2.2. Electronic microscopyBacteria

2.2. Electronic microscopy
Bacteria were prepared for ultrastructure study using a method
adapted from Martinez et al. [16] at two different time points:
immediately after removal from the agar surface and suspension
in a CHAPS solution, and after a 20 h extraction process. Fixation
and Epon-embedding procedures were carried out using high
osmolarity xation and washing solutions that optimized the cell
structure preservation. Samples were centrifuged at 2500 g and
4 C (5417R centrifuge, Eppendorf). The bacterial pellet was xed
by 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4 (PB)
(Sigma, St Quentin Fallavier, France) for 2 h at room temperature.
The bacteria were washed four times in PB and by centrifuging for
3 min at 10,000 g after each bath. The bacteria (pellet) were
post-xed in 1% OsO4 (Electron Microscopy Sciences, Hateld, PA,
USA) in PB for 1 h at room temperature. After centrifuging, the
bacteria pellet was dehydrated by successive baths in ethanol
(Fisher Scientic, Illkirch, France) 70, 95 and absolute ethanol
and by two baths in propylene oxide (ACROS, Geel, Belgium). The
conical tubes containing BT were centrifuged for 5 min at 15,000
g between each bath. A mixture (EPON) of 46% (vol/vol) Epon
(epikote) 812, 29% (vol/vol) dodecenyl succinic anhydride, 25%
(vol/vol) nadic methyl anhydride (Electron Microscopy Sciences,
Fort Washington, PA, USA) and 0.06% (vol/vol) 2,4,6-(trimethylaminoethyl)
phenol (Electron Microscopy Sciences) was used for
embedding. The bacteria were rst settled in an EPON/propylene
oxide mixture (vol/vol), overnight at room temperature. Two other
settlings were performed at 37 C after removing supernatants
and pouring 1 mL of pure EPON instead. Supernatant was nally
removed and pure EPON was poured onto the bacteria and a label.
After drying for 72 h at 60 C, a pyramid inclusion could be
unmolded. Semi-thin and then thin sections (50e70 nm) were
made by ultramicrotomy (using a Leica Ultracut R Ultramicrotome,
Leica microsystems, Wien, Autria) and collected onto form war/
carbon-coated nickel grids (300 mesh, Euromedex, Souffelwehersheim,
France). Sections were stained with saturated uranyl acetate
for 20 min and lead citrate at high pH (Euromedex) for 2 min
[16]. After staining the semi-thin sections, the ultrastructure of
bacteria was examined by EM using a TEM Hitachi 7500 coupled
to an AMT CCD camera (Hitachi High-Technologies Europe GmbH,
Krefeld, Germany).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 กล้องจุลทรรศน์อิเล็กทรอนิกส์
แบคทีเรียกำลังเตรียมพร้อมสำหรับการศึกษา ultrastructure โดยใช้วิธีการ
ที่ดัดแปลงมาจากมาร์ติเน et al, [16] ที่สองจุดเวลาที่แตกต่างกัน
ในทันทีหลังจากที่ออกจากพื้นผิววุ้นและระงับ
ในการแก้ปัญหา CHAPS และหลังจากกระบวนการสกัด 20 ชั่วโมง การตรึง
และขั้นตอนการฝัง Epon-ถูกดำเนินการโดยใช้สูง
osmolarity xation และการแก้ปัญหาที่ดีที่สุดที่ซักผ้ามือถือ?
โครงสร้างการเก็บรักษา ตัวอย่างหมุนเหวี่ยงที่ 2500? กรัมและ
4? C (centrifuge 5417R, Eppendorf) เม็ดแบคทีเรียคืออะไรคงที่
โดย glutaraldehyde 2.5% ใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์พีเอช 7.4 (PB)
(ซิกเซนต์เคว็นติ Fallavier ฝรั่งเศส) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง.
แบคทีเรียถูกล้างสี่ครั้งใน PB และเหวี่ยงสำหรับ
3 นาทีที่ 10,000? กรัมหลังอาบน้ำแต่ละ แบคทีเรีย (เม็ด) มี
การโพสต์? คงที่ 1% ใน OsO4 (Electron Microscopy วิทยาศาสตร์, หมวก? ภาคสนาม, PA,
สหรัฐอเมริกา) ใน PB เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากเหวี่ยง,
แบคทีเรียเม็ดได้รับการอบแห้งโดยการอาบน้ำเนื่องในเอทานอล
(ฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์? C, Illkirch ฝรั่งเศส) 70 ?, 95? และเอทานอลที่แน่นอน
และสองห้องอาบน้ำในโพรพิลีนออกไซด์ (ACROS, Geel, เบลเยียม)
หลอดรูปกรวยที่มี BT ถูกปั่นเป็นเวลา 5 นาทีที่ 15,000?
กรัมระหว่างอาบน้ำแต่ละ ส่วนผสม (EPON) 46% (ฉบับ / ปริมาตร) Epon
(epikote) 812, 29% (ฉบับ / ปริมาตร) dodecenyl สารประกอบอินทรีย์ชนิด 25%
(ฉบับ / ปริมาตร) แอนไฮไดเมธิล nadic (Electron Microscopy วิทยาศาสตร์,
ฟอร์ทวอชิงตัน, PA, สหรัฐอเมริกา) และ 0.06% (ฉบับ / ปริมาตร) 2,4,6- (trimethylaminoethyl)
ฟีนอล (Electron Microscopy วิทยาศาสตร์) ที่ใช้สำหรับ
การฝัง แบคทีเรีย? ตัดสินครั้งแรกใน EPON / โพรพิลีน
ออกไซด์ผสม (ฉบับ / ปริมาตร) ในชั่วข้ามคืนที่อุณหภูมิห้อง อีกสองคน
ได้ดำเนินการชำระราคาที่ 37 องศาเซลเซียสหลังจากลบ supernatants
และเท 1 มิลลิลิตร EPON บริสุทธิ์แทน ใสถูก? Nally
ลบออกและ EPON บริสุทธิ์ถูกเทลงบนแบคทีเรียและป้าย.
หลังจากการอบแห้งเป็นเวลา 72 ชั่วโมงที่ 60 องศาเซลเซียสรวมพีระมิดอาจจะ
unmolded ส่วนกึ่งบางและบางแล้ว (50e70 นาโนเมตร) ได้รับการ
ทำโดย ultramicrotomy (ใช้ Leica R Ultracut Ultramicrotome,
Leica Microsystems, วงเวียน Autria) และรวบรวมเข้าสู่สงครามรูปแบบ /
คาร์บอนเคลือบนิกเกิลกริด (300 ตาข่าย Euromedex, Souffelwehersheim,
ฝรั่งเศส ) ส่วนที่ถูกย้อมด้วยสีอะซิเตท uranyl อิ่มตัว
เป็นเวลา 20 นาทีและนำซิเตรตที่ pH สูง (Euromedex) เป็นเวลา 2 นาที
[16] หลังจากการย้อมสีส่วนกึ่งบาง ultrastructure ของ
เชื้อแบคทีเรียที่ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ EM TEM ฮิตาชิ 7500 ควบคู่
กับกล้อง CCD AMT (ฮิตาชิสูงเทคโนโลยี Europe GmbH,
เครเฟลด์เยอรมนี)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . แบคทีเรียที่ใช้อิเล็กทรอนิกส์ในการศึกษาเตรียม

ใช้วิธีการดัดแปลงจาก Martinez et al . [ 16 ] ที่จุดสองจุดเวลาที่แตกต่างกัน :
ทันทีหลังจากการใช้พื้นผิวและระงับ
ในโซลูชั่น Chaps และหลังจากกระบวนการสกัด 20 H . และผ่านขั้นตอนการตรึง
เกรดโดยใช้สูง
ำ  xation ล้างและโซลูชั่นที่เพิ่มประสิทธิภาพเซลล์
โครงสร้างการเก็บรักษา จำนวนระดับที่ 2500  G และ C (
4  5417r centrifuge , เพนดอร์ฟ ) เม็ดแบคทีเรียคือ  xed
2.5% glutaraldehyde ใน 0.1M phosphate buffer pH 7.4 ( PB )
( Sigma , เซนต์เควนติน fallavier , ฝรั่งเศส ) 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง
แบคทีเรียถูกล้าง 4 ครั้งใน ตะกั่วและสารสำหรับ
โดย3 นาทีที่ 10 , 000  g หลังจากแต่ละบาท แบคทีเรีย ( เม็ด )
โพสต์ -  xed 1% oso4 ( กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน , วิทยาศาสตร์ , หมวก  ละมั่ง , PA ,
สหรัฐอเมริกา ) ใน PB 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากวรรณนา ,
แบคทีเรีย เม็ดก็แห้งโดยการต่อเนื่องอาบน้ำในเอทานอล
( ฟิชเชอร์ scienti  C illkirch , ฝรั่งเศส ) 70  95  แน่นอนและเอทานอล
และสองห้องน้ำในออกไซด์ acros กีล , เบลเยียม )
หลอดกรวยที่มี BT อยู่ที่ระดับ 5 นาทีที่ 15 , 000 
G ระหว่างแต่ละบาท ส่วนผสม ( เกรด ) 46 % ( ปริมาตร / ปริมาตร ) เกรด
( epikote ) 812 , 29 % ( ปริมาตร / ปริมาตร ) dodecenyl ซัคซินิกแอนไฮไดรด์ 25 %
( Vol / Vol ) nadic เมทิลแอน ( กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน , วิทยาศาสตร์
ฟอร์ท วอชิงตัน , PA , USA ) และ 0.06 เปอร์เซ็นต์ ( ปริมาตร / ปริมาตร ) 2,4,6 - ( trimethylaminoethyl )
ฟีนอล ( กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนวิทยาศาสตร์ ) ใช้
การฝัง .แบคทีเรียถูก  แรกตั้งรกรากอยู่ในเกรด / โพรพิลีน
ผสมออกไซด์ ( Vol / Vol ) ค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง ตะกอนอื่น
2 จำนวน 37  C หลังจากเอา supernatants
และริน 1 ml แท้เกรดแทน น่านเป็น  แนลลี่
ลบออกและบริสุทธิ์เกรดถูกเทลงบนแบคทีเรียและป้ายชื่อ
หลังจากการอบแห้งนาน 72 ชั่วโมง 60  C , พีระมิดรวมได้
unmolded .กึ่งบางแล้วบางส่วน ( 50e70 nm )
โดย ultramicrotomy ( ใช้ Leica R ultramicrotome ultracut Leica Microsystems
, , Wien , autria ) และเก็บลงบนรูปแบบสงคราม /
คาร์บอนนิกเกิลเคลือบกริด ( 300 ตาข่าย euromedex souffelwehersheim
, , ฝรั่งเศส ) ส่วนที่ถูกย้อมด้วยสีอิ่มตัวยูเรนิลอะซิ
20 นาทีและนำซิเตรตที่ pH สูง ( euromedex ) สำหรับ 2 นาที
[ 16 ]หลังจากย้อมสีกึ่งบางส่วน , ใน
แบคทีเรียถูกตรวจสอบโดยมันใช้แบบฮิตาชิ 7 , 500 คู่
เป็นคู่ขากล้อง CCD ( Hitachi สูงเทคโนโลยียุโรป GmbH ,

เครเฟลด์ , เยอรมนี )