/v) ลิ้มหลัง centrifugation แต่ละ เม็ดผลแก่ในเวลาต่อมา ที่กวนน้ำ DI (200 มล.) สำหรับ h 2 ที่อุณหภูมิห้องตาม centrifugation (9000 × g, 30 นาที 25 ° C) ขั้นตอนนี้เป็นซ้ำสองครั้งภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน โดยกวนวัสดุละลายได้ในน้ำ DI ด้วย supernatants ที่เก็บหลังละ centrifugation Supernatants ที่เก็บรวบรวม และระดับเสียงลดลงเป็น ∼1/3 ไดรฟ์ข้อมูลต้นฉบับ โดยระเหยโรตารี่ Glucomannan ในการแก้ปัญหาไม่ตกตะกอนค้างคืน ด้วย 95% (v/v) เอทานอ (600 มล.) ที่ 4 ° C ตาม centrifugation (9000 × g, 40 นาที 25 ° C) เม็ดผลแก่ล้างสองครั้ง ด้วยเอทานอลได (กระบวนการคายน้ำ) และต่อมาแยกต่างหาก โดยการกรองสุญญากาศ ก่อนที่จะถูกอบแห้งสำหรับ 48 h วัสดุแห้งถูกพื้น และ sieved ผลิต PKF (เรียกว่า PKF1 โดย)2.3.2. วิธีที่ 2CKF (2.00 กรัม) มีกวนในเอทานอล 50% (v/v) (200 มล.) สำหรับ 90 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ตาม centrifugation (5000 × g, 30 นาที 25 ° C) การเอาเอทานอลอควี เม็ดผลแก่เพิ่มน้ำ DI (200 มล) และกวนสำหรับ h 3 ที่อุณหภูมิห้อง การแก้ปัญหาได้แล้วผสมไป 400 ml น้ำ DI ก่อน centrifugation (9000 × g, 30 นาที 25 ° C) การเอาวัสดุไม่ละลายน้ำ ในเวลาต่อมา ระเหยโรตารี่ที่ดำเนินการเพื่อลดปริมาณสารกรองที่เป็น ∼1/3 ไดรฟ์ข้อมูลต้นฉบับ ตาม ด้วยฝน KGM ด้วยเอทานอล 95% (v/v) (450 ml), centrifugation คายน้ำ เครื่องกรอง และตรึงแห้ง ตามที่อธิบายไว้ในวิธีที่ 1 การผลิต PKF (เรียกว่า PKF2 โดย)2.4 การเปรียบเทียบวิธีการวิเคราะห์เนื้อหา glucomannanReproducibility และความถูกต้องของ 3,5 DNS วาง – ซัลฟุริกกรด และเอนไซม์ในระบบการวัดสี assays ถูกแรกเปรียบเทียบ โดยการวิเคราะห์ตัวอย่าง CKF และ LVKF ใน triplicate ในวันที่ต่าง ๆ ภายใต้เงื่อนไขการทดลองเดียวกัน อ่าน absorbance ถูกกำหนดใช้กับเฮลิออสด้วยกองทัพ UV เห็นเครื่องทดสอบกรดด่าง (เทอร์โมอิเล็กตรอน Corp. โรเชสเตอร์) กลูโคสและ mannose โค้งเทียบได้สร้าง 3,5 DNS และวาง – กรด assays เพื่อเปรียบเทียบความไวของการทดสอบระบบแต่ละน้ำตาลลดลง วิธี 3,5 DNS ถูกตรวจสอบเพิ่มเติมก่อนที่จะถูกใช้สำหรับการกำหนดของเนื้อหา glucomannan PKFs2.4.1 การ 3,5 DNS วิเคราะห์เทียบเคียง2.4.1.1 การสร้างส่วนโค้ง d-กลูโคส และ d-mannose ปรับเทียบมาตรฐานd-กลูโคสหุ้นโซลูชัน (1 mg/ml) ถูกวาง (0.40, 0.80, 1.20, 1.60 และ 2.00 ml) เป็น 25 ml volumetric flasks ตามลำดับ (ใช้น้ำ DI เป็นว่างเปล่า) น้ำ DI ถูกเพิ่มไประดับ 2.00 ml ตาม ด้วยการเพิ่ม 3,5-DNS (1.50 ml) จะหนาวแต่ละ แต่ละส่วนผสมสำหรับ 5 นาทีในน้ำน้ำเดือดร้อน และระบายความร้อนด้วยอุณหภูมิห้องก่อนที่จะถูกผสมกับน้ำ DI หนาว volumetric 25 ml แล้วมีวัด absorbance ที่ 550 nm และพล็อตของ absorbance วัดกับเนื้อหากลูโคส (mg) ที่สร้างขึ้น เส้นโค้งมาตรฐาน d mannose ถูกสร้างขึ้นโดยใช้กระบวนการตามที่อธิบายไว้ในกลูโคส2.4.1.2 การเตรียม KGM อย่างโซลูชั่นและปฏิกิริยาเทียบเคียงKonjac แป้ง (0.2000 g) เพิ่มให้คนชำระกรด – โซเดียมไฮดรอกไซด์บัฟเฟอร์ (0.1 โมล/L; 50 มล.) และผสมสำหรับ 4 h ที่อุณหภูมิห้อง ส่วนผสมได้แล้วผสมกับบัฟเฟอร์กรด – โซเดียมไฮดรอกไซด์ 100 ml ในหนาว volumetric ตาม centrifugation (4500 × g, 40 นาที 25 ° C) ตัวอย่าง KGM
การแปล กรุณารอสักครู่..
2. วัสดุและวิธีการ2.1 วัสดุสองตัวอย่างอ้างอิงที่ใช้ในการศึกษาในปัจจุบัน (1) nutraceutical เกรดแป้งบุก (NKF) (> 99% glucomannan) ที่ได้รับจาก M & S คอลลอยด์เทคโนโลยี จำกัด , ฮ่องกงและ (2) แป้งบุกต่ำความหนืด (LVKF) (> 98% glucomannan) ซื้อมาจาก Megazyme อินเตอร์เนชั่นแนล จำกัด ไอร์แลนด์ไอร์แลนด์. สาร 3,5-DNS ถูกจัดทำขึ้นโดยการแก้ปัญหาการผสม A และ B โซลูชั่นที่ถูกจัดทำขึ้นโดยการผสมฟีนอล (0.70 กรัม), 10% (w / w) โซเดียมไฮดรอกไซ (1.50 มล.) deionised (DI) น้ำ (5 มล.) และโซเดียม bisulphite (0.70 กรัม) โซลูชั่น B ถูกจัดทำขึ้นโดยการผสมโซเดียมโพแทสเซียม tartrate (22.50 กรัม), โซดาไฟ 10% (30 มล.) และ 1% (w / w) 3,5-DNS (88 มล.) 2.2 การเตรียมแป้งบุกน้ำมันดิบจากวัสดุหัวสดหัวได้รับการชั่งน้ำหนักล้างกับผิวหนังชั้นนอกที่ถอดออกและหั่นเป็นชิ้น ๆ 2-3 มม ชิ้นหัวถูกแช่อยู่แล้วใน 1% (w / v) bisulphite โซเดียมเป็นเวลา 1 นาทีตามด้วยการอบแห้งที่อุณหภูมิ 120 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 40 นาที กระบวนการอบแห้งได้อย่างต่อเนื่องที่ 60 องศาเซลเซียสจนน้ำหนักคงที่ที่ได้รับ แห้งชิ้นหัวมาบดต่อมาและแป้งผลลัพธ์ร่อน (425 ไมโครเมตรรูรับแสง) ในการผลิต CKF. 2.3 การทำให้บริสุทธิ์ของแป้งบุกน้ำมันดิบ2.3.1 วิธีที่ 1 CKF (2.00 กรัม) ถูกกวนใน 50% (v / v) เอทานอล (200 มล.) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องตามด้วยการหมุนเหวี่ยง (5000 ×กรัม, 30 นาที, 25 ° C) ที่จะเอาน้ำเอทานอล ขั้นตอนนี้ซ้ำเป็นครั้งที่สองภายใต้เงื่อนไขเดียวกันโดยกวนเม็ดที่ได้รับในที่ปรุงสดใหม่ 50% (v / v) เอทานอลหลังจากปั่นแต่ละ ต่อจากนั้นเม็ดผลที่ถูกกวนในน้ำ DI (200 มล.) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องตามด้วยการหมุนเหวี่ยง (9000 ×กรัม, 30 นาที, 25 ° C) ขั้นตอนนี้ซ้ำเป็นครั้งที่สองภายใต้เงื่อนไขเดียวกันโดยกวนวัสดุที่ไม่ละลายน้ำได้ในน้ำ DI มี supernatants ไว้หลังจากปั่นแต่ละ supernatants เก็บรวบรวมถูกผสมและปริมาณลดลงเป็น ~1 / 3 ปริมาณเดิมโดยการระเหยแบบหมุน glucomannan อยู่ในการแก้ปัญหาที่ได้รับการตกตะกอนค้างคืนกับ 95% (v / v) เอทานอล (600 มล.) ที่ 4 ° C ตามด้วยการหมุนเหวี่ยง (9000 ×กรัม, 40 นาที, 25 ° C) เม็ดผลถูกล้างครั้งที่สองกับเอทานอลไม่มีน้ำ (กระบวนการคายน้ำ) และแยกต่อมาโดยการกรองสูญญากาศก่อนที่จะแห้งเป็นเวลา 48 ชั่วโมง วัสดุที่เป็นพื้นดินแห้งและร่อนในการผลิตพีเคเอฟ (เรียกว่าต่อจากนี้ PKF1). 2.3.2 วิธีที่ 2 CKF (2.00 กรัม) ถูกกวนใน 50% (v / v) เอทานอล (200 มล.) เป็นเวลา 90 นาทีที่อุณหภูมิห้องตามด้วยการหมุนเหวี่ยง (5000 ×กรัม, 30 นาที, 25 ° C) ที่จะเอาน้ำเอทานอล เม็ดผลที่ถูกบันทึกลงไปในน้ำ DI (200 มล.) และขยับเวลา 3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง วิธีการแก้ปัญหาที่ได้รับการปรับลดแล้วถึง 400 มล. กับน้ำ DI ก่อนที่จะมีการหมุนเหวี่ยง (9000 ×กรัม, 30 นาที, 25 ° C) เพื่อเอาวัสดุที่ไม่ละลายน้ำ ต่อจากนั้นระเหยแบบหมุนได้ดำเนินการเพื่อลดปริมาณของการกรองเพื่อ ~1 / 3 ปริมาณเดิมตามด้วยการเร่งรัด KGM 95% (v / v) เอทานอล (450 มล.) การหมุนเหวี่ยงการคายน้ำกรองและแช่แข็งอบแห้งเช่น อธิบายไว้ในวิธีที่ 1 ในการผลิตพีเคเอฟ (เรียกว่าต่อจากนี้ PKF2). 2.4 การเปรียบเทียบวิธีการทดสอบเนื้อหา glucomannan การทำสำเนาและความถูกต้องของ 3,5-DNS กรดซัลฟูริกฟีนอลและการตรวจเอนไซม์สีถูกนำมาเปรียบเทียบเป็นครั้งแรกโดยการวิเคราะห์ CKF และตัวอย่าง LVKF ในเพิ่มขึ้นสามเท่าในวันที่แตกต่างกันภายใต้เงื่อนไขการทดลองเดียวกัน การอ่านการดูดกลืนแสงได้รับการพิจารณาโดยใช้เฮลิα spectrophotometer ยูวีที่มองเห็นได้ (เทอร์โมอิเลคตรอนคอร์ป, โรเชสเตอร์) ทั้งกลูโคสและเส้นโค้งการสอบเทียบ mannose ถูกสร้างขึ้นสำหรับ 3,5-DNS และฟีนอลซัลฟูริกกรดตรวจในการสั่งซื้อเพื่อเปรียบเทียบความไวของระบบทดสอบแต่ละน้ำตาลลด วิธี 3,5-DNS ถูกตรวจสอบต่อไปก่อนที่จะถูกนำมาใช้ในการกำหนดเนื้อหาของ glucomannan PKFs. 2.4.1 3,5-DNS ทดสอบสี2.4.1.1 การก่อสร้างมาตรฐาน d-กลูโคสและ D-mannose เส้นโค้งการสอบเทียบD-กลูโคสแก้ปัญหาสต็อก (1 mg / ml) ถูกนำมาวาง (0.40, 0.80, 1.20, 1.60 และ 2.00 มล.) ลง 25 มล. ขวดปริมาตรตามลำดับ (ใช้น้ำ DI เป็น ที่ว่างเปล่า) DI น้ำจากนั้นก็เพิ่มปริมาณ 2.00 มล. ตามด้วยการเพิ่มขึ้นของ 3,5-ของ DNS (1.50 มล.) แต่ละขวด ส่วนผสมแต่ละถูกความร้อนเป็นเวลา 5 นาทีในอ่างน้ำเดือดและการระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้องก่อนที่จะถูกปรับลดถึง 25 มล. กับน้ำ DI ในขวดปริมาตร วัดการดูดกลืนแสงที่ 550 แล้วนาโนเมตรและพล็อตของการดูดกลืนแสงวัดกับเนื้อหากลูโคส (มก.) สร้างขึ้น D-mannose กราฟมาตรฐานที่สร้างขึ้นโดยใช้ขั้นตอนตามที่อธิบายไว้สำหรับน้ำตาลกลูโคส. 2.4.1.2 การเตรียม KGM ตัวอย่างการแก้ปัญหาและปฏิกิริยาสีแป้งบุก(0.2000 กรัม) ถูกบันทึกอยู่ในบัฟเฟอร์ไฮดรอกไซฟอร์มิกวนแม่เหล็กกรดโซเดียม (0.1 mol / L 50 มล.) และผสม 4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ส่วนผสมที่ถูกเจือจางแล้วกับฟอร์มิกรดโซเดียมไฮดรอกไซบัฟเฟอร์ 100 มล. ในขวดปริมาตรตามด้วยการหมุนเหวี่ยง (4500 ×กรัม, 40 นาที, 25 ° C) ตัวอย่าง KGM
การแปล กรุณารอสักครู่..