2. Materials and methodsMature sea

2. Materials and methods
Mature sea urchins, P. lividus, were collected in the outer part of the
Ría de Vigo (Galicia, NW Iberian Peninsula) during the natural reproductive
season, maintained in aquaria with running natural filtered seawater
(18 ± 2 °C, 35‰) and were fed at demand with fresh green algae
Ulva lactuca. Gametes were obtained directly from the gonads with a
Pasteur pipette after dissection of a single pair of adults for each experiment.
Oocyte quality and sperm motility were checked prior to fertilization,
a few microliters of undiluted sperm were added to a 100 mL
cylinder with oocytes and stirred for 2 min to allow fertilization according
to Beiras and Saco-Álvarez (2006). The percentage of fertilization
was then calculated checking the formation of the fertilization membrane
and only batches with a fertilization rate N90% were used for
obtaining the embryos; batches not meeting this quality criteria were
discarded. Blastulas were obtained by incubation in Artificial Sea
Water (ASW, prepared following Lorenzo et al., 2002), in darkness, at
20 °C for 8 h and were checked out under the microscope previous to
cryopreservation experiments. Oocytes from the same batch were fertilized
and immediately introduced in two larval rearing tanks for each
batch control. Microalgae cultures of Tetraselmis suecica (Provasoli–
Guillard National Center for Marine Algae and Microbia, CCMP904),
Isocrysis aff. galbana clon T-ISO (Provasoli–Guillard National Center for
Marine Algae and Microbia, CCMP1324), Chaetoceros gracilis (ECIMAT
collection), Phaeodactilum tricornutum (ECIMAT collection) and
Cylindrotheca closterium (ECIMAT collection) used during the experiments
were provided by ECIMAT (Universidade de Vigo).
The cryopreservation methodology was performed following the
methods described in Bellas and Paredes (2011). Sea urchin embryos
were cryopreserved at the blastula stage (8 h incubation at 20 °C), the
cryoprotecting agent (CPA) combination used was 1.5 M dimethyl sulfoxide
(Me2SO) + 0.04 M trehalose (TRE). One mL of CPA solution was
added to 1 mL of embryo suspension in ASW, in 15 equimolar steps
1 min apart (1:1 final dilution), at 19 ± 1 °C. We used a programmable
controlled freezer (Cryologic Lty. Ltd, Australia). The cooling ramp
started with a hold at 4 °C for 2 min, and then cooled at a rate of
1 °C min−1 to −12 °C. At this point vials were seeded during a
2 min hold, followed by cooling at 1 °C min−1 to −80 °C. A final
hold of 2 min was placed at −80 °C and vials were transferred to
liquid nitrogen for storage. Thawing was performed by immersion
into a 17 ± 1 °C water bath until the ice was melted. CPAs were then removed
with clean ASW in 12 equimolar steps 1 min apart at room temperature
19 ± 1 °C and embryos were finally rinsed with clean ASW.
Gametes from two male and female pairs were used to make individual
crossings: the first fertilizations were reared as fresh controls,
the second fertilizations using the same parental line, were incubated
for 8 h until the blastula stage, cryopreserved and conserved for 24 h
in liquid nitrogen, blastulas were thawed and embryos were finally
ready to be introduced in the larval rearing tanks. This study was carried
out by duplicate for each cross and treatment.
Larvae were reared for 20 days, until they were competent to metamorphose,
in 100 L polypropylene cylindroconical tanks in closed circuit
of filtered sea water (FSW) (0.5 μm + Ultraviolet), with three complete
water changes per week (larvae were collected with a 40 μm mesh). The
initial amount of 105 larvae per tank were incubated at 19 ± 1 °C with a
24 h light schedule (7.1 μE m−2 s
−1
), and were fed with 40 to 80 equivalents
(a diet based on T. suecica, I. aff. galvana clon T-iso, C. gracilis and
P. tricornutum, in a number of algal cells equivalent in dry weight to
I. galbana, from day 0–7 with 40 equivalents, 60 equivalents until day
14 and 80 until day 20) as described in Casal et al. (2011) and MullerFeuga
et al. (2003).
During larval rearing information was compiled to measure the
larval performance: survival counts (n = 100) and length measurements
(maximum dimension of the first 35 individuals, embryos
included).
Seven days before reaching competence, 10 Petri dishes per treatment
were inoculated with 15 mL of FSW (0.22 μm + Ultraviolet)
with f/2 medium and 5 mL of a benthonic diatom C. closterium
forming a biofilm to use as settlement attractant for competent larvae.
The dishes were incubated at 18 °C and 54.2 μE m−2 s−1 and
were rinsed with FSW to eliminate dead cells from the surface previous
to the settlement experiment start point. After 20 days of larval
rearing 60 competent larvae per dish were introduced, which were
maintained in semidarkness (0.5 μE m−2 s−1
) at 18 °C, with a single
food dose of 50 equivalents and were checked for settlement every
8–10 days. One-way analysis of variance (ANOVA) followed by the
Bonferroni test for multiple comparisons were conducted to assess
the differences among treatments using the SPSS® version 15.0 statistical
software.
3. Results

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการผู้ใหญ่ซี urchins, P. lividus ถูกเก็บในส่วนภายนอกของการRía Vigo การเด (Galicia, NW สมุทร) ระหว่างธรรมชาติสืบฤดูกาล รักษาในอควาเรียกับใช้น้ำทะเลกรองธรรมชาติ(18 ± 2 ° C, 35‰) และอาหารที่ต้อง มีสาหร่ายสีเขียวสดUlva lactuca Gametes ได้รับโดยตรงจากต่อมบ่งเพศกับการเปตต์ระดับหลังจากชำแหละของผู้ใหญ่ในการทดลองแต่ละคู่เดียวคุณภาพและสเปิร์ม motility oocyte ถูกตรวจสอบก่อนการปฏิสนธิmicroliters กี่ของหัวอสุจิได้เพิ่ม 100 มลถังกับแช่สารละลาย และคนใน 2 นาทีให้ปฏิสนธิตามBeiras และสโท Álvarez (2006) เปอร์เซ็นต์ของการปฏิสนธิแล้วคำนวณตรวจสอบการก่อตัวของเมมเบรนในปัจจุบันและใช้สำหรับชุดเท่ากับ N90% อัตราการปฏิสนธิรับโคลน ชุดประชุมเกณฑ์คุณภาพนี้ไม่ถูกละทิ้ง Blastulas ได้รับ โดยการบ่มในทะเลประดิษฐ์น้ำ (ASW เตรียมต่อ Lorenzo และ al., 2002), ในที่มืด ที่20 ° C สำหรับ 8 h และได้รับการเช็คเอาท์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ก่อนหน้าcryopreservation ทดลอง แช่สารละลายจากชุดเดียวกันถูกปฏิสนธิและนำทันทีในสอง larval แม่ถังสำหรับแต่ละชุดควบคุมการ วัฒนธรรม Microalgae ของ Tetraselmis suecica (Provasoli –Guillard แห่งชาติศูนย์สาหร่ายทะเลและ Microbia, CCMP904),ลแช Isocrysis galbana clon T-ISO (Provasoli – Guillard ศูนย์แห่งชาติสาหร่ายทะเล และ Microbia, CCMP1324), Chaetoceros จระเข้ (ECIMATชุด), Phaeodactilum tricornutum (คอลเลกชัน ECIMAT) และClosterium Cylindrotheca (คอลเลกชัน ECIMAT) ใช้ในระหว่างการทดลองได้จาก ECIMAT (Universidade de Vigo)วิธี cryopreservation ถูกดำเนินการตามวิธีที่อธิบายไว้ในสอาและ Paredes (2011) ปลิงทะเลโคลนมี cryopreserved ที่ระยะ blastula (8 h บ่มที่ 20 ° C), การชุดแทน (CPA) cryoprotecting ใช้ได้ 1.5 M dimethyl sulfoxide(Me2SO) + trehalose 0.04 M (ร) ML หนึ่งของ CPA ได้เพิ่ม 1 mL ของเอ็มบริโอระงับใน ASW ขั้นตอนการ equimolar 151 นาทีออกจากกัน (1:1 สุดท้ายเจือจาง), ที่ 19 ± 1 องศาเซลเซียส เราใช้เป็นโปรแกรมตู้ควบคุม (Cryologic Lty จำกัด ออสเตรเลีย) ทางลาดที่ระบายความร้อนเริ่มต้นใช้งานค้างไว้ที่ 4 ° C ใน 2 นาที และระบายความร้อนด้วยในอัตราแล้ว1 ° C min−1 เพื่อ −12 องศาเซลเซียส จุดนี้ มี seeded vials ในระหว่างการค้างไว้ 2 นาที ตาม ด้วยการทำความเย็นที่ 1 ° C min−1 เพื่อ −80 องศาเซลเซียส ตัวสุดท้ายกดค้างไว้ 2 นาทีถูกวางไว้ที่ −80 ° C และ vials ถูกโอนย้ายไปไนโตรเจนเหลวสำหรับการจัดเก็บ Thawing ทำ โดยแช่ลงในน้ำน้ำ 17 ± 1 ° C จนกว่าน้ำแข็งไม่อ่อน CPAs ถูกเอาออกแล้วด้วย ASW สะอาดใน 12 equimolar ขั้นตอน 1 นาทีห่างกันที่อุณหภูมิห้องสุดท้าย 19 ± 1 ° C และโคลนถูก rinsed ด้วย ASW สะอาดGametes จากสองชาย และหญิงคู่นั้นก็จะทำให้แต่ละข้าม: fertilizations แรกที่ผลิตภัณฑ์เป็นตัวควบคุมสดfertilizations สองที่ใช้ปกครองบรรทัดเดียว มี incubatedสำหรับ h 8 จนถึงระยะ blastula, cryopreserved และนำใน 24 ชมในไนโตรเจนเหลว blastulas ถูก thawed และโคลนได้ในที่สุดพร้อมเปิดตัวในถัง rearing larval ทำการศึกษานี้ออก โดยซ้ำสำหรับแต่ละครอสและการรักษาตัวอ่อนมีผลิตภัณฑ์สำหรับ 20 วัน จนกว่าพวกเขาเชี่ยวชาญ metamorphoseในถัง polypropylene cylindroconical 100 L ในวงจรปิดน้ำทะเลกรอง (FSW) (0.5 μm + อัลตราไวโอเลต), กับสามสมบูรณ์น้ำเปลี่ยนแปลงต่อสัปดาห์ (ตัวอ่อนถูกเก็บรวบรวม ด้วยตาข่าย 40 μm) ที่จำนวน 105 ตัวอ่อนต่อถังเริ่มต้นที่ incubated ที่ 19 ± 1 ° C มีความกำหนดการแสง 24 h (7.1 μE m−2 s−1), และถูกเลี้ยง ด้วยเทียบเท่า 40-80(อาหารตาม suecica ต. I. ลแช clon galvana T iso, C. จระเข้ และTricornutum P. ในจำนวนเทียบเท่าในน้ำหนักแห้งเซลล์ algalI. galbana จากวัน 0 – 7 40 เทียบเท่า เทียบเท่า 60 จนถึงวัน14 และ 80 จนถึงวัน 20) ตามที่อธิบายไว้ใน MullerFeuga และ al. et Casal (2011)al. ร้อยเอ็ด (2003)ระหว่างข้อมูลแม่ larval คอมไพล์วัดประสิทธิภาพ larval: รอดจำนวน (n = 100) และการวัดความยาว(สูงสุดขนาดของแต่ละบุคคลก่อน 35 โคลนรวม)7 วันก่อนวันถึงความสามารถ จาน Petri 10 ต่อการรักษามี inoculated กับ 15 mL ของ FSW (0.22 μm + รังสีอัลตราไวโอเลต)กลาง f/2 และ 5 mL ของ closterium ไดอะตอม benthonic C.ขึ้น biofilm จะใช้เป็น attractant ชำระสำหรับตัวอ่อนที่มีอำนาจอาหารถูก incubated ที่ 18 ° C และ 54.2 μE m−2 s−1 และมี rinsed ด้วย FSW เพื่อกำจัดเซลล์ที่ตายแล้วจากผิวก่อนหน้านี้กับการจ่ายเงินทดลองจุดเริ่มต้น หลังจาก 20 วันของ larvalแม่ 60 อำนาจตัวอ่อนต่อจานถูกนำมาใช้ ซึ่งได้รักษาใน semidarkness (0.5 μE m−2 s−1) ที่° C 18 กับเดียวอาหารยาของเทียบเท่า 50 และมีการตรวจสอบการชำระเงินทุกวันที่ 8 – 10 ต่างของการวิเคราะห์แบบทางเดียว (การวิเคราะห์ความแปรปรวน) ตามทดสอบเปรียบเทียบหลาย Bonferroni ได้ดำเนินการประเมินความแตกต่างระหว่างการรักษาใช้®โปรแกรมรุ่น 15.0 สถิติซอฟต์แวร์3. ผลลัพธ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.
วัสดุและวิธีผู้ใหญ่เม่นทะเลพีlividus ถูกเก็บในส่วนที่ด้านนอกของ
RIA เดโก้ (กาลิเซีย NW คาบสมุทรไอบีเรีย)
ระหว่างการสืบพันธุ์ตามธรรมชาติฤดูเก็บรักษาไว้ในตู้กับการทำงานกรองน้ำทะเลธรรมชาติ
(18 ± 2 ° C 35 ‰)
และได้รับการเลี้ยงดูที่มีความต้องการที่มีสาหร่ายสีเขียวสดอัลวาLactuca
เซลล์สืบพันธุ์ที่ได้รับโดยตรงจากอวัยวะเพศที่มีปิเปตปาสเตอร์หลังจากผ่าคู่เดียวของผู้ใหญ่สำหรับการทดสอบแต่ละ.
คุณภาพไข่และอสุจิเคลื่อนที่ถูกตรวจสอบก่อนที่จะมีการปฏิสนธิ
microliters กี่ของสเปิร์มที่ไม่มีสิ่งเจือปนที่ถูกเพิ่มเข้า 100
มิลลิลิตรกระบอกกับเซลล์ไข่และขยับเป็นเวลา 2 นาทีเพื่อให้การปฏิสนธิตามไป Beiras และซาโก-Álvarez (2006) ร้อยละของการปฏิสนธิที่คำนวณได้จากนั้นตรวจสอบการก่อตัวของเมมเบรนที่ปฏิสนธิและสำหรับกระบวนการเดียวที่มีอัตราการปฏิสนธิN90% ถูกนำมาใช้สำหรับการได้รับตัวอ่อน; สำหรับกระบวนการไม่ได้ประชุมเกณฑ์คุณภาพนี้ได้ถูกยกเลิก Blastulas ที่ได้รับจากการบ่มในเทียมทะเลน้ำ(ASW, จัดทำต่อไป. อเรนโซ, et al, 2002) ในความมืดที่อุณหภูมิ20 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 8 ชั่วโมงและได้รับการตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ก่อนที่การทดลองเก็บรักษา ไข่จากชุดเดียวกันได้รับการปฏิสนธิและแนะนำทันทีในสองถังอนุบาลสำหรับแต่ละควบคุมชุด วัฒนธรรมของสาหร่าย Tetraselmis suecica (Provasoli- Guillard ศูนย์แห่งชาติทางทะเลสาหร่ายและ Microbia, CCMP904) Isocrysis AFF galbana Clon T-ISO (Provasoli-Guillard ศูนย์แห่งชาติเพื่อทะเลสาหร่ายและMicrobia, CCMP1324) Chaetoceros gracilis (ECIMAT คอลเลกชัน) Phaeodactilum tricornutum (คอลเลกชัน ECIMAT) และCylindrotheca closterium (คอลเลกชัน ECIMAT) ที่ใช้ในระหว่างการทดลองมีให้โดยECIMAT (Universidade เดโก้). วิธีการเก็บรักษาได้ดำเนินการดังต่อไปนี้วิธีการที่อธิบายไว้ในวิจิตรและ Paredes (2011) ตัวอ่อน Sea Urchin ถูกแช่แข็งในระยะ blastula (8 ชั่วโมงบ่มที่ 20 ° C) ซึ่งเป็นตัวแทนcryoprotecting (CPA) รวมกันใช้ 1.5 M dimethyl sulfoxide (Me2SO) + 0.04 M ทรีฮาโล (TRE) หนึ่งของการแก้ปัญหามลสอบบัญชีรับอนุญาตที่ถูกเพิ่มเข้ามาใน 1 มิลลิลิตรของการระงับตัวอ่อนใน ASW ใน 15 ขั้นตอน equimolar 1 นาทีออกจากกัน (1: 1 เจือจางสุดท้าย) ณ วันที่ 19 ± 1 ° C เราใช้โปรแกรมแช่แข็งควบคุม (Cryologic Lty Ltd., ออสเตรเลีย) ทางลาดระบายความร้อนเริ่มต้นด้วยการไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีแล้วระบายความร้อนในอัตรา 1 ° C นาที 1 ถึง -12 องศาเซลเซียส ขวดที่จุดนี้เมล็ดในช่วง2 นาทีถือตามด้วยการระบายความร้อน ณ วันที่ 1 ° C นาที 1 ถึง -80 องศาเซลเซียส สุดท้ายถือของ 2 นาทีถูกวางไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสและขวดถูกย้ายไปไนโตรเจนเหลวสำหรับการจัดเก็บ ละลายได้ดำเนินการโดยการแช่เป็น 17 ± 1 ° C อาบน้ำจนน้ำแข็งละลาย CPAs ถูกถอดออกมาแล้วกับASW สะอาดใน 12 ขั้นตอน equimolar 1 นาทีออกจากกันที่อุณหภูมิห้อง19 ± 1 องศาเซลเซียสและตัวอ่อนที่ถูกล้างในที่สุดด้วยการทำความสะอาด ASW. เซลล์สืบพันธุ์จากสองคู่ชายและหญิงถูกนำมาใช้เพื่อให้แต่ละคนข้ามที่: fertilizations แรกที่ถูกเลี้ยง เป็นตัวควบคุมสด fertilizations ที่สองใช้สายผู้ปกครองเดียวกันถูกบ่มเป็นเวลา8 ชั่วโมงจนถึงขั้นตอน blastula, แช่แข็งและอนุรักษ์เป็นเวลา 24 ชั่วโมงในไนโตรเจนเหลวblastulas ถูกละลายและตัวอ่อนในที่สุดก็พร้อมที่จะถูกนำมาใช้ในรถถังอนุบาล การศึกษาครั้งนี้ได้ดำเนินการโดยที่ซ้ำกันสำหรับแต่ละข้ามและการรักษา. ตัวอ่อนได้รับการเลี้ยงดูเป็นเวลา 20 วันจนกว่าพวกเขาจะสามารถที่จะเปลี่ยนรูป, 100 ลิตรถังโพรพิลีน cylindroconical ในวงจรปิดของน้ำทะเลที่ผ่านการกรอง(FSW) (0.5 ไมครอน + อัลตราไวโอเลต) กับสามสมบูรณ์เปลี่ยนน้ำต่อสัปดาห์(ตัวอ่อนที่ถูกเก็บรวบรวมด้วยตาข่าย 40 ไมครอน) จำนวนเงินเริ่มต้น 105 ตัวอ่อนต่อถังบ่มที่ 19 ± 1 ° C มีกำหนดการแสงชั่วโมง24 (7.1 เมตรμE-2 s -1) และได้รับการเลี้ยงดูที่มี 40 ถึง 80 รายการเทียบเท่า (อาหารที่อยู่บนพื้นฐานของที suecica, I. AFF. galvana Clon T-ISO, ซี gracilis และพีtricornutum ในจำนวนของเซลล์สาหร่ายเทียบเท่าน้ำหนักแห้งI. galbana จากวันที่ 0-7 มี 40 รายการเทียบเท่า 60 รายการเทียบเท่าจนกว่าจะถึงวันที่14 และ 80 จนกระทั่ง วันที่ 20) ตามที่อธิบายไว้ใน Casal et al, (2011) และ MullerFeuga et al, . (2003) ในช่วงข้อมูลอนุบาลถูกรวบรวมในการวัดประสิทธิภาพการทำงานของตัวอ่อน: นับการอยู่รอด (n = 100) และการวัดความยาว (มิติสูงสุดของครั้งแรก 35 บุคคลตัวอ่อนรวม). เจ็ดวันก่อนที่จะถึงความสามารถ 10 จานเลี้ยงเชื้อต่อการรักษาถูกเชื้อ 15 มิลลิลิตร FSW (0.22 ไมโครเมตร + อัลตราไวโอเลต) กับ f / 2 ขนาดกลางและ 5 มิลลิลิตรของ benthonic ไดอะตอมซี closterium สร้างไบโอฟิล์มที่จะใช้เป็นดึงดูดสำหรับการตั้งถิ่นฐานของตัวอ่อนที่มีอำนาจ. อาหารถูกบ่มที่ 18 องศาเซลเซียสและ 54.2 μEม-2 s-1 และได้รับการล้างด้วยFSW เพื่อขจัดเซลล์ที่ตายแล้วออกจากพื้นผิวก่อนที่จะทดลองการตั้งถิ่นฐานจุดเริ่มต้น หลังจากวันที่ 20 ของตัวอ่อนที่เลี้ยง60 ตัวอ่อนที่มีอำนาจต่อจานถูกนำมาซึ่งได้รับการเก็บรักษาไว้ในSemidarkness (0.5 เมตรμE-2 s-1) ที่ 18 องศาเซลเซียสเดียวกับปริมาณอาหาร50 รายการเทียบเท่าและถูกตรวจสอบสำหรับการตั้งถิ่นฐานทุก8 10 วัน. การวิเคราะห์ทางเดียวความแปรปรวน (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบBonferroni สำหรับการเปรียบเทียบหลายได้ดำเนินการในการประเมินความแตกต่างระหว่างการรักษาที่ใช้รุ่นSPSS® 15.0 สถิติซอฟต์แวร์. 3 ผล

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
ผู้ใหญ่หอยทะเลหน้า lividus ถูกเก็บอยู่ในส่วนนอกของ
r í de Vigo ( Galicia NW คาบสมุทรไอบีเรีย ) ในช่วงฤดูสืบพันธุ์
ธรรมชาติ รักษาใน วาเรียเดินธรรมชาติกรองน้ำทะเล
( 18 ± 2 ° C , 35 ‰ ) และได้รับอาหารที่ความต้องการกับ สีเขียวสด สาหร่าย
อัลวาประสิทธิภาพ . gametes ได้อยู่หมัดด้วย
โดยตรงจากปาสเตอร์หลอดหลังจากการผ่าคู่เดียวของผู้ใหญ่ในแต่ละการทดลอง .
คุณภาพปานของอสุจิได้ถูกตรวจสอบก่อนที่จะมีการปฏิสนธิ
ไม่กี่ตัวเลขของอสุจิที่ถูกเจือปนถัง 100 ml
กับไข่และคนเป็นเวลา 2 นาที เพื่อให้ปุ๋ยตาม
เพื่อ beiras Saco - และ อัลบาเรซ ( 2006 ) เปอร์เซ็นต์ของการปฏิสนธิ
จากนั้นคำนวณตรวจสอบโครงสร้างของเยื่อหุ้มเซลล์ และชุดเดียว
ปฏิสนธิมีอัตราการปฏิสนธิร้อยละ 90 ใช้
ได้รับทารก ชุดประชุมคุณภาพ เกณฑ์นี้อยู่
ละทิ้ง blastulas ได้รับโดยบ่มในน้ำทะเล
เทียม ( ASW ที่เตรียมไว้ตาม Lorenzo et al . , 2002 ) , ในที่มืด ,
20 ° C 8 H และตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ก่อนหน้านี้

ก่อนการทดลอง ไข่จากชุดเดียวกันถูก fertilized
และแนะนำได้ทันทีในการเลี้ยงหนอนสองถังแต่ละ
ชุดควบคุม สาหร่ายวัฒนธรรมของเตตร้าเซลมีส suecica ( provasoli –
guillard แห่งชาติศูนย์สาหร่ายทะเลและ microbia ccmp904 , ) ,
isocrysis ด้ว .ตัวอ่อนหอยที่เลี้ยงด้วยโคลน t-iso ( provasoli – guillard แห่งชาติศูนย์
สาหร่ายทะเลและ microbia ccmp1324 , ) , Chaetoceros glandulifera ( ecimat
คอลเลกชัน ) , phaeodactilum tricornutum ( ecimat คอลเลกชัน ) และ
cylindrotheca คล ทีเรียม ( ecimat คอลเลกชัน ) ที่ใช้ในการทดลอง
มีให้โดย ecimat ( มหาวิทยาลัยเดอวีโก้ ) .
เนื่องจากวิธีการทำดังต่อไปนี้
และวิธีการอธิบายไว้ใน Bellas Paredes ( 2011 ) เม่นทะเลตัวอ่อน
ถูกตรวจสอบคุณภาพในขั้นตอนได้แก่ ( 8 H บ่มที่ 20 ° C )
cryoprotecting ตัวแทน ( CPA ) รวมกันใช้เป็น 1.5 M เต๊ะ
( me2so ) 0.04 M ( เทรฮาโลส ) 1 มิลลิลิตรของสารละลายเป็น CPA
1 มิลลิลิตรของตัวอ่อนแขวนลอยใน ASW ใน 15 ๆขั้นตอน
1 มินกัน ( 1 : 1 ( สุดท้าย ) ที่ 19 ± 1 ° Cเราใช้โปรแกรม
ควบคุมตู้แช่ ( cryologic lty . จำกัด , ออสเตรเลีย ) ความเย็นเริ่มด้วยทางลาด
ค้าง 4 ° C เป็นเวลา 2 นาที แล้วระบายในอัตรา
1 ° C มิน− 1 − 12 ° C ที่จุดนี้ขวดถูก seeded ในระหว่าง
2 นาทีค้าง ตามด้วยที่ 1 ° C เย็นมิน− 1 − 80 องศา C . สุดท้าย
ถือ 2 มินอยู่ที่ 80 องศา C และ บริษัท เวสเทิร์น ขวดถูกโอนไปยัง
ไนโตรเจนเหลวสำหรับการจัดเก็บการกระทำโดยการแช่
เป็น 17 ± 1 ° C น้ำอาบจนน้ำแข็งละลาย การใช้งานถูกลบออกแล้ว
สะอาด ASW 12 ขั้นตอนที่ 1 มินๆต่างหากที่อุณหภูมิห้อง
19 ± 1 ° C และตัวอ่อนที่ได้ล้างด้วย ASW สะอาด .
gametes จากสองชาย และหญิงคู่ ใช้ทำแยกแต่ละ
: fertilizations แรกเลี้ยงเป็นตัวควบคุมสด
2 fertilizations ใช้เส้นพ่อแม่เดียวกันถูกบ่ม
8 H จนได้แก่ขั้นตอนตรวจสอบคุณภาพและรักษา 24 H
ในไนโตรเจนเหลว และ blastulas ถูกละลายตัวอ่อนได้
พร้อมที่จะแนะนำในถังเลี้ยงหนอน . ศึกษา
โดยซ้ำสำหรับแต่ละข้ามและการรักษา .
~ i ) ที่เลี้ยง สำหรับ 20 วันจนสามารถที่จะเปลี่ยนใน 100 ลิตร , โพรพิลีน cylindroconical

ปิดวงจรของถังกรองน้ำ ( fsw ) ( 0.5 μ M อัลตราไวโอเลต ) ด้วย 3
น้ำสมบูรณ์การเปลี่ยนแปลงต่อสัปดาห์ ( หนอนในการเก็บรวบรวม 40 μเมตรตาข่าย )
ยอดเงินเริ่มต้น 105 ตัวต่อถังบ่มที่ 19 ± 1 ° C กับ H
24 ตารางแสง ( 7.1 μ e m s − 1 − 2

)ได้รับ 40 และ 80 เทียบเท่า
( อาหารจาก ต. suecica ผมด้ว . galvana Clon t-iso , C . glandulifera และ
P tricornutum ในจํานวนเซลล์เทียบเท่าน้ำหนักแห้งของสาหร่ายในตัวอ่อนหอยที่เลี้ยงด้วย

ฉันจากวันที่ 0 – 7 เทียบเท่ากับ 40 , 60 และ 80
เทียบเท่าจนถึงวันที่ 14 จนถึงวันที่ 20 ) ตามที่อธิบายไว้ใน casal et al . ( 2011 ) และ mullerfeuga
et al .
( 2003 )ในระหว่างการเลี้ยงหนอนข้อมูลที่ถูกรวบรวมเพื่อวัดประสิทธิภาพของหนอน
: การอยู่รอดนับ ( n = 100 ) และความยาววัด
( ขนาดสูงสุด 35 บุคคลแรกตัวอ่อน
รวม )
7 วันก่อนที่จะถึงความสามารถ 10 จานเลี้ยงเชื้อต่อรักษา
ปลูกเชื้อ 15 ml fsw ( 0.22 μ M อัลตราไวโอเลต )
F / 2 ) และ 5 มิลลิลิตรของ benthonic ไดอะตอม C
คล ทีเรียมการขึ้นรูปฟิล์มเพื่อใช้เป็นที่ดึงดูดสำหรับตัวอ่อนที่เชี่ยวชาญ .
อาหารที่อุณหภูมิ 18 องศา C และ 54.2 μ E m − 2 s − 1
ถูกล้างด้วย fsw เพื่อขจัดเซลล์ที่ตายแล้วออกจากพื้นผิวเดิม
เพื่อยุติการทดลองเริ่มจุด หลังจาก 20 วัน ดักแด้ การเลี้ยงตัวอ่อนที่มีต่อจาน 60

แนะนำซึ่งถูกรักษาใน semidarkness ( 0.5 μ E m − 2 s − 1
) ที่ 18 ° Cกับยาอาหารเดียว
50 เทียบเท่าและมีการตรวจสอบการตั้งถิ่นฐานทุก
8 – 10 วัน การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว ( ANOVA ) ตามด้วยการทดสอบเปรียบเทียบพหุคูณ บอนเฟอร์โรนีสำหรับ

มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินความแตกต่างระหว่างการรักษาโดยใช้โปรแกรมสำเร็จรูป SPSS สถิติที่®รุ่นเป็นซอฟต์แวร์
.
3 ผลลัพธ์