MATERIALS AND METHODSZoosporangia o

MATERIALS AND METHODS
Zoosporangia of P. helianthicola C.Rost & Thines were harvested from naturally infected sunflower, found on a field near Plieningen, Baden Württemberg, Germany. A voucher (OS 1000) of the original material was deposited in the herbarium HOH. A permanent culture of the pathogen on sunflower seedlings, Helianthus annuus cv. giganteus, was established and maintained as described earlier (Spring et al., 2011). To obtain genetically homogenous strains we followed the protocol for single zoospore infections with sunflower downy mildew (Spring et al. 1998). Freshly harvested zoosporangia were spread on water agar plates an incubated in darkness at 16°C until zoospore discharge. Single zoopores were collected with a micro-capillary and transferred onto detached sunflower leaves or on the apical bud of ca. five days old seedlings which had been raised on wet filter paper. After 24h at 16°C in darkness in petri dishes with saturated humidity, seedlings were potted. Further cultivation was performed in a climate chamber at 16°C, 80% humidity and 14h photoperiod. Spontaneous formation of subepidermal sporangia (the typical white blisters) indicated infection. Freshly developed sporangia were used for subsequent germination and infection studies and excess of sporangia was stored at -70°C for later use.
Occurrence of oospores was detected microscopically. Clusters of oospores were excised from the host tissue. The material was chopped, suspended in water and sieved through different nylon filters (mesh 150, 100, 70, 50 µm). The residue of the 50µm sieve was suspended in water and checked for the purity and condition of oospores. The suspension was used for germination and infection tests with oospores. For the latter, ca. 400 oospores per plant were placed in between the cotyledons of ca. five days old seedlings, similarly as described above for the inoculation with zoosporangia. To study oospore germination we followed the technique described by Verma and Petri, 1975. The oospore suspension was diluted in 50-100ml sterile water and incubated at 200 rpm on a rotary shaker at 18°C for up to one week. Afterwards, the oospores were separated by filtering through nylon sieve (50µm mesh) and used for germination tests. These tests were carried out on water agar or on microscopic slides. Rifampicin (10 ppm) was added to prohibit bacterial growth. The agar plates and the microscopic slides were incubated in darkness at 16°C in saturated humidity and checked daily for oospore germination by microscopy.
The formation of oospores was investigated in freehand sections of infected plant tissue using a Zeiss Axioplan microscope. Resorcin blue was used to stain fungal structures and fluoerscence microscopy was carried out with a filter combination of FT 460/ LP470 barrier and UV 395-440nm excitation.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการZoosporangia P. helianthicola C.Rost และ Thines ได้เก็บเกี่ยวจากธรรมชาติติดไวรัสทานตะวัน พบในเขตใกล้ Plieningen เทมแบร์กบาเดน เยอรมนี ใบสำคัญ (OS 1000) วัสดุเดิมที่ฝากในหอของหอพรรณไม้ วัฒนธรรมถาวรของศึกษาในกล้าไม้ดอกทานตะวัน Helianthus annuus พันธุ์ทัสช้าง ถูกก่อตั้งขึ้น และรักษาเป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (สปริง et al., 2011) เพื่อให้ได้สายพันธุ์แปลงพันธุกรรมให้ เราตามโพรโทคอลสำหรับการติดเชื้อ zoospore เดียวกับทานตะวัน downy คราบ (ฤดูใบไม้ผลิและ al. ปี 1998) Zoosporangia สดเก็บเกี่ยวถูกแพร่กระจายบนแผ่นน้ำ agar มีมืด incubated ในที่ 16° C จนปล่อย zoospore Zoopores เดียวถูกรวบรวมไว้กับไมโครแรง และโอนย้าย ลงใบเดี่ยวดอกทานตะวัน หรือดอกตูมปลายยอดของ ca ห้าวันเก่ากล้าไม้ที่ได้รับการเลี้ยงบนกระดาษกรองเปียก หลังจาก 24 ชมที่ 16° C ในที่มืดใน petri อาหารมีความชื้นอิ่มตัว ถูก potted กล้าไม้ ทำการเพาะปลูกในห้องอากาศที่ 16° C ความชื้น 80% และ h ที่ 14 ชั่วโมง ก่อตัวอยู่ของ subepidermal sporangia (ปกติขาวแผล) ระบุติดเชื้อ ใช้ sporangia สดพัฒนาศึกษาการงอกและการติดเชื้อตามมา และส่วนที่เกินของ sporangia ถูกเก็บไว้ที่-70 ° C ใช้ เกิด oospores พบ microscopically ของ oospores ถูก excised จากเนื้อเยื่อของโฮสต์ วัสดุถูกสับ หยุดชั่วคราวในน้ำ และ sieved ผ่านตัวกรองไนล่อนต่าง ๆ (ตาข่าย 150, 100, 70, 50 µm) สารตกค้างของตะแกรง 50µm ถูกหยุดชั่วคราวในน้ำ และตรวจสอบความบริสุทธิ์และเงื่อนไขของ oospores การระงับใช้สำหรับการงอกและการติดเชื้อจากการทดสอบ oospores สำหรับหลัง ca. 400 oospores ต่อพืชถูกวางระหว่าง cotyledons ของ ca กล้าไม้ห้าวันเก่า เหมือนกับที่อธิบายข้างต้นสำหรับ inoculation กับ zoosporangia การศึกษาการงอก oospore เราตามเทคนิคที่อธิบายไว้โดย Verma Petri, 1975 การระงับ oospore ผสมน้ำฆ่าเชื้อ 50-100ml และ incubated ที่ 200 รอบต่อนาทีในเชคเกอร์โรตารี่ที่ 18° C ถึงหนึ่งสัปดาห์ ภายหลัง oospores ถูกแยกออก โดยการกรองผ่านตะแกรงไนล่อน (ตาข่าย 50µm) และใช้สำหรับการทดสอบการงอก ทดสอบเหล่านี้ถูกดำเนิน บนน้ำ agar หรือ บนภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์ Rifampicin (10 ppm) ถูกเพิ่มเข้าไปห้ามการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย แผ่น agar และภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์ถูก incubated ในความมืดที่ 16° C ในความชื้นอิ่มตัว และตรวจสอบทุกวันสำหรับการงอก oospore microscopyการก่อตัวของ oospores ถูกตรวจสอบในส่วนของเนื้อเยื่อพืชที่ติดเชื้อโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Zeiss Axioplan อิสระ สีฟ้า resorcin ใช้ติดโครงสร้างเชื้อรา และ fluoerscence microscopy ถูกดำเนินการ ด้วยตัวกรอง FT 460 / LP470 อุปสรรคและ UV 395 440nm ในการกระตุ้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
zoosporangia ของพี helianthicola C.Rost & Thines ถูกเก็บเกี่ยวจากดอกทานตะวันที่ติดเชื้อตามธรรมชาติที่พบในทุ่งใกล้ Plieningen บาWürttembergเยอรมนี บัตรกำนัล (OS 1000) ของวัสดุที่เป็นต้นฉบับถูกฝากไว้ในสมุนไพร HOH วัฒนธรรมถาวรของเชื้อโรคในต้นกล้าดอกทานตะวันทานตะวันพันธุ์ giganteus ก่อตั้งขึ้นและการบำรุงรักษาตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (ฤดูใบไม้ผลิ et al., 2011) ที่จะได้รับสายพันธุ์ทางพันธุกรรมเหมือนกันเราตามโปรโตคอลสำหรับการติดเชื้อ zoospore เดียวกับดอกทานตะวันโรคราน้ำค้าง (ฤดูใบไม้ผลิ et al. 1998) zoosporangia เก็บเกี่ยวสดกระจายอยู่บนจานอาหารเลี้ยงเชื้อน้ำบ่มในความมืดที่ 16 ° C จนปล่อย zoospore zoopores เดี่ยวถูกเก็บรวบรวมด้วยเส้นเลือดฝอยขนาดเล็กและโอนไปยังใบดอกทานตะวันเดี่ยวหรือตายอดของแคลิฟอร์เนีย ห้าวันต้นกล้าเก่าที่ได้รับการยกขึ้นบนกระดาษกรองเปียก หลังจาก 24 ชั่วโมงวันที่ 16 ° C ในความมืดในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีความชื้นอิ่มตัวต้นกล้าถูกกระถาง การเพาะปลูกนอกจากนี้กำลังดำเนินการอยู่ในห้องสภาพภูมิอากาศที่ 16 ° C ความชื้น 80% และช่วงแสง 14h การก่อตัวเองของ subepidermal sporangia (แผลสีขาวทั่วไป) ระบุการติดเชื้อ พัฒนาสด sporangia ถูกนำมาใช้สำหรับการงอกตามมาและการศึกษาการติดเชื้อและส่วนที่เกินจาก sporangia ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -70 องศาเซลเซียสเพื่อใช้ในภายหลัง.
เกิด oospores พบกล้องจุลทรรศน์ กลุ่มของ oospores ถูกตัดออกจากเนื้อเยื่อโฮสต์ วัสดุที่ถูกสับที่ลอยอยู่ในน้ำและร่อนผ่านตัวกรองไนลอนที่แตกต่างกัน (ตาข่าย 150, 100, 70, 50 ไมครอน) สิ่งตกค้างของตะแกรง50μmถูกระงับในน้ำและการตรวจสอบความบริสุทธิ์และสภาพของ oospores ระงับถูกนำมาใช้สำหรับการงอกและการทดสอบการติดเชื้อ oospores สำหรับหลังแคลิฟอร์เนีย 400 oospores ต่อต้นอยู่ในระหว่างใบเลี้ยงของแคลิฟอร์เนีย ห้าวันต้นกล้าเก่าในทำนองเดียวกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้นสำหรับการฉีดวัคซีนกับ zoosporangia เพื่อศึกษาการงอก oospore เราตามเทคนิคการอธิบายโดย Verma และ Petri, 1975 ระงับ oospore ถูกเจือจางในน้ำหมัน 50-100ml และบ่มที่ 200 รอบต่อนาทีในเครื่องปั่นหมุนที่ 18 องศาเซลเซียสได้นานถึงหนึ่งสัปดาห์ หลังจากนั้น oospores ถูกแยกออกโดยการกรองผ่านตะแกรงไนลอน (ตาข่าย50μm) และใช้สำหรับการทดสอบการงอก การทดสอบเหล่านี้ได้รับการดำเนินการในวุ้นน้ำหรือบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์ rifampicin (10 ppm) ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อห้ามการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย แผ่นวุ้นและภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์ถูกบ่มในความมืดที่ 16 ° C ความชื้นอิ่มตัวและตรวจสอบทุกวันสำหรับการงอก oospore โดยใช้กล้องจุลทรรศน์.
การก่อตัวของ oospores ถูกตรวจสอบในส่วนด้วยมือเปล่าของเนื้อเยื่อพืชที่ติดเชื้อโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Zeiss Axioplan Resorcin สีฟ้าถูกใช้ในการเปื้อนโครงสร้างเชื้อราและกล้องจุลทรรศน์ fluoerscence ได้รับการดำเนินการที่มีตัวกรองของ FT 460 / อุปสรรค LP470 และรังสียูวีกระตุ้น 395-440nm

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ zoosporangia P . C .
helianthicola rost & thines เก็บดอกทานตะวันจากธรรมชาติที่พบในเขตใกล้ plieningen บาเดน , เวือร์ทเทมแบร์ก , เยอรมนี คูปอง ( OS 1000 ) ของวัสดุเดิมที่เคยฝากไว้ในหอพรรณไม้โฮะ วัฒนธรรมถาวรของเชื้อโรคบน seedlings ดอกทานตะวัน Annuus พันธุ์ giganteus ,ถูกสร้างและรักษาตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( ฤดูใบไม้ผลิ et al . , 2011 ) เพื่อให้ได้สายพันธุ์ที่มีเนื้อเดียว เราทำตามกฎสำหรับเชื้อคณะเดียวกับทานตะวัน downy mildew ( ฤดูใบไม้ผลิ et al . 1998 ) เก็บเกี่ยวสดใหม่ zoosporangia ถูกแพร่กระจายในน้ำวุ้นแผ่นการบ่มในความมืดที่ 16 ° C จนถึงคณะ ปล่อยzoopores เดียวถูกเก็บกับเส้นเลือดฝอยขนาดเล็กและโอนไปยังเดี่ยวดอกทานตะวันใบหรือหน่อที่ยอดของ CA 5 วัน ต้นกล้าอายุซึ่งเคยเลี้ยงบนกระดาษกรองเปียก หลังจาก 24 ชั่วโมงที่ 16 ° C ในความมืดในจานเลี้ยงเชื้อที่มีไขมันอิ่มตัว ความชื้น ปลูกเป็นไม้กระถาง . การปลูกเพิ่มเติมแสดงในบรรยากาศห้องที่ 16 °องศาเซลเซียส , ความชื้น 80% และ 14h แสง .การก่อตัวขึ้นของ subepidermal สปอแรงเกีย ( ปกติขาวส่า ) พบการติดเชื้อ ใหม่พัฒนาสปอแรงเกียถูกใช้เพื่อการศึกษาและการงอกและการติดเชื้อตามมาเกินสปอแรงเกียถูกเก็บไว้ที่ - 70 องศา C เพื่อใช้ในภายหลัง
เกิด oospores ตรวจทางกล้องจุลทรรศน์ . กลุ่มของ oospores ถูกตัดจากโฮสต์ที่เนื้อเยื่อ วัสดุที่ถูกสับแขวนลอยในน้ำผ่านตัวกรองที่แตกต่างกัน ( ตาข่ายไนลอน ขนาด 150 , 100 , 70 , 50 µ M ) ที่เหลือ 50 µ M ตะแกรงถูกแขวนลอยในน้ำและตรวจสอบความบริสุทธิ์และสภาพของ oospores . ถูกระงับการใช้และการทดสอบกับเชื้อ oospores . สำหรับหลัง ประมาณ 400 oospores ต่อพืชอยู่ในระหว่างการแสดงออกของ CA 5 วันเก่าโดยใช้ในทํานองเดียวกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้นสำหรับการ zoosporangia . เพื่อศึกษา oospore งอกเราตามเทคนิคและอธิบายโดย verma Petri , 2518 . ที่พัก oospore เจือจางในน้ำ 50-100ml เป็นหมันและบ่มที่อุณหภูมิ 200 รอบต่อนาทีในเครื่องปั่นหมุนที่ 18 ° C เป็นเวลาถึงหนึ่งสัปดาห์ หลังจากนั้นการ oospores แยกโดยการกรองผ่านตะแกรงไนล่อน ( 50 µเมตรตาข่าย ) เพื่อใช้ทดสอบการงอก โดยการทดลองดำเนินการในน้ำวุ้น หรือภาพนิ่ง ด้วยกล้องจุลทรรศน์ ไรแฟมปิซิน ( 10 ส่วน ) ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อห้ามการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย การใช้แผ่นสไลด์กล้องจุลทรรศน์กำลังบ่มอยู่ในความมืดที่ 16 ° C ความชื้นอิ่มตัวและตรวจสอบรายวันสำหรับ oospore งอกด้วยกล้องจุลทรรศน์ .
การสอบสวนในส่วนของ oospores ด้วยมือเปล่า เนื้อเยื่อพืชที่ติดเชื้อโดยใช้ Zeiss axioplan กล้องจุลทรรศน์ รีเซอร์ซินสีฟ้าถูกใช้คราบเชื้อราด้วยกล้องจุลทรรศน์ โครงสร้างและ fluoerscence ได้ดำเนินการกับตัวกรองการรวมกันของ FT 460 / lp470 อุปสรรคและข้อจำกัด 395-440nm UV