rHaa86The full length gene of 1.7 k

rHaa86
The full length gene of 1.7 kb size of Bm86 orthologue of
Hyalomma anatolicum anatolicum (Haa86) cloned in the
cloning vector pET 32a and transformed in Escherichia
coli BL21(DE3)PLysS strain was available in the Entomology
laboratory, Division of Parasitology. The clones
were revived by sub-culturing in Luria Bartani (LB) broth
supplemented with ampicilline (100 lg/ml) and chloramphanicol
(34 lg/ml). For mass scale production of desired
protein, freshly grown overnight cultures were inoculated
in LB medium (1,000 ml) and incubated at 37 C with
shaking. When the OD reached at 0.5–0.6, the cells were
induced with 1 mM isopropyl-b-D-thioglactopyranoside
(IPTG) and incubated further with shaking. Bacterial cells
were harvested by centrifugation and stored at -20 C. To
purify the expressed protein, the cell pellet was resuspended
in lysis buffer (containing urea, Tris–Cl and
NaH2PO4) and mixed by vortexing. To enhance the lysis of
cells the suspension was stirred for 2 h at 22 C in the
shaking incubator at 220 rpm and sonicated at 10 lm for
5–6 times for 45 s each after 1 min rest. The cell lysate was
obtained by centrifugation and stored at -20 C. The
lysate containing the solubilized protein was subjected to
purification by nickel-nitrilotriacetic acid (Ni–NTA) agarose
resin (Qiagen, Germany). The level of recombinant
protein present in fractions collected during elution was
confirmed by SDS-PAGE. The fractions were pooled and
dialyzed using 7,000 Da cut-off dialysis membrane (Pierce,
UK) against decreasing strength of urea and finally in PBS
(pH 7.2), is to remove the urea and re-nature/refold the
protein. The resultant buffer containing recombinant
rHaa86 was subjected to ultra filtration using 50 kDa cut
off ultra filter (Pall life sciences). The protein was resolved
in SDS-PAGE (12 % gel) along with bovine serum albumin
(BSA) in the concentrations of 1–10 lg per 20 ll of
buffer. The band thickness of protein sample matching with
a particular concentration of BSA was used to calculate the
concentration of the rHaa86. The protein sample was
labeled, mixed with cocktail of protease inhibitors (Amresco,
USA) and stored at -20 C.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

rHaa86ยีนแบบยาว 1.7 kb ขนาดของ orthologue Bm86 ของโคลน Hyalomma anatolicum anatolicum (Haa86) ในการเวกเตอร์การโคลนสัตว์ 32a และแปลง Escherichiacoli BL21 (DE3) PLysS ต้องใช้มีในกีฏวิทยาห้องปฏิบัติการ ฝ่ายปรสิตวิทยา โคลนได้ฟื้นฟู โดย culturing ย่อยในซุป Luria Bartani (ปอนด์)เสริม ด้วย ampicilline (100 lg/ml) และ chloramphanicol(34 lg/มล.) สำหรับการผลิตขนาดใหญ่ต้องโปรตีน สดเติบโตวัฒนธรรมค้างคืนที่ inoculatedในปอนด์ (1000 ml) และ incubated ที่ 37 C ด้วยสั่น เมื่อการ OD ที่ 0.5 – 0.6 เซลล์ได้เกิดกับ 1 มม. isopropyl-b-D-thioglactopyranoside(IPTG) และ incubated เพิ่มเติมกับสั่น เซลล์แบคทีเรียเก็บเกี่ยว โดย centrifugation และเก็บที่-20 C. การบริสุทธิ์โปรตีนแสดง เม็ดเซลล์ถูก resuspendedในบัฟเฟอร์ lysis (ประกอบด้วยทริสเรทติ้ง – Cl ยูเรีย และNaH2PO4) และแบบผสม โดย vortexing เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการ lysis ของเซลล์ที่มีกวนการระงับใน h 2 ที่ 22 C ในการสั่นบ่มเพาะวิสาหกิจที่ 220 รอบต่อนาที และ sonicated 10 lm สำหรับ5 – 6 ครั้งใน 45 s แต่ละหลังเหลือ 1 นาที มีเซลล์ lysateรับ โดย centrifugation และเก็บไว้ที่-20 C.ประกอบด้วยโปรตีน solubilized lysate ถูกยัดเยียดให้ฟอก ด้วย agarose nitrilotriacetic นิกเกิล (Ni – NTA) กรดเรซิน (Qiagen เยอรมนี) ระดับของวททชมีโปรตีนอยู่ในส่วนที่เก็บรวบรวมระหว่าง elutionยืนยัน โดย SDS-หน้า ส่วนถูกทางถูกพู และdialyzed ใช้ 7000 ดาตัดหน่วยเมมเบรน (เพียร์ซสหราชอาณาจักร) กับการลดความแรงของ urea และสุดท้ายใน PBS(pH 7.2), จะเอายูเรียและ re-ธรรมชาติ/refold การโปรตีน บัฟเฟอร์ผลแก่ประกอบด้วยวททชrHaa86 ถูกยัดเยียดให้ใช้ 50 kDa ตัดกรองพิเศษปิดระบบกรอง (แถบวายชีวิตวิทยาศาสตร์) โปรตีนได้รับการแก้ไขในหน้า SDS (12% เจล) กับวัว serum albumin(บีเอสเอ) ในความเข้มข้นของ lg 1 – 10 ต่อ 20 จะของบัฟเฟอร์ ความหนาของแถบของโปรตีนตัวอย่างตรงกับเข้มข้นเฉพาะของบีเอสเอถูกใช้เพื่อคำนวณการความเข้มข้นของ rHaa86 ตัวอย่างโปรตีนได้ป้าย ผสมกับค็อกเทลของรติเอส inhibitors (Amrescoสหรัฐอเมริกา) และเก็บไว้ที่-20 C.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

rHaa86
ยีนยาวเต็มรูปแบบที่มีขนาด 1.7 กิโลของ Bm86 orthologue ของ
Hyalomma anatolicum anatolicum (Haa86) ในโคลน
โคลนเวกเตอร์ pET 32a และเปลี่ยนใน Escherichia
coli BL21 (DE3) PLysS ความเครียดที่มีอยู่ในกีฏวิทยา
ห้องปฏิบัติการกองปรสิตวิทยา โคลน
ถูกฟื้นย่อยเพาะเลี้ยงใน Luria Bartani (LB) น้ำซุป
เสริมด้วย ampicilline (100 LG / ml) และ chloramphanicol
(34 LG / ml) สำหรับการผลิตมวลของที่ต้องการ
โปรตีนสดที่ปลูกในชั่วข้ามคืนวัฒนธรรมที่ถูกเชื้อ
ในสื่อปอนด์ (1,000 มล.) และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสด้วย
การเขย่า เมื่อ OD ถึงที่ 0.5-0.6 เซลล์ที่ถูก
เหนี่ยวนำให้เกิด 1 มิลลิ isopropyl-BD-thioglactopyranoside
(IPTG) และบ่มต่อไปด้วยการเขย่า เซลล์แบคทีเรีย
ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส เพื่อ
ชำระล้างโปรตีนเม็ดเซลล์ถูก resuspended
ในบัฟเฟอร์สลาย (ที่มียูเรีย Tris-Cl และ
NaH2PO4) และหลากหลายโดย vortexing เพื่อเพิ่มการสลายของ
เซลล์ระงับถูกกวนเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 22 องศาเซลเซียสใน
ศูนย์บ่มเพาะเขย่าที่ 220 รอบต่อนาทีและ sonicated ที่ 10 LM สำหรับ
5-6 ครั้งเป็นเวลา 45 แต่ละหลังส่วนที่เหลือ 1 นาที lysate เซลล์ที่ได้รับ
ที่ได้จากการปั่นและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส
lysate ที่มีโปรตีนที่ละลายได้ภายใต้การ
ทำให้บริสุทธิ์ด้วยกรดนิกเกิล nitrilotriacetic (Ni-NTA) agarose
เรซิน (Qiagen, เยอรมนี) ระดับของ recombinant
โปรตีนในปัจจุบันเศษส่วนเก็บรวบรวมในระหว่าง elution ถูก
ยืนยันโดย SDS-PAGE เศษส่วนถูกรวบรวมและ
ใช้ dialyzed 7000 ดาเมมเบรนฟอกไตตัด (เพียร์ซ,
สหราชอาณาจักร) กับการลดความแข็งแรงของยูเรียและในที่สุดในพีบีเอส
(pH 7.2) คือการเอาปุ๋ยยูเรียและ re-ธรรมชาติ / Refold
โปรตีน บัฟเฟอร์ที่มีผล recombinant
rHaa86 ได้ภายใต้การกรองพิเศษที่ใช้ 50 กิโลดาลตันตัด
ออกจากตัวกรองพิเศษ (วิทยาศาสตร์เพื่อชีวิตพอล) โปรตีนที่ได้รับการแก้ไข
ใน SDS-PAGE (12% เจล) พร้อมด้วยซีรั่มอัลบูมิวัว
(BSA) ในระดับความเข้มข้น 1-10 LG ละ 20 ของ LL
บัฟเฟอร์ ความหนาของกลุ่มตัวอย่างโปรตีนที่ตรงกับ
ความเข้มข้นเฉพาะของบีเอสเอถูกนำมาใช้ในการคำนวณ
ความเข้มข้นของ rHaa86 กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับโปรตีน
ที่มีข้อความผสมกับค๊อกเทลของน้ำย่อยโปรตีน (AMRESCO,
USA) และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

rhaa86
เต็มความยาวของยีน 1.7 KB ขนาด bm86 orthologue ของ
hyalomma anatolicum anatolicum ( haa86 ) โคลนใน
โคลนเวกเตอร์สัตว์เลี้ยง new 32A และเปลี่ยนใน Escherichia
coli BL21 ( DE3 ) plyss สายพันธุ์ที่มีอยู่ในกีฏวิทยา
ห้องปฏิบัติการ หน่วยปรสิตวิทยา โคลน
ถูก revived โดยย่อยอาหารในลุเรีย bartani ( LB ) ซุป
เสริมด้วย ampicilline ( 100 LG / มิลลิลิตร ) และ chloramphanicol
( 34 ) / ml ) สำหรับการผลิตมวลขนาด
โปรตีนที่ต้องการปลูกวัฒนธรรมสดค้างคืนปลูกเชื้อ
ในปอนด์ขนาดกลาง ( 1000 ml ) บ่มที่ 37 องศาเซลเซียส 
สั่น เมื่อ OD ถึง 0.5 - 0.6 , เซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วย

isopropyl-b-d-thioglactopyranoside 1 มม. ( โปรตีน ) และบ่มต่อไปกับสั่น เซลล์แบคทีเรีย
ถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยงและเก็บไว้ที่ - 20 C .

 บริสุทธิ์มีโปรตีนเซลล์เม็ดเป็น resuspended
ในการสลายบัฟเฟอร์ ( มียูเรีย ทริส– CL และ
nah2po4 ) และแบบผสม โดย vortexing . เพื่อเพิ่มคุณภาพของ
เซลล์ระงับได้แบบ 2 ชั่วโมง 22  C
เขย่าตู้ที่ 220 RPM และ sonicated LM ครั้งที่ 10
5 – 6 45 S แต่ละหลังจาก 1 นาทีที่เหลือเซลล์ lysate คือ
ได้ปั่นและเก็บไว้ที่ - 20  C .
lysate ที่มีสารละลายโปรตีนภายใต้
บริสุทธิ์โดยนิกเกิลกรดไนติโลไตรอะซิติก ( N )
( NTA ) เรซิ่น ( QIAGEN , เยอรมัน ) ระดับของโปรตีนรีคอมบิแนนท์
ปัจจุบันในส่วนที่เก็บระหว่างการได้มา
ยืนยันโดยการศึกษา . เศษส่วน ) และผ่านการรวม
7000 ดาตัดเยื่อกรอง ( เพียร์ซ
UK ) กับการลดความแข็งแรงของยูเรียและสุดท้ายใน PBS
( pH 7.2 ) จะเอายูเรียและธรรมชาติ / refold
โปรตีน ซึ่งเป็นบัฟเฟอร์ที่มีรีคอมบิแนนท์
rhaa86 ภายใต้ระบบการกรองโดยใช้ 50 กิโลดาลตันตัด
ปิดกรองพิเศษ ( วิทยาศาสตร์พอล ชีวิต ) โปรตีนที่ถูกแก้ไข
ใน SDS-PAGE ( 12 % เจล ) พร้อมกับอัลบูมิน
( BSA ) ในระดับความเข้มข้น 1 – 10 LG ต่อ 20 จะ
บัฟเฟอร์ วงดนตรีที่ความหนาของโปรตีนตัวอย่างการจับคู่กับสมาธิที่เฉพาะเจาะจงของบีเอสเอ

ใช้คำนวณความเข้มข้นของ rhaa86 . โปรตีนตัวอย่าง
ป้ายผสมค็อกเทลของโปรติเอสอินฮิบิเตอร์ ( amresco
, USA ) และเก็บไว้ที่ - 20  C