Purification of β‑glucosidasesY. li

Purification of β‑glucosidases
Y. lipolytica JMY1212 overproducing Bgl1-His6 and Bgl2
was grown in 200  mL YTD medium at 130  rpm, 28°C
for 36 h before centrifugation at 8,000×g for 5 min. For
purification of His6-Bgl1, the cell pellet was washed,
suspended in 50  mL phosphate buffer (50  mM, pH 7.4)
and homogenized over a 3-min period using a MP FastPrep-24
Instrument. After centrifugation (8,000×g for
5  min at 4°C), the supernatant was applied to 2  mL of
TALON Metal Affinity Resin (Clontech, Takara-Bio,
Kyoto, Japan) and protein was eluted using imidazole
buffer according to the manufacturer’s instructions.
For purification of Bgl2, the culture supernatant was
concentrated fivefold using an Amicon® Ultra-4 Centrifugal
Filter Unit with 30 kDa cut-off (Merk Millipore,
Bedford, MA, USA). The concentrated sample was then
loaded onto a Q Sepharose™ High Performance column
(Hiload, 1.6 ×  10  cm, Pharmacia Biotech), equilibrated
with Tris-buffer (20  mM, pH8.0). The column
was washed first with equilibration buffer (2 bed volumes)
before applying a linear gradient of 0–1.0 M NaCl
in Tris-buffer (20 mM, pH7.4) at a flow rate of 1.0 mL/
min (Pharmacia Biotech ÄKTA). Eluted fractions were
collected and assayed for β-glucosidase activity. All fractions
displaying activity were pooled, desalted and concentrated
using an Amicon ultra-filtration unit equipped
with a PM-10 membrane (Millipore), before being
applied to a Superdex 200 column (1.0 × 30 cm, Pharmacia
Biotech) equilibrated in Tris-sodium buffer (20  mM
Tris–HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4). Protein species were
separated at a flow rate of 0.5  mL/min. Fractions were
collected and analyzed by SDS-PAGE to ascertain purity
and estimate the approximate molecular weights of Bgl1-
His6 and Bgl2. All fractions satisfying the purity criterion
(>95% purity) were pooled and retained for further work.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทำให้บริสุทธิ์ของ β‑glucosidasesLipolytica Y. JMY1212 overproducing Bgl1 His6 และ Bgl2มีปลูกใน YTD 200 mL ที่ 130 rpm, 28° Cสำหรับ h 36 ก่อน centrifugation 8, 000 ซื้อ g สำหรับ 5 นาทีสำหรับทำให้บริสุทธิ์ของ His6-Bgl1 เม็ดเซลล์ถูกล้างหยุดชั่วคราวในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 50 มล. (50 มม. pH 7.4)และ homogenized เป็นกลุ่มช่วงระยะเวลา 3 นาทีใช้ MP FastPrep-24เครื่องมือ หลังจาก centrifugation (8, 000 ซื้อ g สำหรับ5 นาทีที่ 4 ° C), supernatant ถูกประยุกต์ใช้ mL 2 ของยางโลหะความสัมพันธ์ TALON (Clontech, Takara-ไบโอเกียวโต ญี่ปุ่น) และโปรตีนที่ eluted ใช้อิมิดาโซลบัฟเฟอร์ตามคำแนะนำของผู้ผลิตการทำให้บริสุทธิ์ของ Bgl2 วัฒนธรรม supernatant ถูกเข้มข้น fivefold โดยใช้การ Amicon ® Ultra-4 แรงเหวี่ยงตัวกรองหน่วยกับ 30 kDa ตัด (Merk มากกลาสโกว์ MA สหรัฐอเมริกา) อย่างเข้มข้นได้แล้วโหลดลงในคอลัมน์ Q Sepharose ™ประสิทธิภาพสูงEquilibrated (hiload, 1.6 × 10 ซม เทคโนโลยีชีวภาพ Pharmacia),มีทริสเรทติ้งบัฟเฟอร์ (20 มม. pH8.0) คอลัมน์ถูกล้างก่อน ด้วยบัฟเฟอร์ equilibration (2 เตียงไดรฟ์ข้อมูล)ก่อนที่จะใช้การไล่ระดับเส้น 0-1.0 M NaClในตรีบัฟเฟอร์ (20 มม. pH7.4) ที่อัตราการไหลของ 1.0 mL /นาที (Pharmacia เทคโนโลยีชีวภาพ ÄKTA) ส่วน eluted ได้รวบรวม และ assayed β-glucosidase กิจกรรม เศษส่วนทั้งหมดแสดงกิจกรรมทางถูกพู desalted และเข้มข้นใช้หน่วยพิเศษกรอง Amicon พร้อมมีการ PM 10 เมมเบรน (มาก), การใช้กับคอลัมน์ Superdex 200 (1.0 × 30 ซม. Pharmaciaไบโอเทค) equilibrated ในทริสเรทติ้งโซเดียมบัฟเฟอร์ (20 มม.Tris–HCl, NaCl, 150 มม. pH 7.4) มีโปรตีนชนิดแยกที่อัตราการไหลของ 0.5 mL/นาที เศษส่วนได้รวบรวม และวิเคราะห์ โดย SDS-หน้าเพื่อตรวจความบริสุทธิ์และประเมินน้ำหนักโมเลกุลโดยประมาณของ Bgl1-His6 และ Bgl2 เศษส่วนทั้งหมดที่ตอบสนองเงื่อนไขความบริสุทธิ์(> 95% ความบริสุทธิ์) ทางถูกพู และเก็บไว้สำหรับงานต่อไป

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทำให้บริสุทธิ์ของβ-glucosidases
วาย lipolytica JMY1212 overproducing Bgl1-His6 และ Bgl2
ถูกปลูกในกลาง 200 มิลลิลิตร YTD ที่ 130 รอบต่อนาทีที่ 28 องศาเซลเซียส
36 ชั่วโมงก่อนที่จะหมุนเหวี่ยงที่ 8000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาที สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของ His6-Bgl1 เม็ดเซลล์ถูกล้างระงับใน50 มิลลิลิตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (50 มิลลิค่า pH 7.4) และปั่นเป็นระยะเวลากว่า 3 นาทีโดยใช้ MP-24 FastPrep ตราสาร หลังจากการหมุนเหวี่ยง (8000 ×กรัมสำหรับ5 นาทีที่ 4 ° C) ใสถูกนำไปใช้กับ 2 มิลลิลิตรTALON โลหะ Affinity เรซิน (Clontech, Takara-Bio, เกียวโตประเทศญี่ปุ่น) และโปรตีนที่ถูกชะใช้ imidazole บัฟเฟอร์ตามคำแนะนำของผู้ผลิต . สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ของ Bgl2, ใสวัฒนธรรมที่ถูกเข้มข้นห้าเท่าใช้Amicon®อัลตร้า4 แรงเหวี่ยงหน่วยกรองด้วย30 กิโลดาลตันตัด (Merk ค, ฟอร์ด, MA, USA) กลุ่มตัวอย่างที่มีความเข้มข้นแล้วโหลดลงบน Q Sepharose ™คอลัมน์ที่มีประสิทธิภาพสูง (Hiload 1.6 × 10 ซม., Pharmacia ไบโอเทค) equilibrated กับทริบัฟเฟอร์ (20 มิลลิ, pH8.0) คอลัมน์ถูกล้างครั้งแรกกับบัฟเฟอร์สมดุล (เล่ม 2 เตียง) ก่อนที่จะใช้ทางลาดเชิงเส้นของ 0-1.0 M โซเดียมคลอไรด์ในทริบัฟเฟอร์(20 มิลลิ, pH7.4) ที่อัตราการไหล 1.0 มิลลิลิตร / นาที (ไบโอเทค Pharmacia Akta) . เศษส่วนชะถูกเก็บรวบรวมและ assayed กิจกรรมβ-glucosidase เศษส่วนทั้งหมดแสดงกิจกรรมที่ได้รวบรวม, desalted และเข้มข้นใช้Amicon หน่วยพิเศษกรองการติดตั้งด้วยเมมเบรนPM-10 (ค) ก่อนที่จะถูกนำไปใช้กับSuperdex 200 คอลัมน์ (1.0 × 30 ซม, Pharmacia ไบโอเทค) equilibrated ในทริสโซเดียม บัฟเฟอร์ (20 มิลลิTris-HCl 150 มิลลิโซเดียมคลอไรด์มีค่า pH 7.4) ชนิดโปรตีนที่ถูกแยกออกจากกันที่อัตราการไหล 0.5 มิลลิลิตร / นาที เศษส่วนที่ถูกเก็บรวบรวมและวิเคราะห์โดยวิธี SDS-PAGE เพื่อยืนยันความบริสุทธิ์และประเมินน้ำหนักโมเลกุลประมาณBgl1- His6 และ Bgl2 เศษส่วนทุกความพึงพอใจของเกณฑ์ความบริสุทธิ์(> ความบริสุทธิ์ 95%) ได้รับการรวบรวมและเก็บไว้สำหรับการทำงานต่อไป

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การ β‑ glucosidases
Y lipolytica jmy1212 overproducing bgl1-his6 bgl2
และที่ปลูกในประเทศตัวกลางที่ 130 มิลลิลิตร 200   รอบต่อนาที 28 ° C
36 ไหม H ก่อนปั่นที่ 8000 × g 5 นาที ฟอกไหม
his6-bgl1 , เซลล์เม็ดถูกล้าง
แขวนลอยในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 50 เหรอมล ( 50 ไหมอืม pH 7.4 )
3-min บดมากกว่าและระยะเวลาการใช้ MP fastprep-24
เครื่องดนตรี หลังการปั่นเหวี่ยง ( 8000 × g
5 รึเปล่า นาทีที่ 4 ° C ) , นำ 2 มิลลิลิตร ใช้ไหมครับ ( clontech โลหะโดยใช้เรซิน

Takara , ชีวภาพ , เกียวโต , ญี่ปุ่น ) และตัวอย่างการใช้โปรตีนอิมิดาโซล
บัฟเฟอร์ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
สำหรับฟอก bgl2 วัฒนธรรม นำ คือ
เข้มข้น 3 ใช้ amicon ® ultra-4 แรงเหวี่ยง
กรองหน่วย 30 รึเปล่า ) ตัด ( หมายเหตุมิลลิ ,
ฟอร์ดมาสหรัฐอเมริกา ) แบบตัวอย่างแล้ว
โหลดไปยัง Q เกี่ยวข้อง™ประสิทธิภาพสูงคอลัมน์
( hiload  ×  10   1.6 เซนติเมตร มุ่งมั่น ไบโอเทค ) , equilibrated
กับทริสบัฟเฟอร์ ( 20 มั้ยค่ะ ph8.0 ) คอลัมน์
ล้างครั้งแรกกับ equilibration บัฟเฟอร์ ( เล่ม 2 เตียง )
ก่อนใช้ลาดเชิงเส้น 0 – 1.0 รึเปล่า M NaCl
ในทริสบัฟเฟอร์ ( 20 รึเปล่าค่ะ ph7.4 ) ที่อัตราการไหล 1.0 รึเปล่ามิลลิลิตร /
มิน ( IKEA มุ่งมั่นเทคโนโลยีชีวภาพได้รับ )ตัวอย่างเศษส่วนถูกรวบรวมและปริมาณบีตา -
สำหรับกิจกรรมใน . แสดงกิจกรรมทั้งหมดเศษส่วน

และพู desalted เข้มข้นใช้ amicon กรองพิเศษหน่วยติดตั้ง
กับการบำบัดเมมเบรน ( มิลลิ ) ก่อนที่จะถูก
ใช้กับ superdex 200 คอลัมน์ ( 1.0  ×  30  ซม. มุ่งมั่น
Biotech ) ในบริษัท equilibrated โซเดียมเฟอร์ ( 20 mm
นอกจากนี้ไหม– HCL 150   mM NaCl , pH 7.4 )โปรตีนชนิด
แยกกันที่อัตราการไหล 0.5 มิลลิลิตร / นาที เศษส่วนเป็นรึเปล่า
รวบรวมและวิเคราะห์โดย SDS-PAGE เพื่อยืนยันความบริสุทธิ์
ประเมินประมาณน้ำหนักโมเลกุลของ bgl1 -
his6 และ bgl2 . ทั้งหมดเศษส่วนภิรมย์ความบริสุทธิ์เกณฑ์
( > 95% ความบริสุทธิ์ ) รวมปริมาณงานเพิ่มเติม