Strand Displacement Amplification (

Strand Displacement Amplification (SDA) Is an isothermal, in vitro nucleic acid amplification technique based upon the ability of Hindi to nick the unmodified strand of a hemiphosphorothioate form of its recognition site, and the ability of exonuclease deficient klenow (exo− klenow) to extend the 3'-end at the nick and displace the downstream DNA strand. Exponential amplification results from coupling sense and antisense reactions in which strands displaced from a sense reaction serve as target for an antisense reaction and vice versa. In the original design (G. T. Walker, M. C. Little, J. G. Nadeau and D. D. Shank (1992) Proc. Natl. Acad. Scl 89, 392 – 396), the target DNA sample is first cleaved with a restriction enzyme(s) in order to generate a double-stranded target fragment with defined 5'- and 3'-ends that can then undergo SDA. Although effective, target generation by restriction enzyme cleavage presents a number of practical limitations. We report a new target generation scheme that eliminates the requirement for restriction enzyme cleavage of the target sample prior to amplification. The method exploits the strand displacement activity of exo− klenow to generate target DNA copies with defined 5'- and 3'-ends. The new target generation process occurs at a single temperature (after initial heat denaturation of the double-stranded DNA). The target copies generated by this process are then amplified directly by SDA. The new protocol improves overall amplification efficiency. Amplification efficiency is also enhanced by improved reaction conditions that reduce nonspecific binding of SDA primers. Greater than 107-fold amplification of a genomic sequence from Mycobacterium tuberculosis is achieved in 2 hours at 37° C even in the presence of as much as 10 μg of human DNA per 50 μL reaction. The new target generation scheme can also be applied to techniques separate from SDA as a means of conveniently producing double-stranded fragments with 5'- and 3'-sequences modified as desired.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ขยายย้ายสแตรนด์ (SDA) เป็นเทคนิคการขยายกรดนิวคลีอิก isothermal การเพาะเลี้ยงตามความสามารถของภาษาฮินดีกับ nick สแตรนด์ unmodified ของ hemiphosphorothioate รูปแบบของเว็บไซต์ความรู้ และความสามารถของ exonuclease ขาดสาร klenow (exo− klenow) การขยาย 3 สิ้นสุดที่นิคเลื่อนดีเอ็นเอปลายน้ำสแตรน เนนขยายผลจาก coupling ปฏิกิริยาความรู้สึกและ antisense strands ซึ่งพลัดถิ่นจากความรู้สึกปฏิกิริยาใช้เป็นเป้าหมาย ในการปฏิกิริยา antisense และในทางกลับกัน ในการออกแบบต้นฉบับ (G. ต. Walker, M. C. น้อย J. G. Nadeau และ D. D. จำพวก (1992) Proc. Natl. Acad. Scl 89, 392-396), ก่อนจะแหวกกับ restriction enzyme(s) เป็นตัวอย่างดีเอ็นเอเป้าหมายเพื่อสร้างส่วนขนสองเป้าหมาย มีกำหนด 5'-3'-สิ้นสุดที่สามารถรับ SDA และ แม้มีประสิทธิภาพ การสร้างเป้าหมาย โดยเอนไซม์จำกัดปริแสดงจำนวนจำกัดปฏิบัติ เรารายงานใหม่โครงร่างการสร้างเป้าหมายที่กำจัดความต้องการสำหรับเอนไซม์จำกัดปริของตัวอย่างเป้าหมายก่อนที่จะขยาย ประโยชน์วิธีการกิจกรรมแทนสาระของ klenow exo− เพื่อสร้างดีเอ็นเอเป้าหมายที่คัดลอกมีกำหนด 5'-3' ปลายและ การสร้างเป้าหมายใหม่กระบวนการเกิดที่อุณหภูมิหนึ่ง (หลังจากเริ่มร้อน denaturation เอ็นขนคู่) สำเนาเป้าหมายที่สร้างขึ้น โดยกระบวนการนี้โดยทั่วไปแล้วขยายโดยตรง โดย SDA โพรโทคอลใหม่ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการขยายโดยรวม นอกจากนี้ยังเพิ่มการขยายประสิทธิภาพ โดยเงื่อนไขปรับปรุงปฏิกิริยาที่ลดรวมเจาะจงของไพรเมอร์ SDA ขยาย 107-fold ลำดับ genomic จากมัยโคแบคทีเรียวัณโรคมากกว่าสามารถทำได้ใน 2 ชั่วโมงที่ 37° C แม้ในต่อหน้าของ μg 10 เท่าของดีเอ็นเอมนุษย์ต่อปฏิกิริยา μL 50 การสร้างเป้าหมายใหม่ที่ยังสามารถใช้โครงร่างกับเทคนิคแยกจาก SDA ของการบริการผลิตชิ้นส่วนที่ควั่นคู่กับ 5'- และ 3 ลำดับที่ปรับเปลี่ยนตามต้องการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Strand แทนที่ขยาย (SDA) เป็น isothermal ในหลอดทดลองกรดนิวคลีอิกเทคนิคการขยายขึ้นอยู่กับความสามารถของภาษาฮินดีที่จะกรงขังสาระไม่มีการแก้ไขของรูปแบบ hemiphosphorothioate ของเว็บไซต์การรับรู้และความสามารถของ exonuclease klenow ขาด (exo- klenow) เพื่อขยาย 3'-สิ้นสุดที่กรงขังและแทนที่ดีเอ็นเอปลายน้ำ ผลการใช้เครื่องขยายเสียงชี้แจงจา​​กการมีเพศสัมพันธ์และความรู้สึกแอนตี้เซนส์ปฏิกิริยาที่เส้นย้ายออกจากปฏิกิริยาความรู้สึกเป็นเป้าหมายของการเกิดปฏิกิริยาแอนตี้เซนส์และในทางกลับกัน ในการออกแบบเดิม (GT วอล์คเกอร์ MC เล็ก ๆ น้อย ๆ JG Nadeau และ DD แกน (1992) พรอค Natl Acad Scl 89, 392... - 396) ตัวอย่างดีเอ็นเอเป้าหมายผ่าครั้งแรกกับเอนไซม์ จำกัด (s) ในการที่จะ สร้างส่วนเกลียวคู่กับเป้าหมายที่กำหนด 5'- และ 3'ปลายที่จะสามารถได้รับการ SDA แม้ว่าจะมีประสิทธิภาพรุ่นเป้าหมายโดยข้อ จำกัด เอนไซม์ความแตกแยกแสดงจำนวนของข้อ จำกัด ในทางปฏิบัติ เรารายงานโครงการสร้างเป้าหมายใหม่ที่ช่วยขจัดความจำเป็นสำหรับความแตกแยกเอนไซม์ข้อ จำกัด ของกลุ่มตัวอย่างเป้าหมายก่อนที่จะมีการขยาย วิธีการใช้ประโยชน์จากกิจกรรมการกำจัดเส้น klenow exo- เพื่อสร้างสำเนาดีเอ็นเอเป้าหมายที่กำหนด 5'- และ 3'ปลาย กระบวนการสร้างเป้าหมายใหม่เกิดขึ้นที่อุณหภูมิเดียว (หลังจากที่สูญเสียสภาพธรรมชาติความร้อนเริ่มต้นของดีเอ็นเอเกลียวคู่) สำเนาเป้าหมายที่เกิดจากกระบวนการนี​​้จะขยายแล้วโดยตรงจาก SDA โปรโตคอลใหม่ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพโดยรวมของเครื่องขยายเสียง ประสิทธิภาพเครื่องขยายเสียงจะเพิ่มขึ้นโดยเงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาที่ดีขึ้นเพื่อลดความผูกพันของเชิญชมไพร SDA ขยายมากกว่า 107 เท่าของลำดับจีโนมจากเชื้อวัณโรคจะประสบความสำเร็จใน 2 ชั่วโมงที่ 37 ° C แม้ในการปรากฏตัวของเท่า 10 ไมโครกรัมของดีเอ็นเอของมนุษย์ต่อปฏิกิริยา 50 ไมโครลิตร โครงการเป้าหมายรุ่นใหม่นี้ยังสามารถนำไปใช้เทคนิคการแยกจาก SDA เป็นวิธีการที่สะดวกการผลิตชิ้นส่วนเกลียวคู่กับ 5'- และ 3'-ลำดับการปรับเปลี่ยนได้ตามความต้องการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( สาระ ) ( SDA ) เป็นอุณหภูมิในหลอดทดลองกรดนิวคลีอิกขยายเทคนิคขึ้นอยู่กับความสามารถของภาษาฮินดี Nick เส้นแปรของ hemiphosphorothioate รูปแบบของเว็บไซต์การยอมรับ และความสามารถในการ klenow เอกโซนิวคลีเอส ( exo − klenow ) เพื่อขยาย 3 - จบที่นิคและแทนที่ดีเอ็นเอเกลียวท้าย .เอกซ์โพเนนเชียล ( ผลจากปฏิกิริยาความรู้สึก coupling และ antisense ที่เส้นพลัดถิ่นจากปฏิกิริยาโต้ตอบเป็นเป้าหมายสำหรับ antisense ปฏิกิริยาและในทางกลับกัน ในการออกแบบเดิม ( G . T . วอล์คเกอร์ , เอ็มซี. เจ. จี. nadeau เล็กน้อย และก้าน ( 1992 ) D . D proc . NATL . ราช . SCL 89 , 392 ( 396 )ตัวอย่างแรกของ DNA เป้าหมายด้วยเอนไซม์ ( s ) เพื่อที่จะสร้างคู่กับกำหนดเป้าหมายทำให้ติด 5 ' และ 3 ' - สิ้นสุดที่สามารถผ่าน SDA ถึงแม้ว่าประสิทธิภาพเป้าหมายสร้างโดยเอนไซม์ การแสดงจำนวนของข้อ จำกัด ในทางปฏิบัติเรารายงานเป้าหมายใหม่รุ่นของขจัดความต้องการสำหรับเอนไซม์ ความแตกแยกของตัวอย่างเป้าหมายก่อนที่จะขยาย . วิธีการหาประโยชน์เส้นการเคลื่อนที่กิจกรรมของ exo − klenow เพื่อสร้างเป้าหมายดีเอ็นเอสำเนากับนิยาม 5 ' และ 3 ' - จบเป้าหมายใหม่รุ่นกระบวนการเกิดขึ้นที่อุณหภูมิเดียว ( หลังจากความร้อน ( ครั้งแรกของคู่เกลียวดีเอ็นเอ ) เป้าหมายสำเนาที่สร้างขึ้นโดยกระบวนการนี้จะขยายโดยตรงโดย SDA ระบบใหม่ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการสื่อสารโดยรวม ยังได้ปรับปรุง โดยการปรับปรุงประสิทธิภาพการเพิ่มปฏิกิริยาเงื่อนไขที่ลดการติดเชื้อผูกพันของ SDA รองพื้นมากกว่า 107 พับแบบลำดับจีโนมจากเชื้อวัณโรคได้ภายใน 2 ชั่วโมง ที่ 37 ° C ในการปรากฏตัวของมากที่สุดเท่าที่ 10 μกรัมของดีเอ็นเอของมนุษย์ต่อ 50 μ L ปฏิกิริยาได้ เป้าหมายใหม่รุ่นนี้ยังสามารถใช้เทคนิคการแยกจาก sda เป็นวิธีการสะดวกการผลิตคู่ติดเศษ 5 ' - 3 ' - ลำดับการแก้ไขตามที่ต้องการ