2.11. Cytosol/membrane fractionatio

2.11. Cytosol/membrane fractionation
Thoracic aortas were homogenized in lysis buffer containing 50 mM Tris–HCl (pH 7.4), 2.5 mM EDTA, 5 mM EGTA, and protease inhibitor. Homogenates were centrifuged at 100,000 × g for 1 h, at 4 °C. The supernatant (cytosolic fraction) was collected. The pellet, containing the particulate fraction, was resuspended in lysis buffer containing 1% Triton X-100 and centrifuged at 10,000 × g for 10 min at 4 °C. The resultant supernatant collected (membrane-enriched fraction) was used as described above. Membranes were then incubated with a specific antibody for RhoA (diluted 1:1000, sc-418, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA). The protocol for the validation of membrane and cytosolic fractions was previously published [21].

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.11 เซลล์ / เมมเบรนแยก
aortas ทรวงอกถูกปั่นในบัฟเฟอร์สลายที่มี 50 มิลลิ Tris-HCl (pH 7.4) 2.5 มิลลิ EDTA 5 มิลลิ EGTA และยับยั้งโปรติเอส homogenates ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 100,000 ×กรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 4 ° C สารละลาย (cytosolic ส่วน) ที่ถูกเก็บรวบรวม เม็ดมีส่วนอนุภาคที่ถูก resuspended ในบัฟเฟอร์สลายที่มี 1% Triton X-100 และหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส สารละลายที่เก็บรวบรวมผล (ส่วนเมมเบรนที่อุดมด้วย) ถูกนำมาใช้อธิบายไว้ข้างต้น เยื่อถูกบ่มแล้วกับแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ RhoA (ปรับลด 1: 1000, SC-418 ซานตาครูซเทคโนโลยีชีวภาพ, ดัลลัสเท็กซัสสหรัฐอเมริกา) โปรโตคอลสำหรับการตรวจสอบของเมมเบรนและ cytosolic เศษส่วนที่ถูกเผยแพร่ก่อนหน้านี้ [21]

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.11 . PDF / เมมเบรน (
aortas ทรวงอกเป็นโฮโมในการสลายบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 50 มม. โดย– HCl ( pH 7.4 ) , 2.5 mM EDTA , หน่วย 5 มิลลิเมตร และ protease inhibitor . homogenates เป็นระดับที่ 100000 × g 1 H , 4 ° C ( cytosolic นำเศษส่วน ) คือการเก็บรวบรวม เม็ดประกอบด้วยฝุ่นละออง , เศษ ,คือ resuspended ในการสลายบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 1% Triton X-100 ไฟฟ้าที่ 10 × G สำหรับ 10 นาทีที่ 4 องศา ซึ่งนำเก็บ ( Membrane อุดมเศษส่วน ) ใช้ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น เยื่อ แล้วบ่มด้วยแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ rhoa ( เจือจาง 000 sc-418 Santa Cruz , เทคโนโลยีชีวภาพ , ดัลลัส , เท็กซัส , สหรัฐอเมริกา )โปรโตคอลการตรวจสอบของเมมเบรนและเศษส่วน cytosolic เคยตีพิมพ์ [ 21 ] .