12. Materials and methods2.1. Coati

12. Materials and methods
2.1. Coatings synthesis and characterization
2.1.1. Preparation of Ag-bearing TiO2 coatings
Ti–6Al–7Nb biomedical alloy disks (22 mm diameter, 8 mm
height) were used in this study. They were ground with 320, 800
and 1200# abrasive papers and then ultrasonically cleaned with acetone,
ethanol and distilled water in an ultrasonic bath prior to PEO
treatment. The PEO process was performed on a custom-made laboratory
scale set-up consisting of an AC power supply, type ACS 1500
(ET Power Systems Ltd., UK) and a double wall glass electrolytic cell
cooled by a mixture of water and glycerol using a Haake V15 thermostatic
bath. The electrolytic cell was filled with the electrolyte, which
comprised 0.02 M calcium acetate (P99%, Sigma–Aldrich) and
0.15 M calcium glycerophosphate (Dr. Paul Lohmann, Germany)
solutions to which 0, 0.3 and 3.0 g l1 Ag nanoparticles (99.5%, Sigma–Aldrich)
were added. To maintain particle homogeneity the
electrolyte was stirred at 500 rpm during the PEO process. The PEO
process was performed under galvanostatic conditions using a current
density of 20 A dm2 for 300 s. To remove any unattached Ag
NPs, after the PEO process the treated samples were kept in running
tap water for 5 min, ultrasonically cleaned in 70% ethanol and rinsed
for 5 min in deionized water. All samples were sterilized for 1 h at
110 C using a Nabertherm TR60 oven. The sample code, electrolyte
components and process parameters are listed in Table 1. The coating
morphology was investigated using the SEM, coating thickness
was measured using the Elcometer 456 Coating Thickness Gauge,
and elemental composition was determined by energy dispersive
X-ray analyses (EDX).
2.1.2. Ag release
Ag release experiments were performed in triplicates for the
0.3 Ag and 3.0 Ag samples. The oxidized disks were placed in dark
Wheaton bottles containing 30 ml of double distilled water and
kept at 37 C under gentle stirring conditions up to 7 days. The liquid
was collected at days 1, 2, 5 and 7 and replaced with fresh
double distilled water. All collected samples were acidified with
HNO3 to a final concentration of 0.5 M and were analyzed with
the graphite furnace atomic absorption spectrometry (GF-AAS)
technique using the PerkinElmer 4100ZL instrument. The time
points were selected according to the cytotoxicity tests.
2.1.3. Total Ag content in the coatings
The total amount of silver incorporated in the coatings was
determined for the 0.3 Ag and 3.0 Ag samples. The TiO2 matrix,
bearing Ag NPs, was dissolved in 98% H2SO4 at 90 C in an ultrasonic
bath for 2 h. After cooling, 69% HNO3 was added to further
dissolve the loose Ag NPs, and the liquid samples were tested for
Ag content with the flame atomic absorption spectroscopy
(flame-AAS) technique using the PerkinElmer AAnalyst 100
instrument.
To estimate the total amount of Ag available for release, a new
set of PEO coated samples were immersed in 15 ml HNO3 with a
concentration of 69%. Only the exposed Ag NPs (i.e. embedded on
the surface and inside the open porosity) will be dissolved by the
nitric acid. After 24 h, the immersion liquid was collected and analyzed
by flame AAS.
2.2. In vitro cytotoxicity evaluation
2.2.1. Cell culture
SV-HFO cells [13] were precultured for 1 week in a-minimum
essential medium (aMEM) (GIBCO, Paisley, UK) supplemented
with 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid
(HEPES) (Sigma–Aldrich), 2% streptomycin/penicillin, 1.8 mM
CaCl2 (Sigma–Aldrich) and 10% heat-inactivated fetal calf serum
(HI-FCS) (GIBCO) at pH 7.5, 37 C and 5% CO2 in a humidified atmosphere.
During this preculture, the SV-HFO cells remained in an
undifferentiated stage. After preculturing, the cells were washed
with a phosphate buffered saline solution (PBS), detached with
trypsin, counted with a hemocytometer and seeded on the samples
in a density of 3.5 104 cells per disk. Osteogenic medium (aMEM
supplemented with fresh b-glycerophosphate (Sigma–Aldrich)
(10 mM) and dexamethasone (Sigma–Aldrich) (100 nM)) was
added, starting 2 days after seeding and replaced every 2–3 days.
The coated disks fit precisely in the 12-well plates, avoiding the
growth of cells on the polystyrene.
2.2.2. Cell viability assay
AlamarBlue assay (Invitrogen) was used to assess SV-HFO cell
viability on the Ag-bearing and Ag-free coatings. At days 2, 5 and
7 of culture, AlamarBlue reagent was added to each well, in an
amount equal to 10% of the well volume. The plates were incubated
for a further 3 h at 37 C to allow the resazurin, a blue
non-fluorescent indicator dye, to be converted to highly red fluorescent
resorufin via reduction reactions of metabolically active
cells. Fluorescence measurements were made on a Wallac microplate
fluorometer using an excitation length of 535 nm and emission
of 590 nm. The assay was performed at least in triplicate.
Table 1
Sample code, electrolyte components and process parameters used.
Sample
code
Electrolyte components Process parameters
Calcium acetate,
mol L1
Calcium glycero-phosphate,
mol L1
Ag nanoparticles,
g L1
Current density,
A dm2
Final voltage,
V
Duration,
min
Temperature, C
Start End
0 Ag 0.02 0.15 0 20 239 ± 2 5 11 ± 1 34 ± 0.3
0.3 Ag 0.02 0.15 0.3 20 234 ± 3 5 11 ± 1 33 ± 0.9
3.0 Ag 0.02 0.15 3.0 20 237 ± 2 5 11 ± 1 32 ± 1
4192 B.S. Necula et al. / Acta Biomaterialia 8 (2012) 4191–4197
2.2.3. SV-HFO cell morphology and spreading assay
The SV-HFO cell morphology and spreading were observed
using SEM. After 2, 5 and 7 days of SV-HFO culture on the coated
disks, the cells were fixed with 4% formaldehyde and 2% glutaraldehyde
in 0.1 M sodium cacodylate solution at 4 C for 1 h. The
samples were rinsed in 0.1 M sodium cacodylate solution and
dehydrated in a series of graded ethanol and then 100% tetramethylsilane.
All samples were gold coated and examined on a Jeol
6500F-D scanning electron microscope operated at 5–10 kV.
2.2.4. Fluorescence microscopy of actin cytoskeletal organization and
nucleus
After culturing for 48 h, the cells seeded on the coated disks
were washed with PBS and fixed for 15 min at room temperature
using 4% paraformaldehyde in PBS. After three rinses with PBS the
cells were permeabilized with PBS/Triton X-100 for 10 min and
stained with rhodamine–phalloidin (Invitrogen) (1:100 in PBS) for
20 min at room temperature and in the dark. The disks were further
rinsed three times with PBS and stained with a 40
,6-diamidino-2-
phenylindole (DAPI) solution (Invitrogen) (1:50000 in PBS) for
5 min. The actin cytoskeleton and cell nuclei were examined using
an epifluorescence microscope (Nikon Eclipse LV 100D-U, Japan).
2.3. In vitro antibacterial activity
The antibacterial activity of the Ag-bearing layers against MRSA
was assessed in vitro using the Japanese Industrial Standard JIS Z
2801:2000 [14] modified to better reproduce the scenario of an implant
infection during a primary surgery [9]. In short, a fresh liquid
culture of MRSA, strain AMC201, was prepared by adding 1–5 colonies
from a streak plate into 5 ml of trypticase soy broth (TSB).
The suspension was incubated at 37 C under rotation for 2 h
and subsequently diluted with TSB to an optical density (OD620)
of 0.03, corresponding to 107 colony-forming units (CFU) per ml.
Sterilized nitrocellulose filter disks were placed on a blood agar
plate and 20 ll of the diluted MRSA culture, containing 2 105
CFU, was pipetted onto the filters. The medium was absorbed by
the agar while the MRSA bacteria were retained on the filter.
20 ll of 1% TSB in 10 mM phosphate was pipetted centrally on
the surface of each titanium disk and an inoculated filter disk
was carefully placed on top, with the bacteria contacting the
coated surface. All disks with bacterial filters were placed individually
in petri dishes and incubated at 37 C for 24 h in a humid
atmosphere. After incubation, each disk and the corresponding filter
were placed in 5 ml of TSB, sonicated for 30 s and vortexed for
1 min to dislodge adherent bacteria. This procedure does not affect
bacterial viability. Seven ten-fold serial dilutions were made in a
96-well plate. Subsequently, triplicate 10 ll aliquots of the undiluted
suspension and of the seven dilutions were pipetted onto
blood agar plates. The blood agar plates were incubated overnight
at 37 C and the number of colonies was counted the following day.
All experiments were performed at least in triplicate.
2.4. Statistical analysis
Statistical analyses were performed using the one-way Anova
test and Tukey–Kramer method to make multiple unplanned comparisons
of means based on unequal sample sizes. In the Tukey–
Kramer method, the minimum significant difference (MSD) was
calculated for each pair of means. If the observed absolute difference
between a pair of means was greater than the MSD, the pair
of means was declared significantly different.
3.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

12. วัสดุและวิธีการ2.1 การเคลือบการสังเคราะห์และสมบัติ2.1.1 การเตรียมเคลือบ TiO2 Ag-แบริ่งโลหะผสมทางชีวการแพทย์ตี้ – 6Al – 7Nb ดิสก์ (เส้นผ่าศูนย์กลาง 22 มม. 8 มม.สูงใช้ในการศึกษานี้ พวกเรากับ 320, 800และทราย 1200# เอกสารแล้ว ultrasonically ล้าง ด้วยอะซิโตนเอทานอลและน้ำกลั่นในการอัลตราโซนิกก่อนสาธารณรัฐประชาธิปไตยรักษา ทำในห้องปฏิบัติการตามกระบวนการของสาธารณรัฐประชาธิปไตยตั้งค่ามาตราส่วนประกอบด้วยการ AC ไฟ พิมพ์ ACS 1500(ร้อยเอ็ด จำกัด สหราชอาณาจักร) และเซลล์ผนังคู่แก้ว electrolyticระบายความร้อนด้วย โดยส่วนผสมของน้ำและกลีเซอรที่ใช้ Haake V15 thermostaticอาบน้ำ มีการกรอกข้อมูลเซลล์ electrolytic กับอิเล็กโทร ซึ่งประกอบด้วย 0.02 M แคลเซียม acetate (P99% ซิก-Aldrich) และ0.15 M แคลเซียม glycerophosphate (Dr. Paul Lohmann เยอรมนี)วิธีแก้ไขปัญหาที่ 0, 0.3 และ 3.0 g l1 Ag เก็บกัก (99.5% ซิก-Aldrich)เพิ่ม รักษา homogeneity อนุภาคอิเล็กโทรถูกกวนที่ 500 rpm ระหว่างสาธารณรัฐประชาธิปไตย สาธารณรัฐประชาธิปไตยดำเนินกระบวนการภายใต้เงื่อนไข galvanostatic ใช้กระแสความหนาแน่นของ 20 A dm2 สำหรับ 300 s เอาใด ๆ Ag unattachedNPs หลังจากตัวอย่างการบำบัดที่ถูกเก็บไว้ในรันการสาธารณรัฐประชาธิปไตยน้ำประปาสำหรับ 5 นาที ultrasonically ในเอทานอล 70% และ rinsedสำหรับ 5 นาทีในน้ำ deionized ตัวอย่างทั้งหมดถูก sterilized สำหรับ h 1 ที่110 C ที่ใช้เตา Nabertherm TR60 ตัวอย่างรหัส อิเล็กโทรพารามิเตอร์กระบวนการและองค์ประกอบแสดงในตารางที่ 1 เคลือบสัณฐานวิทยาถูกตรวจสอบโดยใช้ SEM ความหนาถูกวัดโดยใช้การ Elcometer 456 เคลือบเครื่องวัดความหนาและองค์ประกอบธาตุถูกกำหนด โดยพลังงาน dispersiveเอ็กซ์เรย์วิเคราะห์ (เรื่อง)2.1.2. Ag ออกดำเนินการทดลองนำ Ag ใน triplicates สำหรับการ0.3 Ag และ 3.0 Ag ตัวอย่าง ดิสก์ที่ตกแต่งไว้ในความมืดWheaton ขวดประกอบด้วย 30 ml คู่น้ำกลั่น และเก็บที่ 37 C ภายใต้เงื่อนไขการกวนเบา ๆ ขึ้นไป 7 วัน ของเหลวถูกรวบรวมในวันที่ 1, 2, 5 และ 7 และแทนที่ด้วยสดน้ำกลั่นคู่ ตัวอย่างที่เก็บทั้งหมดถูก acidified ด้วยHNO3 จะเข้มข้นสุดท้าย 0.5 เมตร และถูกวิเคราะห์ด้วยแกรไฟต์เตาดูดกลืนโดยอะตอม spectrometry (GF-AAS)เทคนิคการใช้เครื่องมือ 4100ZL PerkinElmer เวลาเลือกจุดตามการทดสอบ cytotoxicity2.1.3 การ Ag รวมเนื้อหาในการเคลือบยอดเงินรวมในการเคลือบได้กำหนดสำหรับ 0.3 Ag และ 3.0 Ag ตัวอย่าง เมตริกซ์ TiO2แบริ่ง Ag NPs ถูกละลายใน 98% กำมะถันที่ 90 C ในการอัลตราโซนิกอ่างอาบน้ำ 2 h หลังจากทำความเย็น 69% HNO3 ได้เพิ่มเติมละลาย NPs Ag หลวม และทดสอบตัวอย่างของเหลวในAg เนื้อหากับกอะตอมดูดซึมเปลวไฟใช้ PerkinElmer AAnalyst 100 เทคนิค (เปลวไฟ-AAS)เครื่องมือการประมาณยอดรวมของ Ag สำหรับรุ่น ใหม่ชุดตัวอย่างสาธารณรัฐประชาธิปไตยเคลือบถูกแช่อยู่ใน 15 ml HNO3 ด้วยการความเข้มข้น 69% เท่าที่สัมผัส Ag NPs (เช่นฝังบนพื้นผิวและภาย ใน porosity เปิด) จะละลายโดยกรดไนตริก หลังจาก 24 ชม ของเหลวแช่ถูกรวบรวม และวิเคราะห์โดยเปลวไฟ AAS2.2 การประเมิน cytotoxicity เพาะเลี้ยง2.2.1. เซลล์วัฒนธรรมเซลล์ HFO ญา [13] ได้ precultured สำหรับ 1 สัปดาห์ในที่ต่ำสำคัญปานกลาง (aMEM) (GIBCO, Paisley สหราชอาณาจักร) เสริมมี 20 มม. 4- (2-hydroxyethyl) กรด piperazine-1-ethanesulfonic(HEPES) (ซิก-Aldrich), streptomycin 2% / ยาเพนนิซิลลิน 1.8 มม.CaCl2 (ซิก-Aldrich) และ 10% ยกเลิกร้อนลูกครรภ์เซรั่ม(HI-FCS) (GIBCO) ที่ pH 7.5, 37 C และ 5% CO2 ในบรรยากาศ humidifiedช่วงนี้ preculture เซลล์ HFO ญายังคงอยู่ในการขั้น undifferentiated หลังจาก preculturing เซลล์ถูกล้างมีฟอสเฟตเป็น buffered เกลือ (PBS), เดี่ยวด้วยทริปซิน ตรวจนับ ด้วยการ hemocytometer และ seeded บนตัวอย่างในความหนาแน่น 3.5 104 เซลล์ต่อดิสก์ (AMEM osteogenic ปานกลางเสริม ด้วยสดบี-glycerophosphate (ซิก-Aldrich)(10 mM) และ dexamethasone (ซิก-Aldrich) (100 nM)) ได้เพิ่ม เริ่มต้นหลังจากปลูก 2 วัน และเปลี่ยนทุก 2-3 วันดิสก์ที่เคลือบพอดีแม่นยำดี 12 แผ่น หลีกเลี่ยงการเจริญเติบโตของเซลล์บนโฟม2.2.2 การเซลล์ชีวิตวิเคราะห์ทดสอบ AlamarBlue (Invitrogen) ใช้ในการประเมินเซลล์ HFO ญาชีวิตบนเคลือบ Ag-แบริ่งและฟรี Ag ในวันที่ 2, 5 และ7 ของวัฒนธรรม AlamarBlue รีเอเจนต์ถูกเพิ่มเข้าไปแต่ละอย่างดี ในการยอดเงินเท่ากับ 10% ของปริมาตรดี แผ่นที่ incubatedสำหรับ h 3 เพิ่มเติมที่ 37 C ให้ resazurin สีน้ำเงินเป็นสีย้อมฟลูออเรสเซนต์ไม่ใช่ตัวบ่งชี้ การแปลงฟลูออเรสเซนต์สีแดงสูงresorufin ผ่านปฏิกิริยาลด metabolically ใช้งานอยู่เซลล์ วัด fluorescence ขึ้นบน Wallac microplatefluorometer ที่ใช้การในการกระตุ้นจำนวน 535 นาโนเมตรและปล่อยก๊าซของ 590 nm การทดสอบที่ดำเนินการน้อยใน triplicateตารางที่ 1ตัวอย่างรหัส ส่วนประกอบอิเล็กโทร และใช้พารามิเตอร์กระบวนการตัวอย่างรหัสส่วนประกอบอิเล็กโทรพารามิเตอร์กระบวนการแคลเซียม acetateโมล L1Glycero-ฟอสเฟตแคลเซียมโมล L1เก็บกัก Agg L1ปัจจุบันความหนาแน่นการ dm2แรงดันสุดท้ายVระยะเวลานาทีอุณหภูมิ Cเริ่มต้นสิ้นสุด0 Ag 0.02 0.15 0 20 239 2 5 11 ±±± 1 34 0.30.3 Ag 0.02 0.15 ± 0.3 20 234 3 5 11 1 33 ±± 0.93.0 Ag 0.02 0.15 ± 3.0 20 237 2 5 11 1 32 ±± 1Al. et Necula ปริญญาตรี 4192 / คตา Biomaterialia 8 (2012) 4191-41972.2.3. HFO ญาสัณฐานวิทยาเซลล์และทดสอบประมาณญา-HFO สังเกตสัณฐานวิทยาของเซลล์และการแพร่กระจายใช้ SEM. หลังจากวันที่ 2, 5 และ 7 วัฒนธรรม HFO ญาในการเคลือบดิสก์ เซลล์ได้คง มี 4% glutaraldehyde ฟอร์มาลดีไฮด์และ 2%ใน 0.1 M โซเดียม cacodylate โซลูชันที่ 4 C สำหรับ 1 h.ตัวอย่างที่ rinsed ใน 0.1 M โซเดียม cacodylate โซลูชั่น และอบแห้งในชุดของเอทานอลที่มีการจัดระดับ และ tetramethylsilane 100%ตัวอย่างทั้งหมดมีทองเคลือบ และตรวจสอบในการ Jeolกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนการสแกน 6500F D ดำเนินการใน 5 – 10 kV2.2.4 การ fluorescence microscopy ขององค์กร cytoskeletal แอกติน และนิวเคลียสหลังจาก culturing สำหรับ 48 h เซลล์ seeded บนดิสก์เคลือบล้าง ด้วย PBS และถาวรสำหรับ 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องใช้ paraformaldehyde 4% ใน PBS หลังจาก rinses สามด้วย PBSเซลล์ถูก permeabilized กับ PBS/ไตร ตั้น X-100 ใน 10 นาที และสีกับ rhodamine – phalloidin (Invitrogen) (1: 100 ใน PBS) สำหรับ20 นาที ที่อุณหภูมิห้อง และ ในมืด ดิสก์ถูกเพิ่มเติมสาม rinsed เวลา ด้วย PBS และสีกับ 40 แบบ, 6-diamidino-2 -phenylindole (DAPI) โซลูชั่น (Invitrogen) (1:50000 ใน PBS)5 นาที การแอกติน cytoskeleton และเซลล์แอลฟาถูกตรวจสอบโดยใช้การ epifluorescence กล้องจุลทรรศน์ (Nikon คราส LV 100D-U ญี่ปุ่น)2.3 การกิจกรรมเพาะในต้านเชื้อแบคทีเรียกิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียของชั้นเรือง Ag กับ MRSAถูกประเมินในหลอดใช้ญี่ปุ่นอุตสาหกรรมมาตรฐาน JIS Z2801:2000 [14] ปรับเปลี่ยนเพื่อดีสร้างสถานการณ์การฟันติดเชื้อระหว่างผ่าตัดเป็นหลัก [9] ในระยะสั้น น้ำยาสดวัฒนธรรมของ MRSA ต้องใช้ AMC201 ถูกเตรียม โดยการเพิ่ม 1 – 5 อาณานิคมจากแผ่นริ้วใน 5 ml ของซุปถั่วเหลือง trypticase (TSB)ระบบกันสะเทือนถูก incubated ที่ 37 C ภายใต้หมุนสำหรับ 2 hและต่อมาแตกออกกับ TSB จะความหนาแน่นออปติคอล (OD620)ของ 0.03 ที่สอดคล้องกับหน่วยการ 107 เป็นโคโลนี (CFU) ต่อมิลลิลิตรใส่ดิสก์กรอง sterilized nitrocellulose ใน agar เลือดจานและ 20 จะวัฒนธรรม MRSA แตกออก ประกอบด้วย 2 105CFU ถูก pipetted ไปยังตัวกรอง สื่อที่ถูกดูดซึมโดยagar ในขณะที่แบคทีเรีย MRSA ได้เก็บไว้ในตัวกรอง20 จะ TSB ในฟอสเฟต 10 มม.ถูก pipetted ใจกลางเมืองบน% 1พื้นผิวของแต่ละดิสก์ไทเทเนียมและดิสก์การกรอง inoculatedถูกวางอย่างระมัดระวังบน กับแบคทีเรียที่ติดต่อพื้นผิวเคลือบ ดิสก์ทั้งหมดที่ มีตัวกรองแบคทีเรียถูกวางแยกกันในจาน petri และ incubated ที่ 37 C ใน 24 h ในชื้นบรรยากาศ หลังจากบ่ม แต่ละดิสก์ และตัวกรองที่เกี่ยวข้องไว้ใน 5 ml ของ TSB, sonicated s และ vortexed สำหรับ 301 นาทีเพื่อไล่ออกแบคทีเรียนฤมล ขั้นตอนนี้ไม่มีผลต่อเชื้อแบคทีเรียนี้ เจ็ด dilutions ten-fold ประจำการทำการแผ่น 96-ดี ในเวลาต่อมา triplicate 10 aliquots จะของที่หัวระงับ และของ dilutions เจ็ดได้ pipetted ไปagar เลือดแผ่น แผ่นเลือด agar ได้ incubated ค้างคืนที่ 37 C และของอาณานิคมที่นับวันต่อไปนี้มีดำเนินการทดลองทั้งหมดน้อยใน triplicate2.4. สถิติวิเคราะห์ดำเนินการวิเคราะห์ทางสถิติโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวทดสอบและวิธี Tukey – Kramer การเปรียบเทียบหลายที่ไม่ได้วางแผนหมายถึงตามขนาดตัวอย่างไม่เท่ากัน ใน Tukey –วิธี Kramer มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญต่ำสุด (เครื่องมือ)calculated for each pair of means. If the observed absolute differencebetween a pair of means was greater than the MSD, the pairof means was declared significantly different.3.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

12. วัสดุและวิธีการ
2.1 การสังเคราะห์เคลือบสีและลักษณะ
2.1.1 การเตรียมความพร้อมของการเคลือบ TiO2 Ag แบก
Ti-6Al-7NB ดิสก์โลหะผสมชีวการแพทย์ (22 มิลลิเมตรเส้นผ่าศูนย์กลาง 8 มิลลิเมตร
สูง) ถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้ พวกเขาได้รับพื้นดินที่มี 320, 800
และ 1200 # เอกสารขัดและทำความสะอาดแล้ว ultrasonically ด้วยอะซิโตน,
เอทานอลและน้ำกลั่นในอ่างอัลตราโซนิกก่อนที่จะ PEO
รักษา กระบวนการ PEO กำลังดำเนินการที่กำหนดเองทำในห้องปฏิบัติการ
ขนาดตั้งขึ้นประกอบด้วยแหล่งจ่ายไฟ AC ชนิดเอซีเอส 1500
(ET Power Systems จำกัด , UK) และแก้วคู่ผนังเซลล์ไฟฟ้า
ระบายความร้อนด้วยส่วนผสมของน้ำและกลีเซอรอลโดยใช้ Haake V15 อุณหภูมิ
อาบน้ำ เซลล์ไฟฟ้าก็เต็มไปด้วยอิเล็กซึ่ง
ประกอบด้วย 0.02 M acetate แคลเซียม (P99% Sigma-Aldrich) และ
0.15 M แคลเซียม glycerophosphate (ดร. พอล Lohmann, เยอรมนี)
โซลูชั่นที่ 0, 0.3 และ 3.0 กรัม l1 อนุภาคนาโน Ag (99.5 % Sigma-Aldrich)
ถูกเพิ่ม เพื่อรักษาความสม่ำเสมอของอนุภาค
ถูกกวนอิเล็กโทรไลที่ 500 รอบต่อนาทีในระหว่างกระบวนการ PEO PEO
กระบวนการที่ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไข galvanostatic ใช้ในปัจจุบัน
ความหนาแน่น 20 DM2 300 s ในการลบ Ag ใดโสด
NPS หลังจาก PEO ประมวลผลกลุ่มตัวอย่างได้รับการรักษาที่ถูกเก็บไว้ในการทำงาน
น้ำประปาเป็นเวลา 5 นาทีทำความสะอาด ultrasonically ในเอทานอล 70% และล้าง
เป็นเวลา 5 นาทีในน้ำปราศจากไอออน ตัวอย่างทั้งหมดได้ผ่านการฆ่าเชื้อเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่
110 องศาเซลเซียสโดยใช้เตาอบ Nabertherm TR60 โค้ดตัวอย่าง, อิเล็กโทรไล
ส่วนประกอบและพารามิเตอร์กระบวนการมีการระบุไว้ในตารางที่ 1 เคลือบ
สัณฐานถูกตรวจสอบโดยใช้ SEM, ความหนาของสี
ได้รับการวัดโดยใช้ Elcometer 456 เครื่องวัดความหนาเคลือบ,
และองค์ประกอบธาตุถูกกำหนดโดยกระจายพลังงาน
การวิเคราะห์ X-ray (EDX ).
2.1.2 Ag ปล่อย
Ag ปล่อยทดลองดำเนินการใน triplicates สำหรับ
0.3 และ 3.0 Ag ตัวอย่าง Ag ดิสก์ออกซิไดซ์ถูกวางไว้ในที่มืด
Wheaton ขวดมี 30 มล. น้ำกลั่นคู่และ
เก็บไว้ที่ 37 C ภายใต้เงื่อนไขกวนอ่อนโยนถึง 7 วัน ของเหลวที่
ถูกเก็บในวันที่ 1, 2, 5 และ 7 และแทนที่ด้วยสด
น้ำกลั่นคู่ ตัวอย่างที่เก็บรวบรวมทั้งหมดถูกกรดกับ
HNO3 ความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.5 M และได้รับการวิเคราะห์ด้วย
เตาไฟท์ spectrometry การดูดซึมของอะตอม (GF-AAS)
เทคนิคการใช้เครื่องมือ PerkinElmer 4100ZL เวลา
จุดที่ได้รับการคัดเลือกตามการทดสอบความเป็นพิษ.
2.1.3 เนื้อหาทั้งหมด Ag ในการเคลือบ
จำนวนเงินรวมอยู่ในการเคลือบที่ถูก
กำหนดสำหรับ 0.3 และ 3.0 Ag ตัวอย่าง Ag เมทริกซ์ TiO2,
แบริ่ง NPS Ag ถูกกลืนหายไปใน 98% H2SO4 ที่ 90 C ในล้ำ
อาบน้ำเป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากที่ระบายความร้อน 69% HNO3 ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อ
ละลาย NPS Ag หลวมและตัวอย่างของเหลวได้มีการทดสอบสำหรับ
เนื้อหา Ag กับสเปคโทรดูดซึมอะตอมเปลวไฟ
(ไฟ AAS) โดยใช้เทคนิค PerkinElmer AAnalyst 100
ตราสาร.
เพื่อประมาณการจำนวนของ Ag ใช้ได้สำหรับการเปิดตัวใหม่
ชุดของ PEO ตัวอย่างเคลือบถูกแช่อยู่ใน 15 มล. HNO3 ที่มี
ความเข้มข้น 69% เพียงสัมผัส Ag NPS (ฝังตัวเช่นบน
พื้นผิวและภายในรูพรุนเปิด) จะเลือนหายไปจาก
กรดไนตริก หลังจาก 24 ชั่วโมงของเหลวแช่ถูกเก็บรวบรวมและวิเคราะห์
โดย AAS เปลวไฟ.
2.2 ในการประเมินผลเป็นพิษต่อเซลล์เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ
2.2.1 การเพาะเลี้ยงเซลล์
เซลล์ SV-HFO [13] ถูก precultured 1 สัปดาห์ในขั้นต่ำ
ที่จำเป็นขนาดกลาง (aMEM) (GIBCO ลายสหราชอาณาจักร) เสริม
ด้วย 20 มม 4 (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic กรด
(HEPES) (Sigma-Aldrich), streptomycin 2% / penicillin, 1.8 มิลลิ
CaCl2 (Sigma-Aldrich) และ 10% ในซีรั่มของทารกในครรภ์ลูกวัวความร้อนการใช้งาน
(HI-FCS) (GIBCO) ที่ pH 7.5, 37 ซีและ CO2 5% ความชื้น บรรยากาศ.
preculture ในช่วงนี้เซลล์ SV-HFO ยังคงอยู่ใน
ขั้นตอนที่แตกต่าง หลังจาก preculturing เซลล์ถูกล้าง
ด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส), เดี่ยวพร้อม
trypsin นับกับ hemocytometer และเมล็ดตัวอย่าง
ความหนาแน่น 3.5 104 เซลล์ต่อดิสก์ กลาง osteogenic (aMEM
สดเสริมด้วย B-glycerophosphate (Sigma-Aldrich)
(10 มิลลิเมตร) และ dexamethasone (Sigma-Aldrich) (100 นาโนเมตร)) ได้รับการ
เพิ่มเริ่มต้น 2 วันหลังจากการเพาะและเปลี่ยนทุก 2-3 วัน.
แผ่นเคลือบ พอดีแม่นยำในแผ่น 12 ดีหลีกเลี่ยงการ
เจริญเติบโตของเซลล์ในสไตรีน.
2.2.2 มีชีวิตเซลล์ทดสอบ
ทดสอบ AlamarBlue (Invitrogen) ถูกนำมาใช้ในการประเมิน SV-HFO เซลล์
มีชีวิตใน Ag-แบริ่งและสารเคลือบ Ag ฟรี วันที่ 2, 5 และ
7 ของวัฒนธรรม, น้ำยา AlamarBlue ถูกบันทึกอยู่ในแต่ละดีใน
จำนวนเท่ากับ 10% ของปริมาณที่ดี แผ่นถูกบ่ม
อีก 3 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเพื่อให้การ resazurin, สีฟ้า
สีย้อมตัวบ่งชี้ที่ไม่เรืองแสงจะถูกแปลงเป็นสีแดงเรืองแสงสูง
resorufin ผ่านปฏิกิริยาการลดลงของการใช้พลังงาน
เซลล์ วัดเรืองแสงที่ถูกสร้างขึ้นใน Wallac microplate
fluorometer ใช้ระยะเวลาในการกระตุ้น 535 นาโนเมตรและการปล่อย
ของ 590 นาโนเมตร การทดสอบได้ดำเนินการอย่างน้อยในเพิ่มขึ้นสามเท่า.
ตารางที่ 1
โค้ดตัวอย่างชิ้นส่วนอิเล็กโทรและพารามิเตอร์กระบวนการใช้.
ตัวอย่าง
รหัส
พารามิเตอร์อิกระบวนการส่วนประกอบ
acetate แคลเซียม
mol L1
glycero แคลเซียมฟอสเฟต
mol L1
อนุภาคนาโน Ag,
L1 กรัม
ความหนาแน่นปัจจุบัน
DM2
รอบชิงชนะเลิศ แรงดันไฟฟ้า
V
ระยะเวลา
นาที
อุณหภูมิ, C
เริ่มปลาย
0 Ag 0.02 0.15 0 20 239 ± 2 5 11 ± 1 34 ± 0.3
0.3 0.02 0.15 Ag 0.3 20 234 ± 3 5 11 ± 1 33 ± 0.9
3.0 0.02 0.15 Ag 3.0 20 237 ± 2 5 11 ± 1 32 ± 1
4192 BS Necula et al, / Acta Biomaterialia 8 (2012) 4191-4197
2.2.3 SV-HFO สัณฐานวิทยาและการแพร่กระจายของเซลล์ทดสอบ
SV-HFO สัณฐานวิทยาและการแพร่กระจายของเซลล์ถูกตั้งข้อสังเกต
การใช้ SEM หลังจากที่ 2, 5 และ 7 วันต่อของวัฒนธรรม SV-HFO บนเคลือบ
ดิสก์เซลล์ได้รับการแก้ไขด้วยดีไฮด์ 4% และ 2% glutaraldehyde
ใน 0.1 M สารละลายโซเดียม cacodylate ที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง
ตัวอย่างที่ถูกล้างใน 0.1 M สารละลายโซเดียม cacodylate และ
แห้งในชุดของเอทานอลอย่างช้า ๆ แล้ว 100% tetramethylsilane.
ทุกตัวอย่างที่ถูกเคลือบทองและตรวจสอบใน Jeol
6500F-D กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบการดำเนินการที่ 5-10 kV.
2.2.4 . กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงขององค์กรโครงสร้างเซลล์และโปรตีน
นิวเคลียส
หลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 48 ชั่วโมงเซลล์เมล็ดบนดิสก์เคลือบ
ล้างถูกกับพีบีเอสและคงเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
โดยใช้ paraformaldehyde 4% ในพีบีเอส หลังจากสาม rinses กับพีบีเอส
เซลล์ถูก permeabilized กับพีบีเอส / Triton X-100 เป็นเวลา 10 นาทีและ
ย้อมด้วยสี rhodamine-phalloidin (Invitrogen) (1: 100 พีบีเอส) สำหรับ
20 นาทีที่อุณหภูมิห้องและในที่มืด ดิสก์ถูกเพิ่มเติม
ล้างสามครั้งกับพีบีเอสและย้อมด้วยสี 40
6 diamidino-2-
phenylindole (DAPI) วิธีการแก้ปัญหา (Invitrogen) (1: 50000 ในพีบีเอส) ใน
5 นาที โครงร่างของเซลล์และโปรตีนเซลล์นิวเคลียสมีการตรวจสอบโดยใช้
กล้องจุลทรรศน์ epifluorescence (Nikon คราส LV 100D-U, ญี่ปุ่น).
2.3 ฤทธิ์ต้านแบคทีเรียในหลอดทดลอง
ฤทธิ์ต้านแบคทีเรียของชั้นแบก Ag กับ MRSA
ได้รับการประเมินในหลอดทดลองโดยใช้มาตรฐานอุตสาหกรรมญี่ปุ่น JIS Z
2801: 2000 [14] การแก้ไขให้ดีขึ้นทำซ้ำสถานการณ์ของรากเทียม
การติดเชื้อในระหว่างการผ่าตัดหลัก [9] ในระยะสั้นที่มีสภาพคล่องสด
วัฒนธรรมของเชื้อ MRSA AMC201 ความเครียดถูกจัดทำขึ้นโดยการเพิ่ม 1-5 อาณานิคม
จากแผ่นแนวเป็น 5 มิลลิลิตร trypticase น้ำซุปถั่วเหลือง (TSB).
ระงับถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสภายใต้การหมุนหรือไม่? 2 ชั่วโมง
และ ต่อมาเจือจางกับ TSB จะหนาแน่นออปติคอล (OD620)
0.03 สอดคล้องกับ 107 หน่วยอาณานิคมขึ้นรูป (CFU) ต่อมล.
ฆ่าเชื้อ nitrocellulose แผ่นกรองถูกวางไว้บนอาหารเลี้ยงเชื้อในเลือด
และ 20 แผ่น LL ของวัฒนธรรม MRSA เจือจางที่มี 2 105
CFU ถูกปิเปตลงบนตัวกรอง กลางถูกดูดกลืนโดย
วุ้นในขณะที่แบคทีเรีย MRSA ถูกเก็บไว้ในตัวกรอง.
20 LL 1% ใน TSB ฟอสเฟต 10 มิลลิปิเปตอยู่บน
พื้นผิวของแต่ละดิสก์ไทเทเนียมและดิสก์กรองเชื้อ
ถูกวางไว้อย่างรอบคอบด้านบนด้วย แบคทีเรียติดต่อ
พื้นผิวเคลือบ ดิสก์ทั้งหมดที่มีตัวกรองแบคทีเรียถูกวางไว้เป็นรายบุคคล
ในอาหารเลี้ยงเชื้อและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในที่ชื้น
บรรยากาศ หลังจากการบ่มแต่ละดิสก์และตัวกรองที่สอดคล้องกัน
อยู่ใน 5 มิลลิลิตร TSB, sonicated 30 และสำหรับการ vortex
1 นาทีเพื่อขับไล่แบคทีเรียสานุศิษย์ ขั้นตอนนี้จะไม่ส่งผลกระทบต่อ
ความมีชีวิตของเชื้อแบคทีเรีย เซเว่นเจือจางอนุกรมสิบเท่าได้ทำใน
แผ่น 96 หลุม ต่อมาเพิ่มขึ้นสามเท่า 10 LL aliquots ของเจือปน
ระงับและเจ็ดถูกเจือจางปิเปตลงบน
จานอาหารเลี้ยงเชื้อในเลือด แผ่นวุ้นเลือดถูกบ่มค้างคืน
ที่ 37 C และจำนวนโคโลนีที่นับวันรุ่งขึ้น.
การทดลองทั้งหมดถูกดำเนินการอย่างน้อยในเพิ่มขึ้นสามเท่า.
2.4 การวิเคราะห์ทางสถิติ
การวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการโดยใช้ทางเดียว Anova
และวิธีการทดสอบ Tukey-เครเมอที่จะทำให้การเปรียบเทียบที่ไม่ได้วางแผนหลาย
วิธีขึ้นอยู่กับขนาดตัวอย่างที่ไม่เท่ากัน ใน Tukey-
วิธีเครเมอแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญต่ำสุด (เอ็มเอส) ได้รับการ
คำนวณสำหรับคู่ของแต่ละวิธี หากสังเกตความแตกต่างแน่นอน
ระหว่างคู่ของวิธีการมากกว่าเอ็มเอสทั้งคู่
หมายถึงการประกาศที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ.
3

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

12 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . ไม้แปรรูป การสังเคราะห์และศึกษาสมบัติ
2.1.1 . การเตรียมการของ AG แบริ่ง ) เคลือบ
Ti – 6al – 7nb ชีวการแพทย์ล้อแม็กดิสก์ ( 22 มม. เส้นผ่าศูนย์กลาง ความสูง ความยาว 8
) สถิติที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ พวกเขามีพื้น 320 , 800 และ 1 , 200 #
abrasive เอกสารแล้ว ultrasonically ล้างด้วยอะซิโตน เอทานอล และน้ำกลั่น
ในอ่างอัลตัน
ก่อนการรักษากระบวนการประชาการใน custom-made ห้องปฏิบัติการ
ขนาดติดตั้งประกอบด้วยแหล่งจ่ายไฟ AC ACS ประเภท 1500
( และระบบพลังงาน จำกัด , UK ) และผนังสองแก้วฟังเพลง เซลล์อิเล็กโทรไลต์
เย็นโดยส่วนผสมของน้ำและกลีเซอรอลโดยใช้ฮาก v15 thermostatic
อาบน้ำ เซลล์อิเล็กโทรไลต์ electrolytic เต็ม ไป ด้วย ซึ่งประกอบด้วยแคลเซียมอะซิเตต ( 0.02 M
p99 % , Sigma –ดิช )
015 เมตร แคลเซียม glycerophosphate ( ดร. พอล Lohmann , เยอรมนี )
โซลูชั่นที่ 0 , 0.3 และ 3.0 g l1 AG นาโน 99.5% ซิกม่า–ดิช )
ถูกเพิ่ม เพื่อรักษาความสม่ำเสมอของอนุภาค
อิเล็กโทรไลต์คือการกวน 500 รอบต่อนาทีในระหว่างกระบวนการประชา . กระบวนการประชา
กระทำภายใต้เงื่อนไข galvanostatic โดยใช้ความหนาแน่น
20 DM2 300 เอสเพื่อลบใด ๆโดยไม่โดย
,หลังจากที่เป้าหมายกระบวนการปฏิบัติตัวอย่างถูกวิ่ง
น้ำนาน 5 นาที ultrasonically ทำความสะอาดในเอทานอล 70% และล้าง
5 นาทีคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ ตัวอย่างทั้งหมดจะถูกฆ่าเชื้อ 1 H ที่
110 C ใช้ nabertherm tr60 เตาอบ โค้ดตัวอย่าง ส่วนประกอบของอิเล็กโทรไลต์
และพารามิเตอร์ของกระบวนการมีการระบุไว้ในตารางที่ 1 สัณฐานวิทยาเคลือบ
ถูกตรวจสอบโดยใช้ SEM
ความหนาผิวเคลือบวัดโดยใช้เครื่องวัดความหนาผิวเคลือบ elcometer 456
และองค์ประกอบธาตุ , โดยการวัดรังสีกระจายพลังงานการวิเคราะห์ ( การวัด )
.
2.1.2 . โดยปล่อย
การทดลองปล่อย AG จำนวน 3 ซ้ำสำหรับ
0.3 AG และ 3.0 โดยตัวอย่าง จากดิสก์ที่ถูกวางในที่มืด
Wheaton ขวดบรรจุ 30 มล. น้ำกลั่นและ
คู่เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ภายใต้สภาวะที่อ่อนโยนกวนถึง 7 วัน ของเหลว
รวบรวมในวันที่ 1 , 2 , 5 และ 7 และแทนที่ด้วยสด
คู่น้ำกลั่น ทั้งหมดที่รวบรวมจำนวนที่ปรับมี
กรดดินประสิวกับความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 เมตร และ วิเคราะห์ข้อมูลด้วย
เตากราไฟต์ Atomic absorption spectrometry ( gf-aas )
โดยใช้เทคนิค Perkinelmer 4100zl เครื่องดนตรี เวลา
จุดที่ตามต่อการทดสอบ
ทาง . เนื้อหาโดยรวมในการเคลือบ
ยอดรวมของเงินรวมในการเคลือบคือ
มุ่งมั่นสำหรับ 0.3 AG และ 3.0 โดยตัวอย่าง นําเมทริกซ์
แบริ่งเอจีโดยถูกละลายในกรดซัลฟิวริก 98% ที่ 90 องศาเซลเซียส ในอ่างอาบน้ำด้วย
2 ชั่วโมงหลังจากเย็น , 69 % กรดดินประสิวคือเพิ่มต่อ
ละลายเนื่องจากหลวม AG ,และตัวอย่างของเหลว ทดสอบ
โดยเนื้อหากับ Flame Atomic absorption spectroscopy ( AAS
เปลวไฟ ) โดยใช้เทคนิค Perkinelmer aanalyst

ประมาณ 100 เครื่อง รวมมูลค่า AG พร้อมปล่อยใหม่
ชุดของตัวอย่างที่เคลือบันถูกแช่ในกรดดินประสิว 15 ml ด้วย
ความเข้มข้นของ 69 % เพียงสัมผัสโดย NPS ( เช่นฝังตัวบน
พื้นผิวและภายในรูพรุนเปิด ) จะถูกยุบ โดย
กรดไนตริก หลังจาก 24 ชั่วโมง แช่น้ำที่ถูกเก็บรวบรวมและวิเคราะห์โดย AAS เปลวไฟ
.
2.2 . ในการประเมินความเป็นพิษต่อเซลล์เพาะเลี้ยง
2.2.1 . เซลล์วัฒนธรรม
sv-hfo เซลล์ [ 13 ] 1 อาทิตย์ใน 1949 a-minimum
ขนาดกลางที่จำเป็น ( ครั้งที่ ) ( gibco Paisley , สหราชอาณาจักร , ) เสริม
20 มม. 4 - ( 2-hydroxyethyl )
piperazine-1-ethanesulfonic กรด( ฮีเปส ( Sigma ) ( อัลดริช ) , 2% ยารักษา / เพนนิซิลิน , CaCl2 1.8 mm
( Sigma ) ดิช ) และ 10 % ไฮโดรซีรัมลูกโค ( fetal ความร้อน
hi-fcs ) ( gibco ) ที่ pH 7.5 และ 37 องศาเซลเซียสคาร์บอนไดออกไซด์ 5% ใน humidified บรรยากาศ .
ในพันธุ์นี้ เซลล์ sv-hfo ยังคงอยู่ใน เป็น
เวทีที่ไม่แตกต่างกัน . หลังจาก preculturing เซลล์ถูกล้าง
กับฟอสเฟตในน้ำเกลือ ( PBS ) ทริปเดี่ยวกับ
,