1. Introduction Calpain is widely c

1. Introduction Calpain is widely considered to represent the major protease activity in the postmortem (PM) proteolysis of myofibrillar proteins leading to meat tenderization (Huff-Lonergan et al., 2010 and Koohmaraie and Geesink, 2006). With this background, calpastatin, a highly specific endogenous inhibitor of calpain, also receives much attention with regards to the tenderization of meat PM. So far, several studies have demonstrated that calpastatin activity decreases gradually during PM ageing (Boehm, Kendall, Thompson, & Goll, 1998), and the change accounts for a significant amount of the variation in beef tenderness (∼40%), more than any other single measure (Shackelford et al., 1994). Therefore, it is important to understand the mechanism of calpastatin degradation in PM muscle. Although some studies have demonstrated that the in vitro degradation pattern of calpastatin by calpain is similar to that observed in naturally aged meat, the degradation does not lead to the complete loss of inhibitory activity of calpastatin, and even after extensive proteolysis by calpain, most of the inhibitory activity remains ( Doumit & Koohmaraie, 1999). Furthermore, the question of how calpain can be activated in PM muscle when the muscle contains an excess of calpastatin is also unclear ( Boehm et al., 1998). It is therefore possible that, in addition to calpain, some other endogenous proteolytic enzymes may be activated before calpain and therefore take part in the degradation or inactivation of calpastatin. The caspase system has become a new focus of attention in the field of meat ageing since it was first proposed that it was a likely candidate for PM tenderization ( Herrera-Mendez, Becila, Boudjellal, & Ouali, 2006). There is currently compelling evidence which demonstrates that caspases can be activated during normal PM ageing and take part in the PM tenderization process ( Chen et al., 2011, Huang et al., 2009, Kemp and Parr, 2008 and Kemp et al., 2006), although there is some dispute ( Mohrhauser et al., 2011 and Underwood et al., 2008). It has also been suggested that caspases possibly function in PM tenderization of meat through calpastatin degradation ( Kemp, King, Shackelford, Wheeler, & Koohmaraie, 2009). In addition, it has been demonstrated that calpain and caspase interact through calpastatin in many apoptotic models ( Han et al., 2006 and Wei et al., 2005). Because PM muscle cells also die through apoptosis ( Becila et al., 2010), and so calpastatin may be a link factor between caspase and calpain. Therefore, the objective of this study was to investigate the contribution of caspase and calpain to the proteolysis of calpastatin in postmortem beef muscle. 2. Materials and methods 2.1. Sampling and treatment Three 2.5 years old crossbred cattle (Luxi × Simmental bulls with live weight 450 ± 50 kg) were slaughtered humanely at a commercial meat processing company (HanSen Meat Co. Ltd, Anhui, China) according to the requirements of National Standards of PR China “Operating Procedures of Cattle Slaughter”. After animal exsanguination, Longissimus thoracis (LT) muscles (from 12th thoracic vertebrae to 5th lumbar vertebrae) were excised from the right side of carcasses within 30 min. Subsequently, approximately 30 g muscle was frozen rapidly in liquid nitrogen as 0 d samples; another 30 g muscle was aged 6, 12, 24, and 72 h, which served as normal ageing samples; and lastly, approximately 30 g muscle was dissected into small pieces (ca. 0.2 g/piece). These minced muscles were subdivided into four fractions and soaked in one of the following four buffers in the ratio 1:1 (w/v) (meat/buffer), respectively: (1) 100 mM NaCl and 2 mM NaN3 (control); (2) control + 100 μM MDL-28170 (MDL) (Calbiochem, 208722); (3) control + 100 μM DEVD-CHO (DEVD) (Sigma), and kept for 6, 24, or 72 h at 4 °C. At the end of each storage period, the samples were taken individually and treated as were 0 d samples. 2.2. Calpastatin preparation Calpastatin was extracted according to the procedure as previously described (Shackelford et al., 1994) with minor modifications. Briefly, muscle samples were homogenised in approximately 3 volumes of extraction buffer containing 10 mM EDTA, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol (MCE), protease inhibitor cocktail (Roche) and 100 mM Tris–HCl, pH 8.3 for 15 s two times at a speed of 15,000 rpm with a 30 s rest between each burst. The homogenate was centrifuged at 35,000g for 20 min. The resultant supernatant was heated in a water bath (preheated to 95 °C) for 15 min to denature calpains. Following heating, samples were chilled in an ice water bath and the coagulated protein was dispersed with a small glass rod. Then the samples were centrifuged at 35,000g for 30 min and the resultant supernatant was filtered through cheesecloth. The supernatant was precipitated with 15% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) ( Geesink, Nonneman, & Koohmaraie, 1998) to increase the concentration of calpastatin. These samples were used to detected in vivo degradation of calpastatin. For the in vitro digestion of calpastatin the procedure was modified as follows: after the second centrifugation, the samples were not TCA-precipitated but were concentrated by lyophilisation. Protein concentration was determined by the Bradford assay (Bio-Rad). 2.3. Sarcoplasmic protein extraction Extraction of sarcoplasmic proteins was performed according to Chen et al. (2011) with slight modification. The minced muscle was homogenised in 3 volumes of precooled extraction buffer containing 25 mM Tris–HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 5 mM sodium fluoride, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 mM DTT, 1 mM PMSF and protease inhibitor cocktail (10 ml/tablet). The homogenate was centrifuged at 15,000g for 20 min at 4 °C. Protein concentration was determined by the Bradford assay (Bio-Rad). 2.4. In vitro digestion of calpastatin Three hundred micrograms of heat-soluble calpastatin prepared from time 0 samples were incubated in the incubation buffer (IB) containing 50 mM HEPES, 10 mM DTT, 10% sucrose, 0.1% CHAPS, and 5 mM EDTA, pH 7.2 (designated as control) or the buffer containing 10 units of recombinant caspase-3 (Bioversion, CA, USA) or 10 units of recombinant caspase-6 (Bioversion, CA, USA), where 1 unit is defined as the amount of enzyme that cleaves 1 nM DEVD-pNA for caspase-3 and 1 nM VEID-pNA for caspase-6, respectively, per hour at 37 °C. After 2 or 12 h of incubation at 30 °C, the samples were denatured at 100 °C for 5 min to stop the reaction. 2.5. SDS–PAGE and immunoblotting All resultant samples for SDS–PAGE and immunoblotting were well mixed with sampling treatment buffer (125 mM Tris, 4% SDS, 20% glycerol, pH 6.8). The mixture was heated in a 50 °C water bath for 20 min, and then stored at −80 °C until loading. The acrylamide percentage varied depending on the protein of interest: For calpastatin, 10% gels were used and for caspase-3, 12.5% gels were used. A 4.5% polyacrylamide gel was used for stacking gel. The composition of the gels was as described in our previous paper (Huang, Huang, Ma, Xu, & Zhou, 2012). After electrophoresis, the protein of interest was transferred onto polyvinylidine fluoride membranes (Millipore) using a wet transfer apparatus (BioRad Laboratories). The membranes were blocked with a blocking buffer (5% nonfat dry milk, 0.05% Tween 20, 137 mM NaCl, 5 mM KCl and 20 mM Tris–HCl, pH 7.4) for 90 min at room temperature. After blocking, the membranes were exposed to one of the following primary antibodies for 16 h: rabbit anti-caspase-3 polyclonal antibody (Calbiochem), or mouse anti-calpastatin monoclonal antibody (Thermo). Subsequently, blots were exposed to the reciprocal secondary antibody. Immunoreactive protein bands were detected by enhanced chemiluminescence (Thermo). 2.6. Determination of caspase-3 activity Caspase-3 activity was determined by using a Caspase-3 Fluorometric Assay Kit (PharMingen). Sarcoplasmic proteins were added to the reaction buffer c

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1. แนะนำ Calpain อย่างกว้างขวางถือแสดงกิจกรรมสำคัญรติเอสใน proteolysis (PM) postmortem ของโปรตีน myofibrillar นำไป tenderization เนื้อ (al. et โล Huff, 2010 และ Koohmaraie และ Geesink, 2006) กับพื้นหลังนี้ calpastatin เป็นสารยับยั้ง endogenous การของ calpain ได้รับความสนใจมากเกี่ยวกับ tenderization เนื้อ PM ฉะนี้ หลายการศึกษาได้แสดงให้เห็นว่าที่ calpastatin กิจกรรมลดทีละน้อยระหว่าง PM อายุ (Boehm เคนดัล ทอมป์สัน & Goll, 1998), บัญชีเปลี่ยนแปลงยอดเงินสำคัญของการเปลี่ยนแปลงในเนื้อเจ็บ (∼40%), มากกว่าใด ๆ อื่น ๆ วัดเดี่ยว (Shackelford et al., 1994) ดังนั้น จึงควรทำความเข้าใจกลไกของการลดประสิทธิภาพของ calpastatin ในกล้ามเนื้อ PM แม้ว่าบางการศึกษาได้แสดงว่าย่อยสลายในรูปแบบของ calpastatin โดย calpain คล้ายกับ ที่พบในเนื้อตามธรรมชาติอายุ ย่อยสลายที่ไม่ได้นำการสูญเสียทั้งหมดของลิปกลอสไขกิจกรรม calpastatin และแม้แต่หลัง จากอ่านรีวิว proteolysis โดย calpain ส่วนใหญ่ของยังคงกิจกรรมลิปกลอสไข (Doumit & Koohmaraie, 1999) นอกจากนี้ คำถามที่ว่า calpain สามารถเรียกใช้ในกล้ามเนื้อ PM เมื่อกล้ามเนื้อประกอบด้วยมากเกิน calpastatin ได้ยังไม่ชัดเจน (Boehm et al., 1998) จึงเป็นไปได้ที่ นอกจาก calpain บางอื่น ๆ endogenous proteolytic เอนไซม์อาจเรียกก่อน calpain และดังนั้นจึง เป็นส่วนหนึ่งในการลดหรือยกเลิกการเรียก calpastatin ระบบ caspase ได้กลายเป็น จุดเน้นใหม่ของความสนใจในเนื้ออายุเนื่องจากมันถูกนำเสนอก่อนว่า ถูกต้องน่าจะ PM tenderization (รับเชิญเมนเดส Becila, Boudjellal & Ouali, 2006) มีผลหลักฐานที่แสดงให้เห็นว่า caspases ปัจจุบันสามารถเรียกใช้ระหว่าง PM ดีและใช้เวลาส่วนหนึ่งในกระบวนการ tenderization PM (Chen et al., 2011 หวง et al. ปี 2009, Kemp และ พารร์ 2008 และ Kemp และ al., 2006), แม้จะมีข้อโต้แย้งบาง (Mohrhauser et al., 2011 และ Underwood et al., 2008) มันมียังได้แนะนำว่า caspases อาจทำงานใน tenderization PM เนื้อผ่าน calpastatin ย่อยสลาย (Kemp คิง Shackelford ล้อ & Koohmaraie, 2009) นอกจากนี้ มันได้ถูกแสดงว่า calpain และ caspase โต้ตอบผ่าน calpastatin หลายรุ่น apoptotic (ฮั่นและ al., 2006 และเว่ย et al., 2005) เนื่องจากเซลล์กล้ามเนื้อ PM ยังตาย apoptosis (Becila et al., 2010), และดังนั้น calpastatin อาจเป็นตัวเชื่อมโยงระหว่าง caspase calpain ดังนั้น วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้เป็นการ ตรวจสอบของ caspase และ calpain เพื่อ proteolysis ของ calpastatin ในกล้ามเนื้อ postmortem 2. วัสดุและวิธี 2.1 สุ่มตัวอย่างและการรักษา 2 35 ปีผลิตปศุสัตว์ (การยัง Luxi Simmental โกบูลส์ มีน้ำหนักสด 450 ± 50 กิโลกรัม) ถูกฆ่า humanely ที่เนื้อเชิงพาณิชย์ที่ประมวลผลบริษัท (แฮนเซ่น จำกัดเนื้อ อานฮุย จีน) ตามความต้องการของชาติมาตรฐานของ PR จีน "ปฏิบัติการกระบวนการฆ่าวัวควาย" หลังจาก exsanguination สัตว์ กล้ามเนื้อ thoracis (LT) Longissimus (จาก 12 ทรวงอก vertebrae ไป 5 ช่องไข vertebrae) มี excised จากด้านขวาของซากภายใน 30 นาที ในเวลาต่อมา กล้ามเนื้อประมาณ 30 g ถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วในไนโตรเจนเหลวเป็นตัวอย่าง 0 d กล้ามเนื้อ 30 กรัมอื่นถูกอายุ 6, 12, 24 และ 72 h ซึ่งเป็นตัวอย่างดีปกติ และสุด ท้ายนี้ กล้ามเนื้อประมาณ 30 g ถูก dissected เป็นชิ้นเล็ก ๆ (ca. 0.2 g/ชิ้น) ปฐมภูมิเป็นสี่ส่วน และนำไปแช่ในบัฟเฟอร์ที่สี่ต่อไปนี้ในอัตราส่วน 1:1 (w/v) (เนื้อ/บัฟเฟอร์), อย่างใดอย่างหนึ่งตามลำดับเหล่านี้กล้ามเนื้อสับ: NaCl 100 มม.และ 2 มม. NaN3 (1) (ควบคุม); (2) μM ควบคุม 100 อเนกประสงค์ MDL 28170 อเนกประสงค์ (MDL) (Calbiochem, 208722); (3) ควบคุม 100 μM DEVD-โจ (DEVD) (ซิกมา), และเก็บไว้สำหรับ 6 24 หรือ h 72 ที่ 4 องศาเซลเซียส ในตอนท้ายของแต่ละรอบระยะเวลาการเก็บข้อมูล ตัวอย่างได้มาแต่ละ และถือว่าเป็นแหล่งตัวอย่าง 0 d 2.2. Calpastatin เตรียม Calpastatin ที่แยกตามขั้นตอนก่อนหน้านี้เป็นอธิบาย (Shackelford et al., 1994) มีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ตัวอย่างกล้ามเนื้อสั้น ๆ ที่ homogenised ในปริมาณประมาณ 3 แยกบัฟเฟอร์ประกอบด้วย 10 mM EDTA, 01% (v/v) β-mercaptoethanol (MCE), รติเอสเตอร์ค็อกเทล (Roche) และ 100 มม. Tris–HCl, pH 8.3 15 s ครั้งที่สองที่ความเร็ว 15000 รอบต่อนาทีกับเหลือ s 30 ระหว่างระเบิดแต่ละ Homogenate ถูก centrifuged ที่ 35000 g สำหรับ 20 นาที Supernatant ผลแก่ถูกความร้อนในห้องน้ำ (ต่ำถึง 95 ° C) ใน 15 นาทีการ denature calpains ต่อการทำความร้อน ตัวอย่างที่แช่ในอ่างอาบน้ำเป็นน้ำแข็ง และโปรตีน coagulated ที่กระจายกับร็อดแก้วเล็ก แล้วตัวอย่างถูก centrifuged ที่ 35000 g ใน 30 นาที และ supernatant ผลแก่ถูกกรองผ่าน cheesecloth Supernatant ถูกตกตะกอน ด้วยกรด trichloroacetic 15% (w/v) (TCA) (Geesink, Nonneman & Koohmaraie, 1998) เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของ calpastatin ตัวอย่างเหล่านี้ถูกใช้ในการตรวจพบการลดประสิทธิภาพของ calpastatin ในสัตว์ทดลอง การย่อยอาหารการเพาะเลี้ยงของ calpastatin ขั้นตอนล่าสุดเป็นดังนี้: หลัง centrifugation 2 ตัวอย่างไม่ตกตะกอน TCA แต่เข้มข้น โดย lyophilisation ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนด โดยวิเคราะห์แบรดฟอร์ด (ไบ-Rad) 2.3 Sarcoplasmic โปรตีนสกัดสกัดโปรตีน sarcoplasmic ถูกดำเนินการตามเฉิน et al. (2011) มีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย กล้ามเนื้อสับถูก homogenised ในไดรฟ์ 3 สกัด precooled บัฟเฟอร์ประกอบด้วย NaCl โซเดียมฟลูออไรด์ 5 mM, 5 mM EDTA, 5 มม. EGTA, 1% ไตรตั้น X 100, DTT, 1 mM PMSF 1 mM และรติเอสเตอร์ค็อกเทล 150 มม. 25 มม. (pH 7.6), Tris–HCl (10 ml/แท็บ เล็ต) Homogenate ถูก centrifuged ที่ 15000 g สำหรับ 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนด โดยวิเคราะห์แบรดฟอร์ด (ไบ-Rad) 2.4 การเพาะในการย่อยอาหารของ micrograms ทศ calpastatin ของ calpastatin ความร้อนละลายที่เตรียมจากตัวอย่างเวลา 0 ถูก incubated ในบัฟเฟอร์บ่ม (IB) ที่ประกอบด้วย 50 mM HEPES, DTT 10 มม. 10% ซูโครส CHAPS 0.1% และ 5 mM EDTA, pH 72 (กำหนดเป็นตัวควบคุม) หรือบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 10 หน่วยของ recombinant caspase-3 (Bioversion, CA, USA) หรือ recombinant caspase-6 (Bioversion, CA, USA), 10 หน่วยที่ 1 หน่วยจะกำหนดเป็นจำนวนเอนไซม์ที่แยกออก 1 nM DEVD pNA สำหรับ caspase-3 และ 1 nM VEID pNA สำหรับ caspase-6 ตามลำดับ ต่อชั่วโมงที่ 37 องศาเซลเซียส หลังจาก h 2 หรือ 12 ของคณะทันตแพทยศาสตร์ที่ 30 ° C ตัวอย่างถูก denatured ที่ 100 ° C สำหรับ 5 นาทีหยุดปฏิกิริยา 2.5. SDS–PAGE และ immunoblotting ตัวอย่างผลแก่ทั้งหมดสำหรับ SDS–PAGE และ immunoblotting ได้ดีผสมกับบัฟเฟอร์รักษาสุ่มตัวอย่าง (125 มม.ตรี SDS 4%, 20% กลีเซอร pH 6.8) ส่วนผสมอุ่นในอ่างน้ำ 50 ° C สำหรับ 20 นาที และเก็บที่ −80 ° C จนกว่าจะโหลด อะคริลาไมด์เปอร์เซ็นต์แตกต่างกันขึ้นอยู่กับโปรตีนที่น่าสนใจ: สำหรับ calpastatin เจ 10% ถูกใช้ และถูกใช้ 12.5% เจ caspase-3 เจ polyacrylamide 4.5% ใช้สำหรับเจซ้อน ส่วนประกอบของเจถูกตามที่อธิบายไว้ในเอกสารของเราก่อนหน้านี้ (หวง หวง Ma, Xu &โจว 2012) หลังจาก electrophoresis โปรตีนน่าสนใจถูกถ่ายโอนไปยัง polyvinylidine ฟลูออไรด์สาร (มาก) โดยใช้เครื่องมือโอนย้ายเปียก (BioRad Laboratories) สารที่ถูกบล็อก ด้วยบัฟเฟอร์บล็อก (5% nonfat แห้งนม 0.05% Tween 20, 137 mM NaCl, 5 mM KCl และ 20 มม. Tris–HCl ค่า pH 7.4) สำหรับ 90 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังบล็อก สารได้สัมผัสกับแอนตี้หลักต่อไปนี้ 16 h: กระต่ายป้องกัน-caspase-3 polyclonal แอนติบอดี (Calbiochem), หรือเมาส์ต่อต้าน-calpastatin monoclonal แอนติบอดี (เทอร์โม) อย่างใดอย่างหนึ่ง ในเวลาต่อมา กันบล็อทได้สัมผัสกับแอนติบอดีรองซึ่งกันและกัน พบแถบโปรตีน immunoreactive โดยเพิ่ม chemiluminescence (เทอร์โม) 2.6 กำหนดกิจกรรม caspase-3 Caspase-3 กิจกรรมที่ถูกกำหนดโดยการ Caspase-3 Fluorometric Assay Kit (PharMingen) เพิ่มโปรตีน sarcoplasmic ถึง c บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

1 . การแนะนำ calpain ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางได้รับการพิจารณาให้เป็นตัวแทนกิจกรรม protease ที่พลิกศพ(ช่วงบ่าย) proteolysis ของโปรตีน myofibrillar นำไปสู่เนื้อ tenderization ( huff-lonergan et al . 2010 koohmaraie และ geesink 2006 ) พร้อมด้วย calpastatin พื้นหลังนี้ยาป้องกันเองในระยะยาวโดยเฉพาะเป็นอย่างสูงของ calpain นอกจากนั้นยังได้รับความสนใจจากประชาชนเป็นอย่างมากพร้อมด้วยขอแสดงความนับถือใน tenderization ของเนื้อ.การศึกษาหลายอย่างมากได้แสดงให้เห็นว่าการทำงานของ calpastatin อย่างค่อยเป็นค่อยไปจะลดลงในช่วงเย็นอายุ( boehm , Kendall ,ธอมป์สัน& goll 1998 )และเปลี่ยนที่บัญชีสำหรับจำนวนมากจากความหลากหลายในความอ่อนโยนเนื้อ(∼ 40% )มากกว่าการวัดเดียวอื่นใด( shackelford et al . 1994 ) ดังนั้นเป็นเรื่องสำคัญที่จะต้องทำความเข้าใจเกี่ยวกับกลไกของการเสื่อม สภาพ จากกล้ามเนื้อ calpastatin ในช่วงเย็น แม้ว่าการศึกษาบางคนได้แสดงให้เห็นว่ารูปแบบการเสื่อม สภาพ ใน Vitro ของ calpastatin calpain โดยมีลักษณะเหมือนกับที่เห็นในเนื้ออย่างเป็นธรรมชาติมีอายุการเสื่อม สภาพ ที่ไม่นำไปสู่การสูญเสียของกิจกรรม inhibitory ของ calpastatin และแม้แต่หลังจาก proteolysis ที่หลากหลายโดย calpainกิจกรรม inhibitory ที่ส่วนใหญ่ยังคงอยู่( doumit & koohmaraie 1999 ) ยิ่งไปกว่านั้นคำถามที่ว่า calpain สามารถเปิดใช้งานในกล้ามเนื้อเวลากล้ามเนื้อที่มีมากเกินไปของ calpastatin ยังเป็นไม่ชัดเจน( boehm et al . 1998 ) มันมีความเป็นไปได้ดังนั้นในการไปยัง calpainเอ็นไซม์ proteolytic เองในระยะยาวอื่นๆบางอย่างอาจไม่ได้เปิดใช้งานก่อน calpain และดังนั้นจึงมีส่วนร่วมใน inactivation หรือการเสื่อม สภาพ ของ calpastatin ระบบ caspase ได้กลายเป็นประเด็นใหม่ของความสนใจในฟิลด์ของเนื้ออายุตั้งแต่มันได้ถูกเสนอว่าเป็นผู้สมัครรับเลือกตั้งอาจเป็นไปได้ว่าสำหรับน. tenderization ( herrera-mendez becila boudjellal & ouali 2006 )เป็นครั้งแรกมีอยู่ในขณะนี้ที่น่าสนใจมีหลักฐานที่แสดงให้เห็นว่า caspases สามารถเปิดใช้งานในระหว่างเวลาปกติอายุและมีส่วนร่วมในที่น. tenderization กระบวนการ( Chen et al ., 2011 , Huang et al ., 2009 , kemp และ parr , 2008 และ kemp et al ., 2006 ),แม้ว่าจะมีบางข้อพิพาท( mohrhauser et al ., 2011 และรากไม้ et al ., 2008 )ได้รับการแนะนำว่า caspases อาจทำงานใน tenderization โมงเย็นของอาหาร ประเภท เนื้อโดยผ่านการเสื่อม สภาพ calpastatin ( kemp กษัตริย์ shackelford ล้อ& koohmaraie 2009 ) นอกจากนี้ยังมีการแสดงให้เห็นว่า caspase และ calpain ติดต่อผ่าน calpastatin ในรุ่น apoptotic จำนวนมาก( Han et al . 2006 และ WEI et al . 2005 )เนื่องจากเซลล์กล้ามเนื้อทุ่มยังตายผ่าน apoptosis ( becila et al . 2010 )และ calpastatin อาจจะเป็นปัจจัยลิงค์ระหว่าง calpain และ caspase ดังนั้นการศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสนับสนุนของกล้ามเนื้อและ caspase calpain เพื่อ proteolysis ของ calpastatin เนื้อวัวชันสูตรศพ 2 . วัสดุและวิธีการ 2.1 . การสุ่มตัวอย่างสามการบำบัดและ 2 .5 ปี crossbred ฝูงสัตว์( luxi × simmental วัวพร้อมด้วยสดน้ำหนัก 450 ± 50 กก.)เป็นตัวถูกฆ่าด้วยมนุษยธรรมที่ทางการค้าเนื้อการประมวลผลของบริษัท( Hansen เนื้อ. co . th จำกัด,อานฮุย,จีน)ตามข้อกำหนดของมาตรฐานของ PR จีน"ขั้นตอนการดำเนินงานของฝูงสัตว์การฆ่า". หลังจาก exsanguination สัตว์longissimus thoracis ( lt ;)กล้ามเนื้อ(จาก 12 บาดเจ็บด้วยวิธี head tilt ข้อกระดูกสันหลังในการที่ 5 ช่วงเอวข้อกระดูกสันหลัง)เป็น excised จากที่ด้านขวาของศพ ภายใน 30 นาที ภายหลัง ,ประมาณ 30 กรัมกล้ามเนื้อเป็นแช่แข็งอย่างรวดเร็วในของเหลวไนโตรเจนเป็น 0 d ตัวอย่าง;อื่น 30 กรัมกล้ามเนื้อก็มีอายุ 6 , 12 , 24 ,และ 72 ชั่วโมงซึ่งจัดให้บริการตามปกติอายุตัวอย่าง;และสุดท้ายคือ,ประมาณ 30 กรัมเป็นกล้ามเนื้อ dissected เป็นชิ้นเล็กๆ( CA 0.2 กรัม/ชิ้น) เหล่านี้สับกล้ามเนื้อได้ถูกแบ่งเป็นสี่เพียงเศษเสี้ยววินาทีและแช่น้ำแล้วใส่ลงในหนึ่งในต่อไปนี้: buffer สี่ในอัตรา 1 : 1 ( w / v )(เนื้อ/บัฟเฟอร์)ตามลำดับ:( 1 ) 100 มม.และ 2 มม. NaCl น่าน 3 (ควบคุม);( 2 )การควบคุม 100 μ m MDL -28170 ( MDL )( calbiochem , 208722 );( 3 )การควบคุม 100 μ m devd - cho ( devd )( Six Sigma )และได้รับการดูแลรักษาให้อยู่ในช่วง 6 ,24 หรือ 72 ชั่วโมงที่ 4 ° C ในตอนท้ายของแต่ละช่วงเวลาการจัดเก็บตัวอย่างได้ถูกนำตัวมาแบบเฉพาะตัวและได้รับการปฏิบัติในฐานะที่เป็นตัวอย่างเป็น 0 d 2.2 . calpastatin calpastatin การเตรียมการสกัดตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้( shackelford et al . 1994 )พร้อมด้วยการเปลี่ยนแปลงแก้ไขเล็กน้อย ช่วงระยะเวลาสั้นๆตัวอย่างกล้ามเนื้อเป็น homogenised ในประมาณ 3 เล่มของบัฟเฟอร์สำหรับการประกอบด้วย 10 มม. edta 01% ( v / v )เฉพาะ - mercaptoethanol ( MCE ), protease ยาป้องกันค็อกเทล( Roche )และ 100 มม.บริษัททริสเรทติ้งจำกัด - HCL /, pH 8.3 สำหรับ 15 s สองครั้งที่ความเร็วของ 15 , 000 รอบต่อนาทีพร้อมด้วย 30 S ระหว่างแต่ละแตก homogenate นั้น centrifuged ที่ 35,000 g สำหรับ 20 นาที supernatant Resultant Set of Policy จะเป็นสระน้ำอุ่นในอ่างน้ำ(อุ่นไว้ถึง 95 ° C )สำหรับ 15 นาทีเพื่อทำให้ผิดลักษณะเดิม calpains ต่อไปนี้:เครื่องทำความร้อนตัวอย่างก็เย็นในอ่างอาบน้ำน้ำแช่น้ำแข็งและโปรตีน coagulated นั้นก็แยกย้ายกันไปด้วยไม้กระจกขนาดเล็กที่ แล้วตัวอย่างที่เป็น centrifuged ที่ 35,000 g สำหรับ 30 นาทีและ supernatant Resultant Set of Policy จะเป็นที่กรองแล้วผ่าน cheesecloth supernatant นั้นตกตะกอนด้วย 15% ( v w /)กรด trichloroacetic ( tca )( geesink nonneman & koohmaraie 1998 )เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของ calpastatinตัวอย่างเหล่านี้จะถูกใช้เพื่อตรวจพบในการเสื่อม สภาพ ของไปยังสถานี Vivo calpastatin สำหรับระบบย่อยอาหารใน Vitro ของ calpastatin ตามขั้นตอนที่มีการเปลี่ยนแปลงโดยมีรายละเอียดดังนี้หลังจากผลิตที่สองตัวอย่างไม่ได้ tca - ตกตะกอนแต่เป็นกระจุกตัวอยู่โดย lyophilisation การทำสมาธิโปรตีนก็ถูกกำหนดโดย Bradford สอบ( bio-rad ) 2.3 .sarcoplasmic การขุดเจาะเลือดโปรตีนของโปรตีน sarcoplasmic ได้ดำเนินการตามไปยัง Chen et al . ( 2011 )พร้อมด้วยการแก้ไขเพียงเล็กน้อย. เนื้อหมูบดกล้ามเนื้อเป็น homogenised ใน 3 เล่มของ precooled สกัด buffer ที่มี 25 มม.บริษัททริสเรทติ้งจำกัด - HCL /( PH 7.6 ), 150 มม. NaCl , 5 มม.โซเดียมฟลูออไรต์, 5 มม. edta , 5 มม. egta , 1% Triton X - 100 , 1 มม. DTT Network , 1 มม. pmsf protease และยาป้องกันค็อกเทล( 10 มล./ Tablet PC )homogenate นั้น centrifuged ที่ 15 , 000 กรัมสำหรับ 20 นาทีที่ 4 ° C การทำสมาธิโปรตีนก็ถูกกำหนดโดย Bradford สอบ( bio-rad ) 2.4 . ใน Vitro ระบบย่อยอาหารของ calpastatin สามร้อย micrograms ของความร้อน calpastatin ละลายน้ำได้เตรียมไว้จากเวลา 0 ตัวอย่างมี incubated ในอบ Buffer (วาณิชธนกิจ)ซึ่งมี 50 มม. hepes , 10 มม. DTT Network , 10% ซูโครส, 0.1% ปลาบปลื้ม,และ 5 มม. edta , pH 7 .2 (ได้รับมอบหมายให้อยู่ในฐานะการควบคุม)หรือบัฟเฟอร์ประกอบด้วย 10 หน่วยของ poxvaccine caspase 3 ( bioversion , CA , USA )หรือ 10 หน่วยของ poxvaccine caspase - 6 ( bioversion , CA ,สหรัฐอเมริกา),ที่ 1 ชุดมีการกำหนดจำนวนเงินที่เป็นของเอนไซม์ที่ cleaves 1 nm devd - pna สำหรับ caspase 3 และ 1 , veid - pna สำหรับ caspase - 6 ,ตามลำดับ,ต่อชั่วโมงที่ 37 ° C หลังจาก 2 หรือ 12 ชั่วโมงของผู้ประกอบการที่ C 30 °ตัวอย่างที่มีสำหรับจุดไฟที่ C 100 °สำหรับ 5 นาทีในการหยุดการตอบสนอง 2.5 . เซิร์ฟเวอร์ SDS - หน้าและ immunoblotting ตัวอย่าง Resultant Set of Policy ทั้งหมดสำหรับ immunoblotting และเซิร์ฟเวอร์ SDS - หน้าเป็นอย่างดีผสมพร้อมบัฟเฟอร์สำหรับการบำบัดการสุ่มตัวอย่าง( 125 มม.ทริสเรทติ้งเซิร์ฟเวอร์ SDS 4% 20% กลีซ - เออะริน pH 6.8 ) การผสมผสานกันระหว่างที่เป็นน้ำอุ่นใน 50 ° C น้ำอ่างอาบน้ำสำหรับ 20 นาทีแล้วจัดเก็บที่ -80 °จนกว่าการโหลดเปอร์เซ็นต์อะคริลาไมด์ที่หลากหลายขึ้นอยู่กับโปรตีนที่น่าสนใจสำหรับ calpastatin ผลิตภัณฑ์ ประเภท แวกซ์,เจล 10% จะถูกใช้และสำหรับ caspase 3 ผลิตภัณฑ์ ประเภท แวกซ์,เจล 12.5% ได้ถูกนำมาใช้ เจล polyacrylamide 4.5% ได้ถูกใช้เพื่อจัดวางแบบซ้อนกันเจล การเขียนของ ผลิตภัณฑ์ ประเภท แวกซ์,เจลที่ได้ตามที่อธิบายไว้ในเอกสารก่อนหน้าของเรา( Huang Huang mA Xu & Zhou 2012 ) หลังจาก electrophoresisโปรตีนที่น่าสนใจก็จะพาท่านไปส่งยัง polyvinylidine ฟลูออไรต์เยื่อหุ้มแผ่น( millipore )โดยใช้เครื่องถ่ายโอนเปียกชื้น( biorad Laboratories ) เยื่อเลือกผ่านความละเอียดสูงที่มีสิ่งกีดขวางได้ด้วยการปิดกั้นการ Buffer ( 5% nonfat แห้งนม, 0.05% ส่วนกลาง 20 , 137 มม. NaCl , 5 มม.และ 20 มม. kcl บริษัททริสเรทติ้งจำกัด - HCL , pH 7.4 )สำหรับ 90 นาทีที่ อุณหภูมิ ห้อง. หลังจากการปิดกั้นเยื่อเลือกผ่านความละเอียดสูงที่ได้รับเพื่อไปยังหนึ่งในเมื่อเส้นเลือดหลักต่อไปนี้สำหรับ 16 ชั่วโมงกระต่ายป้องกัน - caspase 3 polyclonal แอนทิบอด - อิ( calbiochem )หรือเมาส์การป้องกัน - calpastatin monoclonal แอนทิบอด - อิ(ความร้อน) ต่อมาเปื้อนทั้งมวลได้รับแอนทิบอด - อิรองซึ่งกันและกันได้ คลื่นความถี่โปรตีน immunoreactive ถูกตรวจพบโดยเพิ่ม chemiluminescence (ความร้อน) 2.6 .การกำหนดกิจกรรม 3 กิจกรรม caspase caspase 3 จึงตัดสินใจโดยใช้ชุดสอบ caspase 3 fluorometric ( pharmingen ) โปรตีน sarcoplasmic ถูกเพิ่มลงในบัฟเฟอร์ปฏิกริยาที่ C