3.2. Column chromatographic purification of the monoclonal human
IgGs using adsorbents derived from the immobilised 40-TerPSEA
Based on the above findings, the potential of the immobilised
pyridine-based ligands (Fig. 1) in the purification of mAbs was validated,
using 40-TerPSEA as the preferred exemplar, in packed bed
chromatographic experiments. Under the chosen volume overload
and wash conditions used in these small scale laboratory experiments,
on average the losses at the breakthrough and wash stages
accounted for between 15% and 20% of the loaded mAb content.
Obviously, with design-of-experiment (DoE) optimised experimental
conditions, these losses at the load and wash stages could be
with each adsorbent were different for the three humanised IgG
mAb samples. While the humanised IgG1 mAb showed a broader
gradient elution peak (Fig. 4A), the humanised IgG2 mAb eluted
as both a lower abundance peak at a similar gradient position followed
by a later eluting, more abundant peak (Fig. 5A). SDS-PAGE
analysis of the recovered fractions (Fig. 5B) indicated that the
humanised IgG2 mAb was predominantly found in the later eluting
fractions. Thus, under these conditions, the humanised IgG2 mAb
bound more strongly than the humanised IgG1 mAb to the immobilised
40-TerPSEA ligand, a finding consistent with the batch
adsorption studies. The chromatographic profile for the humanised
IgG4 mAb was similar to the result obtained with the humanised
IgG1 mAb with a major peak followed by a lower abundance peak
of longer retention time (Fig. 6A). The majority of IgG4 was contained
in the first peak as evident from SDS-PAGE analysis (Fig. 6B).
The binding of mAbs to this new class of immobilised ligands is
a consequence of the interplay of multiple physicochemical effects,
including electrostatic and hydrophobic interactions, typical of
mixed mode adsorbents. Moreover, these results suggest the possibility
that these ligands may have the capability to bind independently
to two (or more) sites within the IgG mAbs, a possibility
that is under current investigation. Nevertheless, changes in the
buffer composition or pH are anticipated to lead to subtle variations
in selectivity for IgG mAbs of different isotype, depending
on their structural and physical attributes. For instance, the
humanised IgG2 mAb has a lower pI value (pI 7.4) than the humanised
IgG1 or IgG4 mAbs (both with pI 8.0 respectively) [28]. When
the loading buffer is set at pH 8.0, the humanised IgG2 mAb will be
more negatively charged than the humanised IgG1 or IgG4 mAb.
These differences may influence the propensity to self-associate
and form dimers/aggregates [29] and this may account for the fact
that the humanised IgG1 or IgG4 mAbs eluted as broader peaks, yet
upon SDS-PAGE analysis under non-reducing conditions, these
eluted fractions behaved as intact IgGs, i.e. as 160 kDa proteins
together with minor, lower molecular weight species generated
from the heat-induced fragmentation of these IgGs. The generation
of such lower molecular weight mAb fragments has been as noted
previously [24] and confirmed by MALDI-TOF MS analysis [19,20].
3.2 . คอลัมน์โครมาโตกราฟีบริสุทธิ์ของโมโนโคลนอลแอนติบอดีของมนุษย์iggs โดยใช้ตัวดูดซับที่ได้จากตรึง terpsea 40ผลจากการศึกษาข้างต้น ศักยภาพของตรึงสารที่ใช้ปกติ ( รูปที่ 1 ) ในการโคลนถูกตรวจสอบแล้วใช้ 40 terpsea ตามแบบอย่างที่ต้องการ ในแน่นนอนการทดลองทางโครมาโทกราฟี ภายใต้ เลือก ปริมาณ เกินและล้างเงื่อนไขใช้ในการทดลองในห้องปฏิบัติการขนาดเล็ก ,เฉลี่ยขาดทุนที่ก้าวหน้าและซักระยะสัดส่วนระหว่าง 15% และ 20% ของโหลด ซึ่งเนื้อหาเห็นได้ชัดว่ามีการออกแบบการทดลอง ( DOE ) - ทดลองเงื่อนไขเหล่านี้และความสูญเสียในขั้นตอนซักสามารถโหลดกับแต่ละดูดซับแตกต่างกันสำหรับสาม humanised IgGตัวอย่าง เทพเจ้าแห่งไฟ ในขณะที่ humanised ( มาบพบ เช่นการไล่ระดับสี ( รูปที่ 4 ( สูงสุด ) , humanised igg2 มาบตัวอย่างเป็นทั้งลดความอุดมสมบูรณ์สูงสุดในตำแหน่งที่คล้ายกันตาม ไล่ระดับโดยภายหลัง hexane , Peak มากขึ้นมาก ( รูปที่ 43 ) เอนไซม์การวิเคราะห์หายเศษส่วน ( มะเดื่อ 5B ) พบว่าhumanised igg2 ) ส่วนใหญ่พบในช่วงต่อมา hexane คือเศษส่วน ดังนั้น ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ humanised igg2 มาบผูกพันมากขึ้นอย่างยิ่งกว่า humanised ( มาบเพื่อตรึง40 terpsea ) , การค้นหาที่สอดคล้องกับชุดการ ศึกษา รายละเอียดสำหรับ humanised โครมาโทกราฟีเล็กน้อย ซึ่งคล้ายๆ กับผลที่ได้รับกับ humanised( อิมกับจุดสูงสุดหลักตามด้วยยอดกว่ามากมายเวลาการเก็บรักษานาน ( รูปที่ 6 ) ส่วนใหญ่ของจำนวนเล็กน้อยในช่วงก่อนเห็นได้จากการวิเคราะห์เอนไซม์ ( รูปบน )ผูกพันของโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อคลาสใหม่นี้ตรึงลิแกนด์คือผลของความต่างของลักษณะทางกายภาพและทางเคมีหลายรวมทั้งปฏิสัมพันธ์ไฟฟ้าสถิตและ hydrophobic ตามแบบฉบับของดูดซับโหมดผสม นอกจากนี้ ผลการวิจัยนี้ชี้ให้เห็นความเป็นไปได้ที่ลิแกนด์เหล่านี้อาจมีความสามารถที่จะผูกอย่างอิสระสอง ( หรือมากกว่า ) เว็บไซต์ภายในแอนติบอดี IgG , ความเป็นไปได้ที่อยู่ภายใต้การสอบสวนในปัจจุบัน อย่างไรก็ตาม การเปลี่ยนแปลงในบัฟเฟอร์ pH เป็นองค์ประกอบ หรือคาดว่าจะนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงสีสันในการเลือกสรรสำหรับ IgG จำเพาะที่แตกต่างกันและขึ้นโครงสร้างและคุณสมบัติทางกายภาพของพวกเขา . สำหรับอินสแตนซ์humanised igg2 มาบมีค่า PI ต่ำ ( PI 7.4 ) กว่า humanisedเล็กน้อย ( หรือแอนติบอดี ( ทั้งปี่ 8.0 ตามลำดับ ) [ 28 ] เมื่อโหลดบัฟเฟอร์ตั้งอยู่ที่ pH 8.0 , humanised igg2 มาบจะซึ่งมีประจุลบมากขึ้นกว่า humanised เล็กน้อย ( หรือเทพเจ้าแห่งไฟความแตกต่างเหล่านี้อาจมีผลต่อความโน้มเอียงเพื่อตนเอง รองศาสตราจารย์และรูปแบบสาย / มวลรวม [ 29 ] และนี้อาจบัญชีสำหรับความจริงที่ humanised เล็กน้อย ( ซึ่งเป็นยอดเขาที่กว้างขึ้นตัวอย่างหรือ ยังเมื่อวิเคราะห์เอนไซม์ไม่ลด ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ตัวอย่างเศษส่วน ประพฤติเป็นเหมือนเดิม iggs คือเป็น 160 กิโลดาลตันโปรตีนด้วยกันกับผู้เยาว์ ลดน้ำหนัก โมเลกุลชนิดที่สร้างขึ้นจากความร้อนที่เกิดการแตกแยกของ iggs เหล่านี้ รุ่นเช่น ลดน้ำหนัก โมเลกุล ซึ่งชิ้นส่วนที่ถูกระบุไว้ก่อนหน้านี้ [ 24 ] และได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์ maldi-tof MS [ 19,20 ]
การแปล กรุณารอสักครู่..