ในปีเดียวกันนั้น พระเจ้าตะเบ็งชะเวตี้ กษัตริย์พม่าได้ยกกองทัพเข้าตีกรุงศรีอยุธยา ผลจากสงครามทำให้สมเด็จพระสุริโยทัยสิ้นพระชนม์บนคอช้าง เมื่อพม่ายกทัพกลับไป และกรุงศรีอยุธยาได้จัดการพระศพสมเด็จพระสุริโยทัยเรียบร้อยแล้ว สมเด็จพระมหาจักรพรรดิจึงทรงปรับปรุงกิจการทหารให้มั่นคงกว่าเดิม พระองค์โปรดเกล้าฯ ให้ตั้งเมืองใหม่ขึ้นอีกหลายเมือง รวมทั้งให้ยกฐานะหมู่บ้านตลาดขวัญขึ้นเป็น เมืองนนทบุรี ในปี พ.ศ. 2092 เนื่องจากมีราษฎรจำนวนมากหนีภัยสงครามครั้งนั้นไปอยู่ตามป่าเขาและไม่ยอมกลับพระนคร หากตั้งเมืองใหม่ขึ้นจะเป็นประโยชน์ต่อการเกณฑ์ไพร่พลเมื่อเกิดสงคราม นอกจากนี้ยังสามารถเป็นเมืองท่าและเมืองหน้าด่านของกรุงศรีอยุธยาได้อีกด้วย ที่ตั้งของเมืองนนทบุรีในครั้งแรกนี้ตั้งอยู่ทางฝั่งตะวันออกของแม่น้ำเจ้าพระยา มีวัดหัวเมืองเป็นเขตเหนือ (ปัจจุบันคือโรงพยาบาลพระนั่งเกล้า) และมีวัดท้ายเมืองเป็นเขตใต้