After 15 min, 45
l of each sample

After 15 min, 45
l of each sample was nitrocellulose- filtered and washed with 500
l ice-cold polymix buffer. All operations were done in a cold room (4°C). The amount of EF-G•[3H]-GDP retained on the filter was quantified by scintillation counting [9]. For the experiment shown in Figure 2b, 5
M EF-G was incubated with 45
M [3H]-GDP and unlabeled GTP (0-2.5 mM) or GDP (0-1.2 mM). Other conditions were the same as in Figure 2a. For the experiment shown in Figure 2d, 2
M EF-G, 92 nM 70S ribosomes with 1
M Met-Phe-Thr-Ile mRNA or 92 nM preTerm complexes with 0.4 mM puromycin were incubated with 1
M [3H]-GDPNP in the presence of cold GDP (0-2 mM) for 7 min at 37°C in 50
l. Then, 45
l of each sample was nitrocellulose-filtered. For the experiment shown in Figure 2e, 2
M EF-G, 92 nM 70S ribosomes with 1
M Met-Phe-Thr-Ile mRNA or preTerm complexes with 0.4 mM puromycin were pre-incubated with 1
M [3H]-GDPNP for 4 min at 37°C and then 2 mM GDP (final concentration) was added. After GDP addition 45
l aliquots were nitrocellulose-filtered. For Figure 2f, EF-G was either incubated for 4 min at 37°C with preTerm complexes, puromycin and [3H]-GDPNP and then buffer or RF2 was added, or alternatively, [3H]-GDPNP was added to EF-G pre-incubated with preTerm complexes, puromycin and RF2. Then, 50
l aliquots were nitrocellu- lose-filtered to determine the amount of EF-G•[3H]-GDPNP bound to the postTerm complex. The final concentrations of components in the mixtures were: 92 nM preTerm, 0.4 mM puromycin, 2
M EF-G, 1
M RF2 and 1
M [3H]-GDPNP.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

หลังจาก 15 นาที, 45? ลิตรของกลุ่มตัวอย่างแต่ละคนถูก nitrocellulose- กรองและล้างด้วย 500? L บัฟเฟอร์ polymix เย็น การดำเนินงานทั้งหมดได้ทำในห้องเย็น (4 ° C) ปริมาณของ EF-G • [3H] -GDP เก็บไว้ในตัวกรองที่ได้รับการวัดโดยการนับประกาย [9] สำหรับการทดสอบแสดงในรูปที่ 2b, 5? M EF-G ถูกบ่มกับ 45? M [3H] -GDP และไม่มีป้ายกำกับฉี่ (0-2.5 มิลลิ) หรือจีดีพี (0-1.2 มิลลิ) เงื่อนไขอื่น ๆ เป็นคนเดียวกับในรูปที่ 2a ? สำหรับการทดสอบแสดงในรูปที่ 2 มิติ, 2 M EF-G, 92 นาโนเมตร 70S ไรโบโซม 1 M เมทเพ-Thr-Ile mRNA หรือ 92 นาโนเมตรคอมเพล็กซ์คลอดก่อนกำหนดด้วย 0.4 มิลลิ puromycin ถูกบ่ม 1 M [3H] - GDPNP ในการปรากฏตัวของ GDP เย็น (0-2 มิลลิ) เป็นเวลา 7 นาทีที่ 37 ° C ใน 50 ลิตร จากนั้น 45? ลิตรของกลุ่มตัวอย่างแต่ละคนถูก nitrocellulose กรอง ? สำหรับการทดสอบที่แสดงในรูป 2e, 2 M EF-G, 92 นาโนเมตร 70S ไรโบโซม 1 M เมทเพ-Thr-Ile mRNA หรือคอมเพล็กซ์คลอดก่อนกำหนดด้วย 0.4 มิลลิ puromycin ถูกก่อนบ่มกับ 1 M [3H] - GDPNP 4 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและจากนั้น 2 มิลลิ GDP (ความเข้มข้นสุดท้าย) ถูกเพิ่มเข้ามา หลังจากนอกจากนี้จีดีพี 45? aliquots ลิตรถูก nitrocellulose กรอง สำหรับ 2f รูป, EF-G ถูกบ่มทั้ง 4 นาทีที่ 37 ° C ที่มีคอมเพล็กซ์คลอดก่อนกำหนด, puromycin และ [3H] -GDPNP แล้วบัฟเฟอร์หรือ RF2 ถูกเพิ่มเข้ามาหรืออีกทางเลือกหนึ่ง [3H] -GDPNP ถูกบันทึกอยู่ใน EF-G ก่อนบ่มกับคอมเพล็กซ์คลอดก่อนกำหนด, puromycin และ RF2 จากนั้น 50 ส่วนลงตัวลิตรเป็น nitrocellu- แพ้กรองเพื่อตรวจสอบปริมาณของ EF-G • [3H] -GDPNP ผูกไว้กับที่ซับซ้อน postterm ความเข้มข้นสุดท้ายขององค์ประกอบในสารผสมคือ? 92 นาโนเมตรที่คลอดก่อนกำหนด, 0.4 มิลลิ puromycin, 2 M EF-G, M 1 RF2 และ 1 M [3H] -GDPNP

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

หลังจาก 15 นาที , 45
L ของแต่ละตัวอย่างไนโตร - กรองและล้างด้วย 500
ผมเย็น polymix บัฟเฟอร์ งานทั้งหมดทำในห้องเย็น ( 4 ° C ) จำนวน ef-g - [ 3 ] - GDP ยังคงอยู่ในกรองมี quantified โดยแสงนับ [ 9 ] สำหรับการทดลองที่แสดงในรูปที่ 2B , 5
M ef-g ถูกบ่มกับ 45
M [ 3 ] - GDP และใกล้เคียง GTP ( 0-2.5 มม. ) หรือ GDP ( 0-1.2 มิลลิเมตร )เงื่อนไขอื่น ๆเป็นเหมือนในรูปที่ 2A . สำหรับการทดลองที่แสดงในรูปที่ 2 , 2
M ef-g , NM 70s ไรโบโซม 92 1
M เจอเพ Thr mRNA ในหรือ 92 nm คลอดก่อนกำหนดเชิงซ้อนที่มี puromycin 0.4 มิลลิถูกบ่มด้วย 1
M [ 3 ] - gdpnp ในการแสดงตนของ GDP ( 0-2 เย็น มม. ) 7 นาทีที่ 37 ° C ใน 50
L แล้ว 45
L ของแต่ละตัวอย่างเป็นไนโตรเซลลูโลสกรอง สำหรับการทดลองที่แสดงในรูปที่ 2 ,2
M ef-g , NM 70s ไรโบโซม 92 1
M เจอเพ Thr mRNA ในหรือสารประกอบเชิงซ้อนกับ puromycin 0.4 มม. เป็นทารกคลอดก่อนกำหนดก่อนแยก 1
M [ 3 ] - gdpnp 4 นาทีที่ 37 ° C แล้ว GDP 2 มม. ( ความเข้มข้นสุดท้าย ) ถูกเพิ่มเข้ามา หลังจากเพิ่ม GDP 45
ผมเฉยๆเป็นไนโตรเซลลูโลสกรอง สำหรับรูปห้อง 2F ef-g , ถูกบ่มเป็นเวลา 4 นาทีที่ 37 ° C เชิงซ้อน 20puromycin และ [ 3 ] - gdpnp แล้วบัฟเฟอร์หรือ rf2 เพิ่ม , หรือมิฉะนั้น , [ 3 ] - gdpnp ถูกเพิ่ม ef-g ก่อนแยกสารประกอบเชิงซ้อนและ 20 puromycin rf2 . แล้ว 50
ผมเฉยๆ คือ nitrocellu - เสียกรองเพื่อตรวจสอบยอดเงิน ef-g - [ 3 ] - gdpnp ผูกที่ซับซ้อนยัง . ส่วนสุดท้ายขององค์ประกอบในส่วนผสม : 92 nm 20 puromycin 0.4 มิลลิเมตร ef-g 2
,1
M rf2 1
M [ 3 ] - gdpnp .