2.4 Determination of total protein

2.4 Determination of total protein concentration
When comparing the amount of protein from samples run in different lanes within the same
gel or between gels, it is very important that all the lanes have been loaded with the same total
amount of protein. A two-fold increase in the expression level of a specific protein in one lane
will be completely masked if a comparative lane contains twice the amount of total protein (or
will even appear to be reduced in expression if the comparitor lane contains more than twice
the amount).
Several spectrophotometric methods are routinely used to determine the concentration of
protein in a solution (3). These include measurement of the intrinsic ultraviolet (UV) absorbance
of the protein as well as methods based on a protein-dependent color change, such as the
classic, copper-based Lowry assay (4), the Smith copper/bicinchoninic assay (BCA) (5) and the
Bradford dye assay (6). Although widely used, none of the these procedures are particularly
convenient.
UV absorbance, for example, requires access to a pure protein of a known extinction
coefficient, in a solution free of interfering (UV absorbing) substances. The approximate
concentration of a protein in solution (assuming the use of a cuvette with a path length of 1 cm)
can be estimated by using either of the following equations;
A280 = 1 A1
(mL/cm mg) × [Conc.] (mg/mL) × 1 (cm)
A205 = 31 A1
(mL/cm mg) × [Conc.] (mg/mL) × 1 (cm)
1 A280 represents light absorbed by proteins at 280 nm, primarily a result of the presence of ringed amino acids tyrosine and
tryptophan. A205 represents light absorbed by proteins at 205 nm, primarily the result of peptide bonds between amino
acids.
Different proteins, however, have widely different extinction coefficients at both 280 and
205 nm, and concentration estimates obtained in this way are at best a rough estimate. UV
absorbance requires that the protein solution is free of other UV-absorbing substances, such
as nucleic acids, and that the measurements are carried out using a quartz cuvette.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 กำหนดความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดเมื่อเปรียบเทียบปริมาณโปรตีนจากตัวอย่างที่ใช้ในถนนหนทางต่าง ๆ ภายในเหมือนกันเจลอาบน้ำ หรือระหว่างเจ จำเป็นอย่างยิ่งที่ได้มีการโหลดถนนหนทางทั้งหมดรวมกันจำนวนโปรตีน สองพับเพิ่มขึ้นในระดับโปรตีนเฉพาะในเลนหนึ่งนิพจน์จะทั้งหมดสวมหน้ากากถ้าเลนเปรียบเทียบประกอบด้วยสองจำนวนโปรตีนรวม (หรือแม้จะปรากฏจะลดลงในนิพจน์เลน comparitor ประกอบด้วยมากกว่าสองครั้งยอด)หลายวิธี spectrophotometric เป็นประจำจะใช้เพื่อกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนในการแก้ปัญหา (3) ได้แก่การวัด absorbance (UV) รังสีอัลตราไวโอเลต intrinsicโปรตีนรวมทั้งวิธีใช้การเปลี่ยนสีขึ้นอยู่กับโปรตีน เช่นการคลาสสิก ใช้ทองแดง Lowry วิเคราะห์ (4) การวิเคราะห์ทอง แดง/bicinchoninic สมิธ (BCA) (5) และวิเคราะห์การย้อมแบรดฟอร์ด (6) แม้ว่าใช้ การเหล่านี้ไม่มีขั้นตอนโดยเฉพาะอย่างยิ่งสะดวกUV absorbance ตัวอย่าง ต้องถึงโปรตีนบริสุทธิ์สูญพันธุ์ที่รู้จักกันสัมประสิทธิ์ ในโซลูชั่นฟรีรบกวนสาร (UV ดูดซับ) โดยประมาณการความเข้มข้นของโปรตีนในโซลูชัน (สมมติว่าใช้ cuvette ที่ มีความยาว 1 ซ.ม.เส้นทาง)สามารถประเมินได้ โดยใช้สมการต่อไปนี้A280 = 1 A1 ฟิลด์ (mL/cm มิลลิกรัม) [Conc.] (mg/mL) × 1 (ซม.)A205 = 31 A1 ฟิลด์ (mL/cm มิลลิกรัม) [Conc.] (mg/mL) × 1 (ซม.)1 A280 แทนไฟดูดซึม โดยโปรตีนที่ 280 nm หลักผลลัพธ์ของสถานะของช่วยกรดอะมิโน tyrosine และทริปโตเฟน A205 แทนไฟดูดซึม โดยโปรตีนที่ 205 nm ผลลัพธ์หลักของเพปไทด์พันธบัตรระหว่างอะมิโนกรดโปรตีนแตกต่างกัน อย่างไรก็ตาม มีสัมประสิทธิ์สูญพันธุ์แตกต่างกันอย่างกว้างขวางทั้ง 280 และ205 nm และประเมินความเข้มข้นที่ได้รับในวิธีนี้ได้ดีที่สุดการประเมินคร่าว ๆ รังสียูวีabsorbance ต้องว่า โปรตีนเป็นสารอื่น ๆ ดูด UV ฟรีดังกล่าวกรดนิวคลีอิก และที่ วัดดำเนินการใช้ cuvette ควอตซ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมด
เมื่อเปรียบเทียบปริมาณของโปรตีนจากตัวอย่างทำงานในช่องทางที่แตกต่างกันภายในเดียวกัน
เจลหรือระหว่างเจลมันเป็นสิ่งสำคัญมากที่เลนทั้งหมดได้รับการเต็มไปด้วยทั้งหมดเดียวกัน
ปริมาณของโปรตีน เพิ่มขึ้นสองเท่าในระดับการแสดงออกของโปรตีนที่เฉพาะเจาะจงในหนึ่งช่องทางที่
จะได้รับการสวมหน้ากากสมบูรณ์หากเปรียบเทียบเลนมีสองเท่าของโปรตีนทั้งหมด (หรือ
แม้กระทั่งจะปรากฏขึ้นที่จะลดลงในการแสดงออกถ้าเลนและ comparator มีมากขึ้นกว่าสองเท่า
จำนวน).
วิธีสเปกหลายใช้เป็นประจำเพื่อตรวจสอบความเข้มข้นของ
โปรตีนในสารละลาย (3) เหล่านี้รวมถึงการวัดรังสีอัลตราไวโอเลตที่แท้จริง (UV) การดูดกลืน
โปรตีนเช่นเดียวกับวิธีขึ้นอยู่กับการเปลี่ยนแปลงของสีขึ้นอยู่กับโปรตีนเช่น
คลาสสิก, ทองแดงตามการทดสอบโลว์รีย์ (4), ทองแดงสมิ ธ / ทดสอบ bicinchoninic (BCA) (5) และ
การทดสอบสีย้อม Bradford (6) แม้ว่าจะใช้กันอย่างแพร่หลายไม่มีขั้นตอนเหล่านี้โดยเฉพาะอย่างยิ่งมีความ
สะดวกสบาย.
การดูดกลืนรังสียูวีเช่นต้องเข้าถึงโปรตีนบริสุทธิ์ของการสูญเสียที่รู้จักกัน
ค่าสัมประสิทธิ์ในการแก้ปัญหาฟรีรบกวน (UV ดูดซับ) สาร ประมาณ
ความเข้มข้นของโปรตีนในสารละลาย (สมมติว่าใช้ cuvette ที่มีความยาวเส้นทาง 1 ซม)
สามารถประมาณโดยใช้สมการดังต่อไปนี้
A280 = 1 A1
[. แดงอม] (มิลลิลิตร / ซม. มก.) × ( มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) × 1 (ซม.)
A205 = 31 A1
(มิลลิลิตร / ซม. มก.) × [แดงอม.] (มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) × 1 (ซม.)
1 A280 แสดงถึงไฟดูดซึมโดยโปรตีนที่ 280 นาโนเมตรซึ่งส่วนใหญ่เป็นผลมาจากการ การปรากฏตัวของกรดอะมิโนซายน์ล้อมรอบและ
โพรไบโอ A205 แสดงถึงไฟดูดซึมโดยโปรตีนที่ 205 นาโนเมตรซึ่งส่วนใหญ่เป็นผลมาจากการออกพันธบัตรเปปไทด์ระหว่างอะมิโน
กรด.
โปรตีนที่แตกต่างกัน แต่มีค่าสัมประสิทธิ์การสูญเสียที่แตกต่างกันอย่างกว้างขวางทั้ง 280 และ
205 นาโนเมตรและประมาณการความเข้มข้นที่ได้รับในลักษณะนี้เป็นที่ที่ดีที่สุดประมาณการคร่าวๆ . UV
ดูดกลืนแสงที่ต้องใช้วิธีการแก้ปัญหาที่มีโปรตีนเป็นอิสระจากสารป้องกันรังสียูวีอื่น ๆ เช่น
กรดนิวคลีอิกและที่วัดจะดำเนินการโดยใช้ cuvette ควอตซ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 วิเคราะห์ปริมาณความเข้มข้นของโปรตีน
เมื่อเปรียบเทียบปริมาณโปรตีนจากตัวอย่างวิ่งในเลนต่างๆ ในเจลเหมือนกัน
หรือระหว่างเจล , มันเป็นสิ่งสำคัญมากที่เลนทั้งหมดจะถูกโหลด ด้วยยอดรวม
เดียวกันของโปรตีน เป็นสองเท่าเพิ่มการแสดงออกของโปรตีนที่เฉพาะเจาะจงในระดับหนึ่งเลน
จะปกปิดถ้าเลนเปรียบเทียบมีสองเท่าของโปรตีนรวม ( หรือ
จะปรากฏที่จะลดลงในการแสดงออกถ้า comparitor เลนมีมากกว่าสองครั้ง
จํานวน )
) วิธีการตรวจที่ใช้ในการตรวจสอบความเข้มข้นของโปรตีนในสารละลาย
( 3 ) เหล่านี้รวมถึงการวัดการดูดกลืนแสงอัลตราไวโอเลต ( UV )
ภายในของโปรตีนรวมทั้งวิธีการขึ้นอยู่กับโปรตีนขึ้นอยู่กับสีเปลี่ยนไป เช่น
คลาสสิกทองแดงโดยวิธีโลว์รีย์ ( 4 ) , Smith ทองแดง / bicinchoninic assay ( BCA ) ( 5 ) และ ( 6 ) 3
แบรดฟอร์ดย้อม . แม้ว่าการใช้กันอย่างแพร่หลาย ไม่มีของเหล่านี้ขั้นตอนโดยเฉพาะอย่างยิ่ง

ค่าการดูดกลืนแสงยูวี สะดวก ตัวอย่าง ต้องการเข้าถึงโปรตีนบริสุทธิ์ที่เรียกว่าการสูญพันธุ์
< ,ในโซลูชั่นฟรีรบกวน ( ยูวีดูดซับ ) สาร ความเข้มข้นของโปรตีนในสารละลายประมาณ
( สมมติว่าใช้ของคิวเวตต์กับเส้นทางยาว 1 ซม. )
สามารถประเมินโดยใช้อย่างใดอย่างหนึ่งของสมการต่อไปนี้ ;
a280 = 1 A1
( ml / ซม. มก. ) × [ เข้มข้น ] ( มิลลิกรัม / มิลลิลิตร ) × 1
( ซม. ) a205 = 31 A1
( ml / ซม. มก. ) × [ เข้มข้น ] ( มิลลิกรัม / มิลลิลิตร ) × 1 ( ซม. )
1 a280 เป็นโปรตีนที่ดูดซึมแสง 280 นาโนเมตรเป็นหลักผลจากการปรากฏตัวของกรดอะมิโนทริปโตเฟนและไทโรซีนแห่ง
. เป็นโปรตีนที่ดูดซึมแสง a205 205 นาโนเมตรเป็นหลักผลของกรดอะมิโนเปปไทด์พันธบัตรระหว่าง
.
โปรตีนที่แตกต่างกัน อย่างไรก็ตาม ได้ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ที่แตกต่างกันอย่างกว้างขวางทั้ง 280 และ
205 นาโนเมตร และสมาธิได้ในลักษณะนี้เป็นประมาณการที่ดีที่สุดหยาบประมาณ ยูวี
นต้องมีโปรตีนที่โซลูชั่นฟรียูวีดูดซับสารอื่น ๆเช่น
เป็นกรดนิวคลีอิก และวัดการใช้ควอทซ์คิวเวตต์ .