Those PCR products yielding a singl

Those PCR products yielding a single, bright amplification band were prepared for cycle sequencing by cleaning the PCR product using an ExoSAP-IT™ kit (USB Corporation). We used 7 ll of PCR product, 2 ll of ExoSAP solution (0.1 ll exonuclease at a stock concentration of 1 U/ll and 1.9 ll of SAP buffer at a stock concentration of 20 U/ll) and 1 ll of 10 SAP buffer. Cleanup reactions involved incubating this mixture at 37 C for 60 min followed by heating to 80 C for 15 min to denature the exonuclease and phosphatase enzymes. Three to five microliters of the purified PCR product were then used as a template for cycle sequencing of the entire amplicon in overlapping heavy and light strand fragments of 700 base pairs using ABI BigDye™ 3.1 Terminator sequencing chemistry. Sequencing reactions were performed in a total volume of 10 ll containing 1 ll of Big Dye™, reaction mix, 1.5 ll of 5 Big-Dye™ reaction buffer, 3.3 pmol of a particular sequencing primer,1–4 ll of ExoSAP-treated template (depending on the quality of the PCR product), and water up to a total volume of 10 ll. The cycle sequencing reaction consisted of 25 cycles of denaturing at 96C for 10 s, primer annealing at 50C for 5 s, and extension at 60C for
4 min. Cycle-sequencing products were purified via ethanol precipitation and re-suspended in 10 ll of Hi-Di formamide and then separated and visualized via capillary electrophoresis on an ABI
3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems). Raw sequencing traces were imported into Sequencher 3.1 (Gene Codes Corporation) and edited to trim low quality base calls from flanking regions.
All sequences were visually checked for miscalls due to either bad base spacing or over-fluorescence of particular dye nucleotides and were then assembled into locus specific contigs using the software Sequencher 3.1 (Gene Codes Corporation). As a check against
possible inadvertent inclusion of nuclear mitochondrial pseudogene (or ‘‘numt’’) sequences instead of true mtDNA sequences in our dataset, we confirmed that our initial long-range amplifications yielded a single PCR band of expected size and that within each coding region, all sequences were free of frame shift errors and unexpected termination codons. We also confirmed that no sequences yielded unexpected phylogenetic placement in locusspecific
or overall phylogenetic analyses.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ผู้ผลิตภัณฑ์ PCR ยอมเดียวขยายวงสดใสกำลังเตรียมพร้อมสำหรับการจัดลำดับวงจรโดยการทำความสะอาดผลิตภัณฑ์ PCR โดยใช้ชุด ExoSAP ไอที™ (USB คอร์ปอเรชั่น) เราใช้ 7 LL ของผลิตภัณฑ์ PCR 2 LL ของการแก้ปัญหา ExoSAP (0.1 LL exonuclease หุ้นที่มีความเข้มข้น 1 U / LL LL และ 1.9 ของบัฟเฟอร์ SAP ที่มีความเข้มข้นหุ้น 20 U / LL) และ 1 LL 10? SAP บัฟเฟอร์ ปฏิกิริยาการล้างข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับการบ่มส่วนผสมนี้ที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 60 นาทีตามด้วยความร้อนถึง 80 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีที่จะทำให้ผิดลักษณะเดิม exonuclease และเอนไซม์ phosphatase สามถึงห้า microliters ของผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์แล้วถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบสำหรับการจัดลำดับวงจรของ amplicon ทั้งหมดในที่ทับซ้อนกันหนักและเบาชิ้นส่วนของสาระ? 700 คู่โดยใช้ฐาน ABI BigDye ™ 3.1 Terminator เคมีลำดับ ปฏิกิริยาลำดับได้ดำเนินการในปริมาณรวมของ 10 LL LL มี 1 บิ๊ก™ย้อมผสมปฏิกิริยา 1.5 LL 5? บิ๊กย้อม™บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 3.3 pmol ของไพรเมอร์ลำดับโดยเฉพาะอย่างยิ่ง 1-4 LL แม่แบบ ExoSAP รับการรักษา (ขึ้นอยู่กับคุณภาพของผลิตภัณฑ์ PCR) และน้ำได้ถึงปริมาณรวม 10 LL ปฏิกิริยาลำดับวงจรประกอบด้วย 25 รอบของ denaturing ที่ 96 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 วินาที, หลอมไพรเมอร์ที่ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาทีและการขยายที่ 60? C เป็นเวลา
4 นาที ผลิตภัณฑ์วงจรลำดับบริสุทธิ์ผ่านการตกตะกอนและเอทานอลใหม่ที่ลอยอยู่ใน 10 ของ LL formamide Hi-Di และแยกออกจากกันแล้วและมองเห็นผ่านทางอิเล็กฝอยบน ABI
3730 วิเคราะห์ดีเอ็นเอ (Applied Biosystems) ร่องรอยลำดับดิบที่ถูกนำเข้ามาใน SEQUENCHER 3.1 (ยีนรหัสคอร์ปอเรชั่น) และแก้ไขเพื่อตัดสายฐานที่มีคุณภาพต่ำจากภูมิภาคขนาบ.
ลำดับทั้งหมดได้รับการตรวจสอบทางสายตาสำหรับ miscalls เนื่องจากทั้งระยะห่างฐานที่ไม่ดีหรือมากกว่าการเรืองแสงของนิวคลีโอสีย้อมโดยเฉพาะอย่างยิ่งและได้รับการประกอบแล้ว เข้า contigs เฉพาะสถานที่ใช้ซอฟต์แวร์ SEQUENCHER 3.1 (ยีนคอร์ปอเรชั่นรหัส) ขณะที่การตรวจสอบกับการรวมโดยไม่ได้ตั้งใจเป็นไปได้ของ pseudogene ยลนิวเคลียร์ (หรือ '' numt '') ลำดับแทนลำดับ mtDNA จริงในชุดของเราเรายืนยันว่าในระยะยาวของเราเริ่มต้นขยายเสียงให้ผลเป็นวง PCR เดียวของขนาดที่คาดหวังและว่าในแต่ละ ภูมิภาคเข้ารหัสลำดับทุกคนปราศจากข้อผิดพลาดการเปลี่ยนแปลงกรอบและการเลิกจ้างที่ไม่คาดคิด codons
นอกจากนี้เรายังยืนยันว่าไม่มีลำดับผลการจัดวางสายวิวัฒนาการที่ไม่คาดคิดใน locusspecific
หรือการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการโดยรวม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผู้ซึ่งให้ผลผลิตผลิตภัณฑ์เดียว วงดนตรีแบบสดใส เตรียมสำหรับการติดตามวงจรโดยการทำความสะอาดผลิตภัณฑ์ PCR โดยใช้ exosap มัน™ Kit ( USB Corporation ) เราใช้ 7 จะผลิตภัณฑ์ PCR 2 จะ exosap โซลูชั่น ( 0.1 จะเอกโซนิวคลีเอสที่หุ้นเข้มข้น 1 U / ll และ 1.9 จะเลือกบัฟเฟอร์ที่หุ้นร้อยละ 20 U / ll ) และ 1 จะได้ 10  บัฟเฟอร์ SAP .ปฏิกิริยาที่เกี่ยวข้องกับการทำความสะอาดไข่ผสมนี้ที่ 37  C นาน 60 นาที ตามด้วยความร้อน 80  เป็นเวลา 15 นาที เพื่อปรับเปลี่ยนโครงสร้างทางโมเลกุลและการเอกโซนิวคลีเอส phosphatase เอนไซม์ สามถึงห้าตัวเลขของผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์ ) แล้วใช้เป็นแม่แบบสำหรับวงจรการจัดลำดับของและทั้งหมดในที่ทับซ้อนกันหนักและเศษเส้นแสงของ  700 คู่เบสใช้อบิ bigdye ™ 31 terminator ขบวนการทางเคมี ลำดับปฏิกิริยาได้ในปริมาณรวม 10 จะประกอบด้วย 1 จะ™ย้อมใหญ่ผสมปฏิกิริยา 1.5 จะ 5  ใหญ่สี™ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ , 3.3 pmol ของรองพื้นลำดับเฉพาะ 1 – 4 จะ exosap ปฏิบัติแม่แบบ ( ขึ้นอยู่กับคุณภาพของผลิตภัณฑ์ PCR ) และน้ำขึ้น ปริมาณรวมของ 10 จะวงจรปฏิกิริยาลำดับจำนวน 25 รอบี่ 96  C 10 S , ไพรเมอร์อบอ่อนที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5  , และส่วนขยายที่ 60  C
4 นาทีผลิตภัณฑ์ที่ได้ทำให้บริสุทธิ์โดยการตกตะกอนลำดับของเอทานอลและแขวนลอยใน 10 จะสวัสดี di Formamide แล้วแยกออกจากกันและมองเห็นผ่าน capillary electrophoresis ใน ABI
940 ดีเอ็นเอวิเคราะห์ ( Applied Biosystems )ร่องรอยของดิบที่นำเข้า sequencher 3.1 ( รหัสบริษัทยีน ) และแก้ไขการตัดแต่งฐานคุณภาพต่ำโทรศัพท์จาก flanking ภูมิภาค .
ทั้งหมดลำดับทุกชนิดตรวจสอบเรียกชื่อผิดเนื่องจากทั้งฐานระยะไม่ดีหรือมากกว่าโดยเฉพาะสีย้อมนิวคลีโอไทด์และได้รวมตัวกันเป็นเฉพาะความเชื่อสูงโดยใช้ซอฟต์แวร์ sequencher 3.1 ( รหัสบริษัทยีน ) .เท่าที่เช็คกับ
รวมเป็นไปได้ของการไม่ตั้งใจนิวเคลียร์ pseudogene ( หรือ ' 'numt ' ' ) ลำดับแทนจริงแสดงลำดับในชุดข้อมูล ของเรา เรายืนยันว่า amplifications ของเราเริ่มต้นที่ระยะไกลจากวงดนตรี PCR เดียวคาดว่าขนาดและว่าในแต่ละรหัสภูมิภาค , ลำดับฟรีของกรอบเปลี่ยนข้อผิดพลาดและซิสการสิ้นสุดที่ไม่คาดคิดเรายังยืนยันว่าไม่พบการจัดวางลำดับวิวัฒนาการที่ไม่คาดคิดใน locusspecific
หรือโดยรวม ซึ่งวิเคราะห์ข้อมูล