2.3. SDS-PAGE and Western blotting

2.3. SDS-PAGE and Western blotting of the expressed proteins
Each frozen cell pellet collected at different time points was
resuspended and lysed with 400 L of Cell Lytic B cell lysis reagent
for ∼10 min. Only the samples collected at 0, 2, 4, 5, 6 h were used
for the analysis. The lysed cells were then centrifuged at 13,000 x g
for 5 min and the insoluble (pellet) and soluble (supernatant) fractions
were separated. The insoluble fractions were resuspended in
100 L of 2x Tris-Glycine SDS sample loading buffer (Life Technologies,
Cat. No.: LC2676). 9 L of these resuspended samples
were combined with 1 L of NuPAGE reducing agent (10x) (Life
Technologies, Cat. No.: NP0004). The soluble samples (4 L) were
combined with 5 L loading buffer and 1 L reducing agent. All
samples were then heated at 85 ◦C for 2 min and loaded onto
4–20% gradient Novex Tris-Glycine gels (Life Technologies, Cat.
No.: EC60252BX5). The gel was run for ∼1.5 hrs at 125 constant
voltage. Upon completion, the proteins on the gels were transferred
onto nitrocellulose membranes on a XCell IITM Blot Module
(Life Technologies, Cat. No.: EI0002) according to manufacturer’s
guidelines. The proteins on the nitrocellulose membranes were
detected using WesternBreeze® chromogenic detection kit (Life
Technologies, Cat. No.: WB7103) according to the manufacturer’s
instructions using Anti-Xpress mouse monoclonal antibody (LifeTechnologies, Cat. No.: R910-25) as the primary antibody at a concentration
of 0.5 g/mL.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 ระบบ SDS-PAGE และซับตะวันตกของโปรตีนแสดง
แต่ละตะกอนเซลล์แช่แข็งเก็บที่จุดเวลาที่แตกต่างกันถูก
resuspended และ lysed 400 ลิตรมือถือ lytic B เซลล์สลายสาร
สำหรับ ~ 10 นาที เพียงตัวอย่างที่เก็บรวบรวมได้ที่ 0, 2, 4, 5, 6 ชั่วโมงถูกนำมาใช้
ในการวิเคราะห์ เซลล์ lysed ถูกปั่นแล้วที่ 13,000 XG
เป็นเวลา 5 นาทีและไม่ละลายน้ำ (เม็ด) และละลายน้ำได้ (ใส) เศษส่วน
ถูกแยกออก เศษส่วนที่ไม่ละลายน้ำถูก resuspended ใน
100 ลิตร 2x Tris-Glycine SDS ตัวอย่างโหลดบัฟเฟอร์ (ไลฟ์เทคโนโลยีส์,
Cat. No .: LC2676) 9 ลิตรตัวอย่าง resuspended เหล่านี้
ถูกรวมกับ 1 ลิตรของ NuPAGE รีดิวซ์ (10x) (ชีวิต
Technologies, Cat. No .: NP0004) กลุ่มตัวอย่างที่ละลายน้ำได้ (4 ลิตร) ถูก
รวมกับ 5 ลิตรโหลดบัฟเฟอร์และ 1 ลิตรรีดิวซ์ ทั้งหมด
ตัวอย่างถูกความร้อนแล้วที่ 85 ◦Cเป็นเวลา 2 นาทีและโหลดลง
4-20% ลาดเจล Novex Tris-Glycine (ไลฟ์เทคโนโลยีส์, แมว.
No .: EC60252BX5) เจลก็วิ่งสำหรับ ~1.5 นที่ 125 คงที่
แรงดันไฟฟ้า เมื่อเสร็จสิ้นโปรตีนในเจลที่มีการถ่ายโอน
ไปยังเยื่อ nitrocellulose บน XCell IITM เปรอะเปื้อนโมดูล
(ไลฟ์เทคโนโลยีส์, แมว. No .: EI0002) ตามที่ผู้ผลิตของ
แนวทาง โปรตีนในเยื่อ nitrocellulose ถูก
ตรวจพบโดยใช้ชุดตรวจจับWesternBreeze® chromogenic (ชีวิต
Technologies, Cat. No .: WB7103) ตามที่ผู้ผลิต
คำแนะนำการใช้ป้องกัน Xpress เมาส์โมโนโคลนอลแอนติบอดี (LifeTechnologies, แมว. No .: R910-25) ในฐานะ แอนติบอดีหลักที่ความเข้มข้น
0.5 g / ml

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การศึกษา และ Western blotting ของแสดงออกโปรตีนแช่แข็งแต่ละเซลล์เม็ดเก็บที่จุดเวลาที่แตกต่างกัน คือresuspended lysed 400 ลิตรและมีการสลายเซลล์ใช้เซลล์เชื้อกลุ่มบีสำหรับ∼ 10 นาทีเพียงจำนวนที่ 0 , 2 , 4 , 5 , 6 ชั่วโมงใช้สำหรับการวิเคราะห์ เซลล์ไฟฟ้าที่ lysed แล้ว 13 , 000 x กรัมเป็นเวลา 5 นาทีและไม่ละลาย ( เม็ด ) และปริมาณ ( น่าน ) เศษส่วนต้องแยกจากกัน เศษส่วนที่ไม่ละลายน้ำเป็น resuspended ใน100 ลิตร 2x โดย SDS โหลดตัวอย่างที่มีบัฟเฟอร์ ( เทคโนโลยีชีวิตแมว หมายเลข : lc2676 ) 9 l resuspended ตัวอย่างเหล่านี้ร่วมด้วย 1 ลิตร nupage มุบ ( ล้านหุ้น ) ( ชีวิตเทคโนโลยี , แมว หมายเลข : np0004 ) ตัวอย่างที่ ( 4 ลิตร ) คือรวมกับ 5 ลิตร 1 ลิตรโหลดบัฟเฟอร์ และการเจ้าหน้าที่ ทั้งหมดจำนวนความร้อนแล้ว 85 ◦ C 2 นาทีและโหลดลง4 – 20 % ทั้งนี้การ novex ไกลซีนเจล ( เทคโนโลยี ชีวิตแมวหมายเลข : ec60252bx5 ) เจลที่ใช้สำหรับ∼ 125 คงที่ 1.5 ชั่วโมงแรงดันไฟฟ้า เมื่อเสร็จสิ้น , โปรตีนบนเจล คือลงบน xcell iitm เมมเบรนไนโตรลบโมดูล( เทคโนโลยี ชีวิตแมว หมายเลข : ei0002 ) ตามที่ผู้ผลิตแนวทาง โปรตีนในเยื่อแผ่นแบบไนโตรการตรวจสอบการสนทนาผ่านข้อความโต้ตอบแบบทันที westernbreeze ®ชุดตรวจ ( ชีวิตเทคโนโลยี , แมว หมายเลข : wb7103 ) ตามที่ผู้ผลิตคําแนะนําการใช้โมโนโคลนอล แอนติบอดีต่อต้าน Xpress ( แมว lifetechnologies , . หมายเลข : r910-25 ) เป็นแอนติบอดีที่ความเข้มข้นของหลัก0.5 กรัม / มิลลิลิตร