2. Materials and methods2.1. Chemic

2. Materials and methods
2.1. Chemicals and raw materials
Polyethylene glycol (PEG), sodium dodecyl sulfate (SDS), bovine serum albumin (BSA), casein and l-cysteine were obtained from Fluka (Buchs, Switzerland). Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 and R-250 were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Ammonium sulfate ((NH4)2SO4), trichloroacetic acid (TCA) and other chemicals with analytical grade were obtained from Merck (Darmstadt, Germany).

Carica papaya fruits were harvested from 3 to 4 months maturation at Mae Fah Luang University, Chiang Rai, Thailand.

2.2. Extraction of proteases from papaya peels
Papaya peels were prepared by peeling the fruits and cutting them into small pieces. The peels were dried in a tray-dryer at 55 oC until 90% (w/w) of moisture content was removed according to previously reported [1]. The fresh or dried papaya peels were ground in a blender before mixed with the extraction media (H2O and 50 mM phosphate buffers, pH 7.0) at a ratio of 1:9 (w/v), and it was then let stand for 30 min. The extracted samples were then centrifuged at 9000 × g at 4 °C for 20 min. The obtained supernatant was filtered through a Whatman paper No. 1. This sample was referred to as the “crude extract” and used for further experiment.

2.3. Three-phase partitioning (TPP)
2.3.1. Effect of the ratio of crude extract to t-butanol on protease partitioning
The TPP was carried out as described by Roy and Gupta [8]. The effect of the ratio of papaya peel crude extract to t-butanol was studied. Firstly, the crude extract was added with t-butanol at ratios of 1.0:0.5, 1.0:1.0, 1.0:1.5, and 1.0:2.0 (v/v) of sample to t-butanol at 40% (NH4)2SO4. The ratio of crude extract to t-butanol that gave the highest enzyme recovery was chosen for further study.

2.3.2. Effect of ammonium sulfate concentration on protease partitioning
The effect of (NH4)2SO4 concentrations at 20, 30, 40 and 50% (w/v) were also investigated by using the ratio of crude extract to t-butanol (with the highest enzyme recovery) obtained from Section 2.3.1. The bottom phase and the interphase were collected and dialyzed against water overnight at 4 °C before the analysis of proteolytic activity and protein content. The salt concentration providing the highest protease recovery was chosen for further study.

2.3.3. Optimization of TPP for recovery of proteases from papaya peel extract
The phase of the first TPP that gave the highest activity recovery was chosen as the starting material for optimization in the second TPP. The selected phase (without dialysis) was mixed with the t-butanol in a ratio of 1.0:0.5 and (NH4)2SO4 was added to the mixture to obtain the final concentrations of 50, 55 and 60% (w/v). The phases obtained were analyzed as previously mentioned.

2.4. Caseinolytic activity and protein determinations
The caseinolytic activity of the enzyme sample was performed by following the method described in Chaiwut et al. [1]. The protein concentration in the sample was measured by the Bradford method [10], using BSA as a protein standard.

2.5. SDS-PAGE and protease activity staining
SDS-PAGE of the samples was performed according to the method of Laemmli [11] with slight modification. Protein samples (10 and 2 μg for CBB and activity staining, respectively) were loaded onto the electrophoresis gel (20 mA/gel) made of 4% stacking and 15% separating gels. After electrophoresis, the gel was then stained overnight with staining solutions (0.02% (w/v) CBB R-250 in 50% (v/v) methanol, and 7.5% (v/v) acetic acid). The proteases separated on the SDS-gel were verified by using activity staining as done in Garcia-Carreno et al. [12]. The development of a clear band on the dark background indicated the caseinolytic activity of proteases from papaya peels.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สารเคมีและวัตถุดิบ
Polyethylene glycol (PEG), โซเดียมซัลเฟต dodecyl (SDS), วัว serum albumin (บีเอสเอ), เคซีน และ l-cysteine ได้รับมาจาก Fluka (Buchs สวิตเซอร์แลนด์) Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 และ R-250 ที่ซื้อจาก บริษัทเคมีซิก (เซนต์หลุยส์ MO สหรัฐอเมริกา) แอมโมเนียซัลเฟต ((NH4) 2SO4), กรด trichloroacetic (TCA) และสารเคมีอื่น ๆ ด้วยเกรดวิเคราะห์ได้รับมาจากบริษัทเมอร์ค (ดาร์มส เยอรมนี)

ผลไม้มะละกอ Carica ถูกเก็บเกี่ยวจาก 3 ไป 4 เดือนพ่อแม่ที่มหาวิทยาลัยแม่ฟ้าหลวง จังหวัดเชียงราย ประเทศไทย.

2.2 Proteases สกัดจากมะละกอ peels
peels มะละกอได้เตรียมผลไม้ปอกเปลือก และตัดให้เป็นชิ้นเล็ก ๆ Peels ถูกอบแห้งในถาดอบที่ 55 องศาเซลเซียสจนกว่า 90% (w/w) ของชื้นถูกเอาตามรายงานก่อนหน้านี้ [1] มะละกอสด หรือแห้ง peels ถูกพื้นในเบลนเดอร์ก่อนผสมกับแยกสื่อ (บัฟเฟอร์ฟอสเฟต H2O และ 50 มม. ค่า pH 7.0) ในอัตราส่วน 1:9 (w/v), และมันได้แล้วให้ถึง 30 นาที ตัวอย่างที่แยกได้แล้ว centrifuged ที่ 9000 × g ที่ 4 ° C สำหรับ 20 นาที Supernatant ได้รับถูกกรองผ่าน Whatman กระดาษหมายเลข 1 อย่างนี้เรียกว่า "สารสกัดหยาบ" และใช้สำหรับต่อทดลอง

2.3 3 เฟสแบ่งพาร์ทิชัน (TPP)
2.3.1 ผลของอัตราส่วนของดิบแยก t-บิวทานอบนพาร์ทิชันรติเอส
TPP ได้ดำเนิน ตามรอยทางกุปตา [8] มีศึกษาผลของอัตราส่วนของสารสกัดหยาบเปลือกมะละกอกับบิวทานอ t ประการแรก สารสกัดหยาบถูกเพิ่มกับ t-บิวทานอที่อัตราส่วนของ 1.0:0.5, 1.0:1.0, 1.0:1.5 และ 1.0:2.0 (v/v) ของตัวอย่างกับ t-บิวทานอที่ 40% (NH4) 2SO4 อัตราส่วนของสารสกัดหยาบให้ t-บิวทานอที่ให้กู้เอนไซม์สูงสุดถูกเลือกให้ศึกษาต่อ

2.3.2. ผลของความเข้มข้นของแอมโมเนียมซัลเฟตในพาร์ทิชันรติเอส
ยังมีสอบสวนผลของ (NH4) 2SO4 ความเข้มข้นที่ 20, 30, 40 และ 50% (w/v) โดยใช้อัตราส่วนของสารสกัดหยาบกับบิวทานอ t (มีเอนไซม์สูงกู้คืน) ได้จากหัวข้อ 2.3.1 ระยะล่างและ interphase ที่ถูกรวบรวม และ dialyzed กับน้ำค้างคืนที่ 4 ° C ก่อนวิเคราะห์เนื้อหากิจกรรมและโปรตีน proteolytic ความเข้มข้นเกลือให้กู้คืนรติเอสสูงสุดถูกเลือกสำหรับการเพิ่มเติมศึกษา

2.3.3 เพิ่มประสิทธิภาพของ TPP การกู้คืน proteases จากเปลือกมะละกอสารสกัด
ระยะของ TPP แรกกู้คืนกิจกรรมสูงสุดที่ถูกเลือกเป็นวัสดุเริ่มต้นสำหรับการปรับใน TPP ที่สอง ขั้นตอนการเลือก (ไม่ มีหน่วย) ที่ผสมกับ t-บิวทานอในอัตราส่วนของ 1.0:0.5 และ (NH4) 2SO4 ได้เพิ่มส่วนผสมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 50, 55 และ 60% (w/v) ระยะที่ได้ถูกวิเคราะห์กล่าวว่า ก่อนหน้านี้

2.4 กิจกรรมและโปรตีน determinations Caseinolytic
caseinolytic กิจกรรมของเอนไซม์ตัวอย่างทำตามวิธีที่อธิบายใน Chaiwut et al. [1] ความเข้มข้นของโปรตีนในตัวอย่างถูกวัด โดยวิธีแบรดฟอร์ด [10], การใช้บีเอสเอเป็นมาตรฐานโปรตีน

2.5 หน้า SDS และย้อมสีกิจกรรมรติเอส
SDS-หน้าของตัวอย่างที่ดำเนินการตามวิธีการของ Laemmli [11] มีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ตัวอย่างโปรตีน (10 และ 2 μg CBB และกิจกรรมย้อมสี ตามลำดับ) ถูกโหลดลงในเจ electrophoresis (20 mA/เจล) ทำซ้อน 4% และ 15% แยกเจ หลังจาก electrophoresis เจมีแล้วสีค้างคืน ด้วยโซลูชั่น (0 การย้อมสี02% (w/v) 250 CBB R ในเมทานอล 50% (v/v) และกรดอะซิติก 7.5% (v/v)) Proteases คั่นใน SDS-เจถูกตรวจสอบ โดยใช้กิจกรรมย้อมสีเป็นทำในการ์เซีย Carreno et al. [12] การพัฒนาของวงใสบนพื้นหลังสีเข้มระบุกิจกรรม caseinolytic ของ proteases จากมะละกอ peels

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2 วัสดุและวิธีการ
2.1 สารเคมีและวัตถุดิบ
เอทิลีนไกลคอล (PEG) โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS), วัวซีรั่มอัลบูมิ (บีเอสเอ), เคซีนและ L-cysteine ​​ที่ได้รับจาก Fluka (Buchs วิตเซอร์แลนด์) Coomassie สดใสสีฟ้า (CBB) G-250 และ R-250 ที่ซื้อมาจากซิกเคมิคอล จำกัด (เซนต์หลุยส์, MO, USA) แอมโมเนียมซัลเฟต ((NH4) 2SO4) ไตรคลอโรกรด (TCA) และสารเคมีอื่น ๆ ที่มีการวิเคราะห์คะแนนที่ได้รับจากเมอร์ (Darmstadt, เยอรมนี) ฝากผลไม้มะละกอเก็บเกี่ยว 3-4 เดือนที่สุกที่มหาวิทยาลัยแม่ฟ้าหลวงเชียงราย ประเทศไทย2.2 การสกัดโปรตีเอสจากเปลือกมะละกอเปลือกมะละกอถูกจัดทำขึ้นโดยการปอกเปลือกผลไม้และตัดพวกเขาเป็นชิ้นเล็ก ๆ เปลือกแห้งในถาดเครื่องเป่าที่ 55 องศาเซลเซียสจน 90% (w / w) ความชื้นจะถูกลบออกตามที่รายงานก่อนหน้านี้ [1] สดหรือแห้งเปลือกมะละกอมาบดในเครื่องปั่นก่อนที่จะผสมกับสื่อการสกัด (H2O และ 50 มิลลิบัฟเฟอร์ฟอสเฟต pH 7.0) ในอัตรา 1: 9 (w / v) และจากนั้นก็ให้ยืน 30 นาที . ตัวอย่างที่สกัดได้จากนั้นหมุนเหวี่ยงที่ 9000 ×กรัมที่ 4 ° C เป็นเวลา 20 นาที สารละลายที่ได้ถูกกรองผ่านกระดาษที่เบอร์ 1 ตัวอย่างนี้ถูกเรียกว่า "สารสกัด" และใช้สำหรับการทดลองต่อไป2.3 แบ่งสามเฟส (TPP) 2.3.1 ผลกระทบของอัตราส่วนของสารสกัดหยาบที่ t-บิวทานอในน้ำย่อยแบ่งTPP ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยรอยและแคนด์ [8] ผลกระทบของอัตราส่วนของเปลือกมะละกอสารสกัดเพื่อ t-บิวทานอได้รับการศึกษา ประการแรกสารสกัดหยาบที่ถูกเพิ่มเข้ามาด้วยเสื้อบิวทานอที่อัตราส่วน 1.0: 0.5, 1.0: 1.0, 1.0: 1.5 และ 1.0: 2.0 (v / v) เป็นตัวอย่างที่ t-บิวทานอที่ 40% (NH4) 2SO4 อัตราส่วนของสารสกัดหยาบที่ t-บิวทานอที่ให้การฟื้นตัวของเอนไซม์สูงสุดได้รับเลือกสำหรับการศึกษาต่อ2.3.2 ผลของความเข้มข้นของแอมโมเนียมซัลเฟตในน้ำย่อยแบ่งผลของความเข้มข้น (NH4) 2SO4 ที่ 20, 30, 40 และ 50% (w / v) ได้รับการตรวจสอบโดยใช้อัตราส่วนของสารสกัดหยาบไป t-บิวทานอ (ตามการฟื้นตัวของเอนไซม์สูงสุด ) ที่ได้รับจากมาตรา 2.3.1 ช่วงล่างและระหว่างเฟสถูกเก็บรวบรวมและ dialyzed กับน้ำค้างคืนที่ 4 ° C ก่อนที่จะวิเคราะห์กิจกรรมของโปรตีนและปริมาณโปรตีน ความเข้มข้นของเกลือให้การฟื้นตัวของเอนไซม์สูงสุดได้รับเลือกสำหรับการศึกษาต่อ2.3.3 การเพิ่มประสิทธิภาพของ TPP สำหรับการกู้คืนของโปรตีเอสจากเปลือกมะละกอสารสกัดจากขั้นตอนแรกของ TPP ที่ให้การฟื้นตัวของกิจกรรมสูงสุดได้รับเลือกให้เป็นวัสดุเริ่มต้นสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพในวินาที TPP ขั้นตอนการเลือก (โดยไม่ต้องฟอกไต) ผสมกับ t-บิวทานอในอัตราส่วน 1.0: 0.5 และ (NH4) 2SO4 ถูกบันทึกอยู่ในส่วนผสมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 50, 55 และ 60% (w / v) ขั้นตอนที่ได้มาวิเคราะห์ตามที่เคยกล่าวถึง2.4 กิจกรรมที่ชอบเค็มและโปรตีนพิจารณากิจกรรมที่ชอบเค็มของตัวอย่างเอนไซม์ถูกดำเนินการตามวิธีการที่อธิบายไว้ในชัยวุฒิและคณะ [1] ความเข้มข้นของโปรตีนในตัวอย่างที่ถูกวัดโดยวิธี Bradford [10] โดยใช้บีเอสเอเป็นโปรตีนมาตรฐาน2.5 SDS-PAGE และกิจกรรมโปรติเอสคราบSDS-PAGE ของกลุ่มตัวอย่างที่ได้ดำเนินการตามวิธีการของ Laemmli [11] ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ตัวอย่างโปรตีน (10 ไมโครกรัมและ 2 สำหรับ CBB และการย้อมสีกิจกรรมตามลำดับ) ถูกโหลดไปยังเจลอิเล็ก (20 mA / เจล) ที่ทำจาก 4% ซ้อนและ 15% เจลแยก หลังจากที่อิเลคเจลเป็นสีแล้วในชั่วข้ามคืนด้วยโซลูชั่นการย้อมสี (0.02% (w / v) CBB R-250 ใน 50% (v / v) เมทานอลและ 7.5% (v / v) กรดอะซิติก) โปรตีเอสที่แยกออกจากกัน SDS เจลได้รับการตรวจสอบโดยใช้การย้อมสีเป็นกิจกรรมที่ทำในการ์เซีย Carreno และคณะ [12] การพัฒนาของวงดนตรีที่ชัดเจนเกี่ยวกับพื้นหลังสีดำที่ระบุกิจกรรมที่ชอบเค็มของโปรตีเอสจากเปลือกมะละกอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . เคมีภัณฑ์และวัตถุดิบ
polyethylene glycol ( PEG ) , โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS ) อัลบูมิน ( BSA ) เคซีน แอลซิสเตอีน ได้จาก fluka ( buchs , สวิตเซอร์แลนด์ ) เหล่านี้น่าจะเป็นสีฟ้าสดใส ( cbb ) และ g-250 r-250 ซื้อมาจาก Sigma Chemical Co . ( St . Louis , MO , USA ) แอมโมเนียม ซัลเฟต ( ( NH4 ) 2so4 )กรดไตรคลอโรอะซิติก ( TCA ) และสารเคมีอื่น ๆ กับเกรดที่ได้รับการวิเคราะห์จากเมอร์ค ( ดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี ) .

มะละกอผลเก็บเกี่ยวจาก 3 ไป 4 เดือน วุฒิภาวะ มหาวิทยาลัยแม่ฟ้าหลวง , เชียงราย , ไทย .

. . สกัดจากมะละกอเพื่อเปลือก
มะละกอเปลือกเตรียมปอกผลไม้และตัดให้เป็นชิ้นเล็กๆเปลือกแห้งในเครื่องอบแห้งแบบถาดที่ 55 องศาเซลเซียส จนถึง 90 % ( w / w ) ของความชื้นจะถูกลบออกตามที่เคยรายงาน [ 1 ] สดหรือแห้งเปลือกมะละกอบดในเครื่องปั่นก่อนผสมกับการสกัดสื่อ ( H2O และ 50 มิลลิเมตร ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 ) ในอัตราส่วน 1 : 9 ( w / v ) และก็ให้ยืนเป็นเวลา 30 นาทีสกัดไฟฟ้าจำนวนแล้วที่ 9000 × g 4 °องศาเซลเซียส 20 นาที ได้นำถูกกรองผ่าน whatman กระดาษเปล่า 1 ตัวอย่างนี้จะถูกเรียกว่า " แยก " น้ำมันที่ใช้สำหรับการทดลองต่อไป

2.3 สามขั้นตอนการแบ่งพาร์ติชัน ( TPP )
2.3.1 . ผลของอัตราส่วนของสารสกัดหยาบเพื่อ t-butanol บน CC
ตินายกรัฐมนตรีได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยรอย Gupta [ 8 ] ผลของอัตราส่วนของเปลือกมะละกอดิบ สารสกัดจาก t-butanol ศึกษา ประการแรก สารสกัดเพิ่มด้วย t-butanol อัตราส่วนของ 1.0:0.5 1.0:1.0 1.0:1.5 , , , และ 1.0:2.0 ( v / v ) ตัวอย่าง t-butanol 40% ( NH4 ) 2so4 . อัตราส่วนของ t-butanol สกัดเพื่อให้เอนไซม์สูงสุดการกู้คืนถูกเลือกสำหรับการศึกษาเพิ่มเติม

2.3.2 . ผลของแอมโมเนียม ซัลเฟตความเข้มข้นในการผลติ
( NH4 ) 2so4 ความเข้มข้น 20 , 30 , 40 และ 50 % ( w / v ) ได้ถูกศึกษาโดยการใช้อัตราส่วนของสารสกัดหยาบเพื่อ t-butanol ( กับการฟื้นตัวของเอนไซม์สูงสุด ) ที่ได้จากส่วน 2.3.1 .ขั้นตอนด้านล่างและอินเตอร์เฟสกับน้ำที่ผ่านการเก็บรวบรวมและค้างคืนที่ 4 ° C ก่อนการวิเคราะห์กิจกรรมของโปรตีนและโปรตีน . ความเข้มข้นเกลือให้กู้คืนโปรสูงสุดถูกเลือกสำหรับการศึกษาเพิ่มเติม

2.3.3 . การเพิ่มประสิทธิภาพของ TPP สำหรับการกู้คืนของ proteases จากมะละกอสารสกัดเปลือก
ขั้นตอนแรกของนายกรัฐมนตรี ที่ให้กิจกรรมการกู้คืนสูงสุดได้รับเลือกให้เป็นวัสดุเริ่มต้นสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพใน TPP วินาที ขั้นตอนการเลือก ( โดยไม่ต้องฟอกไต ) ผสมกับ t-butanol ในอัตราส่วน 1.0:0.5 และ ( NH4 ) 2so4 คือเพิ่มการผสมเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้าย 50 , 55 และ 60 % ( w / v ) ขั้นตอนที่ 1 วิเคราะห์ตามที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้

2.4 .caseinolytic กิจกรรมและใช้โปรตีน
กิจกรรม caseinolytic ของเอนไซม์ตัวอย่างการปฏิบัติตามวิธีการที่อธิบายไว้ในชัยวุฒิ et al . [ 1 ] ระดับโปรตีนในตัวอย่างถูกวัดโดยวิธี Bradford [ 10 ] ที่ใช้ BSA เป็นโปรตีนมาตรฐาน

2.5 ใช้เอนไซม์ protease activity staining
การศึกษาของกลุ่มตัวอย่างมีการปฏิบัติตามวิธีการของ laemmli [ 11 ] กับการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ตัวอย่างโปรตีน ( 10 กรัมและ 2 μ cbb และกิจกรรมการศึกษา ตามลำดับ ) และโหลดลงบนเจลอิเลคโตรโฟรีซีส ( 20 MA / เจล ) ทำให้ 4 % ซ้อนและ 15% แยกเจล หลังจากอิเล็กเจลก็เปื้อนค้างคืนกับการย้อมสี โซลูชั่น ( 002 % ( w / v ) cbb r-250 50 % ( v / v ) เมทานอล และ 7.5 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) กรดอะซิติก ) ใช้เพื่อแยกบน SDS เจลถูกตรวจสอบโดยการใช้กิจกรรมการทำอะไรในการ์เซีย carreno et al . [ 12 ] การพัฒนาวงใสบนพื้นหลังสีเข้ม พบกิจกรรม caseinolytic ของ proteases จากเปลือกมะละกอ