Grow bacterial (E. coli) culture in

Grow bacterial (E. coli) culture in LB medium with appropriate antibiotics at 37 °C overnight (O/N) with shaking. For >10 copies plasmid, 3 ml cell culture is usually enough.
Transfer O/N culture to a 1.5-ml eppendorf tube, and spin down cell culture (twice) at high speed for 1 min at table-top centrifuge.
Discard the supernatant. To remove the liquid completely by upside down tube onto a piece of paper towel for a few sec.
Add 100 μl of resuspension solution (P1 buffer) into each tube, and vortex to completely resuspend cell pellet
Add 100 μl of lysis solution (P2 buffer) and mix by gently inverting the tube 5-6 times. The solution should quickly turn transparent and become more viscous indicating bacterial
lysis has taken place.
Add 150 μl of neutralizing solution (P3 buffer) and mix by inverting the tubes several times. At this point bacterial chromosomal DNA is usually seen as a white precipitate.
Centrifuge the tubes at high speed for 10 min.
Carefully transfer the supernatant (try to not disturb the white precipitate) to a new labeled 1.5-ml eppendorf tube with a 1ml pipette.
Add 2.5-3 volume of 200-proof cold ethanol (stores at -20 °C) to each tube and mix by inverting the tubes a few times.
Spin down plasmid DNA precipitate (transparency pellet) at high speed for 10 min.
Discard the supernatant and remove the remaining liquid as much as possible by leaving the tube upside-down on a piece of paper towel, then keep the tubes in a tube holder and air dry for 10-20 min. To dry faster, keep tubes at 37 °C heat blocker. DNA precipitate turns white when dry.
Resuspend the DNA pellet with 50 μl TE. Completely dissolve the pellet by pipetting solution several times.
Note: Large amounts of RNA is present in the DNA sample. Therefore, for subsequent reactions, for example, to digest plasmid DNA, add 1-5 μl (1 mg ml-1) RNAase to the digestion solution to completely remove RNA. Or, add RNAase directly to the resuspension solution with a final concentration of 1 mg ml-1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เติบโตวัฒนธรรมแบคทีเรีย (E. coli) ในปอนด์กับยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมที่ 37 ° C ค้างคืน (O N) กับสั่น สำหรับ > สำเนา 10 plasmid วัฒนธรรมเซลล์ 3 ml เป็นปกติพอโอนย้ายวัฒนธรรม O/N ไปหลอด 1.5 มิลลิลิตร eppendorf และหมุนลงเซลล์วัฒนธรรม (สอง) ที่ความเร็วสูงใน 1 นาทีที่โต๊ะเครื่องหมุนเหวี่ยงละทิ้ง supernatant การเอาการของเหลวทั้งหมดโดยคว่ำลงท่อบนชิ้นส่วนของกระดาษเช็ดสำหรับไม่กี่วินาทีเพิ่ม μl 100 ของโซลูชันการ resuspension ตะกอน (บัฟเฟอร์ P1) ในแต่ละหลอด และ vortex สมบูรณ์ resuspend เซลล์เม็ด เพิ่ม 100 μl lysis โซลูชัน (p 2 บัฟเฟอร์) และผสม ด้วยทำให้สีตรงกันข้ามหลอด 5 - 6 ครั้ง การแก้ปัญหาอย่างรวดเร็วควรเปิดโปร่งใส และกลายเป็นความหนืดมากขึ้นบ่งชี้ว่า แบคทีเรียlysis ได้เกิดขึ้นเพิ่ม μl 150 ของ neutralizing โซลูชัน (P3 บัฟเฟอร์) และผสม ด้วยสีตรงกันข้ามหลอดหลายครั้ง จุดนี้ ของโครโมโซม DNA จากแบคทีเรียมักจะเห็นเป็น precipitate ขาวCentrifuge ท่อที่ความเร็วสูงสำหรับ 10 นาทีอย่างโอน supernatant (พยายามไม่รบกวน precipitate ขาว) ลงป้าย eppendorf 1.5 ml หลอดกับเปตต์ 1mlเพิ่มปริมาณ 2.5-3 200 กันเย็นเอทานอล (เก็บที่-20 ° C) แต่ละท่อ และผสม ด้วยสีตรงกันข้ามหลอดกี่ครั้งหมุนลง plasmid DNA precipitate (โปร่งใสเม็ด) ที่ความเร็วสูงสำหรับ 10 นาทีละทิ้ง supernatant และเอาของเหลวที่เหลือมากที่สุด โดยการปล่อยท่อคว่ำลงบนกระดาษผ้าเช็ดตัว แล้วให้หลอดใส่หลอด และอากาศแห้งสำหรับ 10-20 นาที แห้งเร็ว ให้หลอดที่ 37 ° C ความร้อนตัวบล็อก ดีเอ็นเอ precipitate เปลี่ยนสีขาวเมื่อแห้งResuspend เม็ดดีเอ็นเอกับ 50 μl ติ ทั้งหมดละลายเม็ดที่ โดยโซลูชัน pipetting หลายครั้งหมายเหตุ: จำนวนมากของอาร์เอ็นเอมีอยู่ในตัวอย่างดีเอ็นเอ ดังนั้น สำหรับปฏิกิริยาต่อ ๆ ไป เช่น ย่อย plasmid DNA เพิ่ม 1-5 μl (มิลลิกรัมต่อ 1 มิลลิลิตร-1) RNAase เพื่อแก้ปัญหาการย่อยอาหารจะเอาอาร์เอ็นเอ ขึ้น เพิ่ม RNAase โดยตรงไปยังโซลูชันการ resuspension ตะกอนมีความเข้มข้นสุดท้ายของ 1 mg ml-1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรีย (E. coli) วัฒนธรรมในสื่อ LB ด้วยยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมที่ 37 องศาเซลเซียสในชั่วข้ามคืน (O / N) ที่มีการสั่น สำหรับ> 10 พลาสมิดเล่ม 3 มล. การเพาะเลี้ยงเซลล์ปกติจะเป็นพอ.
โอน O / N วัฒนธรรม 1.5 มล. หลอด Eppendorf และหมุนลงเพาะเลี้ยงเซลล์ (สอง) ที่ความเร็วสูงเป็นเวลา 1 นาทีที่แปะบนโต๊ะ.
ยกเลิกใส . เพื่อเอาของเหลวอย่างสมบูรณ์โดยหลอดลงคว่ำลงบนแผ่นผ้ากระดาษไม่กี่วินาที.
เพิ่ม 100 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหา resuspension (บัฟเฟอร์ P1) ลงในหลอดแต่ละครั้งและกระแสน้ำวนที่จะสมบูรณ์ตะกอนเซลล์ resuspend
เพิ่ม 100 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาสลาย (บัฟเฟอร์ P2 ) และผสมเบา ๆ กลับหัวหลอด 5-6 ครั้ง วิธีการแก้ปัญหาได้อย่างรวดเร็วควรหันโปร่งใสและเป็นความหนืดมากขึ้นแสดงให้เห็นแบคทีเรีย
สลายได้เกิดขึ้น.
เพิ่ม 150 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหา neutralizing (บัฟเฟอร์ P3) และผสมโดย inverting หลอดหลายครั้ง ณ จุดนี้ดีเอ็นเอโครโมโซมแบคทีเรียมักจะเห็นเป็นตะกอนสีขาว.
Centrifuge หลอดที่ความเร็วสูงเป็นเวลา 10 นาที.
อย่างระมัดระวังโอนใส (พยายามที่จะไม่รบกวนตะกอนสีขาว) ที่จะติดป้าย 1.5 มล. หลอด Eppendorf ใหม่ที่มีปิเปต 1ml .
เพิ่ม 2.5-3 ปริมาณ 200 หลักฐานเอทานอลเย็น (ร้านค้าที่อุณหภูมิ -20 ° C) หลอดแต่ละและผสมโดย inverting หลอดไม่กี่ครั้ง.
สปินลงตะกอนดีเอ็นเอพลาสมิด (เม็ดโปร่งใส) ด้วยความเร็วสูงเป็นเวลา 10 นาที.
ยกเลิก ใสและลบของเหลวที่เหลือให้มากที่สุดเท่าที่เป็นไปได้โดยออกจากหลอดคว่ำลงบนแผ่นกระดาษเช็ดแล้วให้ท่อในช่องใส่หลอดและอากาศแห้ง 10-20 นาที ให้แห้งเร็วขึ้นให้หลอดที่ 37 ° C ป้องกันความร้อน ตะกอนดีเอ็นเอเป็นสีขาวเมื่อแห้ง.
Resuspend เม็ดดีเอ็นเอ 50 ไมโครลิตร TE สมบูรณ์ละลายเม็ดโดยวิธีปิเปตหลายครั้ง.
หมายเหตุ: จำนวนเงินขนาดใหญ่ของอาร์เอ็นเอที่มีอยู่ในตัวอย่างดีเอ็นเอ ดังนั้นสำหรับปฏิกิริยาที่ตามมาเช่นการย่อยดีเอ็นเอพลาสมิดเพิ่ม 1-5 ไมโครลิตร (1 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร-1) RNAase เพื่อแก้ปัญหาการย่อยอาหารจะสมบูรณ์ลบอาร์เอ็นเอ หรือเพิ่ม RNAase โดยตรงกับการแก้ปัญหา resuspension ที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 1 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร-1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เติบโตของแบคทีเรีย ( E . coli ) วัฒนธรรมในปอนด์ขนาดกลางด้วยยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมที่ 37 ° C ในชั่วข้ามคืน ( O / N ) กับสั่น สำหรับ 10 สำเนาพลาสมิด , การเพาะเลี้ยงเซลล์ 3 ml มักจะเพียงพอ
O / N เพื่อถ่ายทอดวัฒนธรรม 1.5-ml เพนดอร์ฟ หลอด และหมุนลงเซลล์เพาะเลี้ยง ( สองครั้ง ) ที่ความเร็วสูงเป็นเวลา 1 นาทีที่เหวี่ยงโต๊ะ .
ทิ้งน่าน .