The bicinchoninic acid (BCA) assay

The bicinchoninic acid (BCA) assay is available in kit form from Pierce (Rockford, Ill.). This procedure is very applicable to microtiter plate methods. The BCA is used for the same reasons the Lowry is used. Stoscheck (1990) has suggested that the BCA assay will replace the Lowry because it requires a single step, and the color reagent is stable under alkaline conditions.
Both a standard assay for concentrated proteins and a micro assay for dilute protein solutions are described below.
Principle
BCA serves the purpose of the Folin reagent in the Lowry assay, namely to react with complexes between copper ions and peptide bonds to produce a purple end product. The advantage of BCA is that the reagent is fairly stable under alkaline conditions, and can be included in the copper solution to allow a one step procedure. A molybdenum/tungsten blue product is produced as with the Lowry.
Equipment
In addition to standard liquid handling supplies a visible light spectrophotometer is needed with transmission set to 562 nm. Glass or polystyrene (cheap) cuvettes may be used.
Procedure 1 (standard assay)
Reagents
1. Reagent A: 1 gm sodium bicinchoninate (BCA), 2 gm sodium carbonate, 0.16 gm sodium tartrate, 0.4 gm NaOH, and 0.95 gm sodium bicarbonate, brought to 100 ml with distilled water. Adjust the pH to 11.25 with 10 M NaOH.
2. Reagent B: 0.4 gm cupric sulfate (5 x hydrated) in 10 ml distilled water.
3. Standard working solution (SWR): Mix 100 volumes reagent A with 2 volumes reagent B.
4. The stock solutions are stable. The working solution is stable for 1 week and should be green.
Assay
1. Prepare samples containing 0.2 to 50 micrograms protein in microliters.
2. Add 1 ml SWR to each 20 microliters sample and mix. Incubate 30 min. at 60 degrees C.
3. Cool the samples and read at 562 nm. Color will be stable for at least one hour.
Procedure 2 (micro assay)
Reagents
1. Reagent A: 8 gm sodium carbonate monohydrate, 1.6 gm sodium tartrate, brought to 100 ml with distilled water. Adjust the pH to 11.25 with 10 M NaOH.
2. Reagent B: 4 gm BCA in 100 ml distilled water.
3. Reagent C: 0.4 gm cupric sulfate (5 x hydrated) in 10 ml water.
4. Working solution: Mix 1 volume reagent C with 25 volumes reagent B, then add 26 volumes reagent A to the C/B mixture.
Assay
1. Prepare samples containing 0.2 to 50 micrograms protein in 500 microliters.
2. Add 500 microliters working solution to each 500 microliters sample and mix. Incubate 60 min. at 60 degrees C.
3. Cool the samples and read at 562 nm.
Analysis
Prepare a standard curve of absorbance versus micrograms protein (or vice versa), and determine amounts from the curve. Determine concentrations of original samples from the amount protein, volume/sample, and dilution factor, if any. If you are unfamiliar with how to obtain a protein concentration for a diluted sample from a standard curve, see how to prepare and use a protein standard curve.
Comments
A longer incubation increases the sensitivity of the assay. The heating can be stopped earlier to prevent the color from becoming too dark. The assay can be performed at room temperature, but there is greater variability among proteins and the assay is less sensitive.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทดสอบ bicinchoninic กรด (BCA) อยู่ในชุดฟอร์มจากเพียร์ซ (ร็อคฟอร์ด Ill.) ขั้นตอนนี้เป็นการ microtiter จานวิธี BCA จะใช้เหตุผลเดียวกันใช้การ Lowry Stoscheck (1990) ได้แนะนำว่า ทดสอบ BCA จะแทนการ Lowry เพราะมันต้องใช้ขั้นตอนเดียว และรีเอเจนต์สีมีเสถียรภาพภายใต้สภาพด่างทั้งแบบทดสอบมาตรฐานสำหรับโปรตีนที่เข้มข้น และวิเคราะห์ไมโคร dilute โปรตีนวิธีแก้ไขปัญหาที่อธิบายไว้ด้านล่างหลักการBCA รองรับวัตถุประสงค์ของรีเอเจนต์ Folin ในวิเคราะห์ Lowry ได้แก่การตอบสนอง ด้วยสิ่งอำนวยความสะดวกระหว่างกันทองแดงและเพปไทด์พันธบัตรการผลิตผลิตภัณฑ์สุดท้ายสีม่วง ประโยชน์ของ BCA คือ ว่า รีเอเจนต์ค่อนข้างมีเสถียรภาพภายใต้สภาพด่าง และสามารถรวมอยู่ในโซลูชันทองแดงให้เป็นขั้นตอนหนึ่งขั้นตอน ผลิตผลิตภัณฑ์โมลิบดีนัม/ทังสเตนสีน้ำเงินเช่นเดียวกับการ Lowryอุปกรณ์นอกจากของเหลวมาตรฐานจัดการอุปกรณ์ เครื่องทดสอบกรดด่างการมองเห็นแสงเป็นสิ่งจำเป็นกับการส่งข้อมูลที่ตั้ง 562 นาโนเมตร อาจใช้แก้วหรือโฟม cuvettes (ราคาประหยัด)ขั้นตอนที่ 1 (ทดสอบมาตรฐาน)Reagents1. รีเอเจนต์ a: bicinchoninate โซเดียม 1 กรัม (BCA), 2 กรัมโซเดียมคาร์บอเนต 0.16 กรัมโซเดียม tartrate, NaOH 0.4 กรัม และ 0.95 กรัมโซเดียมไบ คาร์บอเนต นำเข้ามา 100 ml ด้วยน้ำกลั่น ปรับ pH 11.25 มี 10 M NaOH2. รีเอเจนต์ b: 0.4 กรัม cupric ซัลเฟต (x 5 ที่ hydrated) 10 มลกลั่นน้ำ3. มาตรฐานงานโซลูชัน (SWR): 100 ผสมปริมาณรีเอเจนต์ A กับรีเอเจนต์วอลุ่ม 2 บี4.หุ้นที่มีเสถียรภาพ การแก้ปัญหาการทำงานมีเสถียรภาพสำหรับ 1 สัปดาห์ และควรเป็นสีเขียววิเคราะห์1. เตรียมตัวอย่างที่ประกอบด้วยโปรตีน micrograms 0.2 50 microliters2. เพิ่ม 1 ml SWR อย่างละ 20 microliters และผสม ฟัก 30 นาทีที่ 60 องศาเซลเซียส3. ตัวอย่างเย็น และอ่านที่ 562 นาโนเมตร สีจะมีเสถียรภาพน้อยหนึ่งชั่วโมงขั้นตอนที่ 2 (ทดสอบไมโคร)Reagents1. รีเอเจนต์ a: monohydrate 8 กรัมโซเดียมคาร์บอเนต 1.6 กรัมโซเดียม tartrate นำไป 100 ml ด้วยน้ำกลั่น ปรับ pH 11.25 มี 10 M NaOH2. รีเอเจนต์ b: 4 กรัมในน้ำกลั่น 100 มล BCA3. รีเอเจนต์ c: 0.4 กรัม cupric ซัลเฟต (x 5 ที่ hydrated) ในน้ำ 10 มล.4. ทำงานโซลูชัน: 1 ผสมปริมาณรีเอเจนต์ C กับรีเอเจนต์ปริมาณ 25 B แล้วเพิ่ม 26 ปริมาณรีเอเจนต์ A ผสม C/Bวิเคราะห์1. เตรียมตัวอย่างที่ประกอบด้วยโปรตีน 0.2 50 micrograms 500 microliters2. เพิ่ม 500 microliters ทำงานแก้ปัญหาแต่ละอย่าง 500 microliters และผสม ฟัก 60 นาทีที่ 60 องศาเซลเซียส3. ตัวอย่างเย็น และอ่านที่ 562 นาโนเมตรการวิเคราะห์เตรียมเส้นโค้งมาตรฐานของ absorbance กับโปรตีน micrograms (หรือในทางกลับกัน), และตรวจสอบยอดเงินจากทางโค้ง ตรวจความเข้มข้นของตัวอย่างต้นฉบับจากจำนวนโปรตีน ปริมาตร/ตัวอย่าง และสัด ส่วนเจือจาง ถ้าคุณไม่คุ้นเคยกับวิธีการได้รับโปรตีนเข้มข้นสำหรับตัวอย่างแตกออกจากเส้นโค้งมาตรฐาน ดูวิธีการเตรียม และใช้เส้นโค้งมาตรฐานโปรตีนความคิดเห็นบ่มนานเพิ่มความไวของการทดสอบ ความร้อนที่สามารถหยุดก่อนเพื่อป้องกันไม่ให้สีกลายเป็นสีเข้มเกินไป สามารถทำการทดสอบที่อุณหภูมิห้อง แต่มีความแปรผันมากขึ้นระหว่างโปรตีน และวิเคราะห์เป็นน้อย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กรด bicinchoninic (BCA) ทดสอบสามารถใช้ได้ในรูปแบบชุดจากเพียร์ซ (ฟอร์ด, อิลลินอยส์.) ขั้นตอนนี้จะมีผลบังคับใช้มากที่จะ microtiter วิธีแผ่น เก็บกวาดจะใช้สำหรับเหตุผลเดียวกันโลว์รีย์ถูกนำมาใช้ Stoscheck (1990) ได้ชี้ให้เห็นว่าการทดสอบเก็บกวาดจะเข้ามาแทนที่โลว์รีย์เพราะต้องใช้ขั้นตอนเดียวและสารสีที่มีเสถียรภาพภายใต้เงื่อนไขที่อัลคาไลน์.
ทั้งทดสอบมาตรฐานโปรตีนเข้มข้นและการทดสอบขนาดเล็กสำหรับการแก้ปัญหาโปรตีนเจือจางอธิบายไว้ด้านล่าง
หลักการ
เก็บกวาดจุดมุ่งหมายของการกระทำ Folin ในการทดสอบโลว์รีย์คือการทำปฏิกิริยากับเชิงซ้อนระหว่างไอออนทองแดงและพันธบัตรเปปไทด์ในการผลิตสินค้าที่สิ้นสุดสีม่วง ประโยชน์จากการเก็บกวาดคือสารที่มีเสถียรภาพเป็นธรรมภายใต้เงื่อนไขที่อัลคาไลน์และสามารถนำมารวมในการแก้ปัญหาทองแดงเพื่อให้ขั้นตอนในขั้นตอนเดียว โมลิบดีนัม / ทังสเตนสีฟ้าสินค้าที่ผลิตเช่นเดียวกับโลว์รีย์.
อุปกรณ์
นอกเหนือจากมาตรฐานการจัดการของเหลววัสดุ spectrophotometer แสงที่มองเห็นเป็นสิ่งจำเป็นที่มีการตั้งค่าให้ส่ง 562 นาโนเมตร แก้วหรือสไตรีน (ราคาถูก) cuvettes อาจจะใช้.
ขั้นตอนที่ 1 (การทดสอบมาตรฐาน)
รีเอเจนต์
1 รีเอเจนต์: 1 กรัมโซเดียม bicinchoninate (BCA) 2 กรัมโซเดียมคาร์บอเนต 0.16 กรัม tartrate โซเดียม 0.4 กรัม NaOH และ 0.95 กรัมโซเดียมไบคาร์บอเนตมาถึง 100 มล. น้ำกลั่น ปรับค่า pH เพื่อ 11.25 10 M NaOH.
2 น้ำยา B: 0.4 กรัมซัลเฟต Cupric (5 x ไฮเดรท) ใน 10 มล. น้ำกลั่น.
3 วิธีการแก้ปัญหาทำงานมาตรฐาน (SWR): ผสม 100 ปริมาณสารมี 2 ปริมาณสารบี
4 โซลูชั่นหุ้นมีความเสถียร วิธีการแก้ปัญหาการทำงานมีเสถียรภาพเป็นเวลา 1 สัปดาห์และควรเป็นสีเขียว.
Assay
1 เตรียมความพร้อมตัวอย่างที่มี 0.2-50 ไมโครกรัมโปรตีนใน microliters.
2 เพิ่ม SWR มล. 1 ถึง 20 ตัวอย่างแต่ละ microliters และผสม 30 นาทีฟักไข่ ที่ 60 องศาเซลเซียส
3 เย็นตัวอย่างและอ่านที่ 562 นาโนเมตร สีจะมีเสถียรภาพอย่างน้อยหนึ่งชม.
ขั้นตอนที่ 2 (การทดสอบไมโคร)
รีเอเจนต์
1 รีเอเจนต์: 8 กรัม monohydrate โซเดียมคาร์บอเนต 1.6 กรัมโซเดียม tartrate มาถึง 100 มล. น้ำกลั่น ปรับค่า pH เพื่อ 11.25 10 M NaOH.
2 น้ำยา B: 4 กรัมเก็บกวาดใน 100 มล. น้ำกลั่น.
3 รีเอเจนซี: 0.4 กรัมซัลเฟต Cupric (5 x ไฮเดรท) ใน 10 มล. น้ำ.
4 วิธีการแก้ปัญหาในการทำงาน: 1 ผสมน้ำยาปริมาณ C 25 ปริมาณสาร B แล้วเพิ่ม 26 น้ำยาปริมาณการผสม C / B.
Assay
1 เตรียมความพร้อมตัวอย่างที่มี 0.2-50 ไมโครกรัมโปรตีนใน 500 microliters.
2 เพิ่ม 500 microliters วิธีการแก้ปัญหาการทำงานให้กับแต่ละกลุ่มตัวอย่าง 500 microliters และผสม ฟักไข่ 60 นาที ที่ 60 องศาเซลเซียส
3 เย็นตัวอย่างและอ่านที่ 562 นาโนเมตร.
วิเคราะห์
เตรียมกราฟมาตรฐานของการดูดกลืนแสงเมื่อเทียบกับไมโครกรัมโปรตีน (หรือกลับกัน) และกำหนดจำนวนเงินจากโค้ง การตรวจสอบความเข้มข้นของกลุ่มตัวอย่างต้นฉบับจากโปรตีนปริมาณปริมาณ / ตัวอย่างและปัจจัยการเจือจางถ้า ถ้าคุณไม่คุ้นเคยกับวิธีการที่จะได้รับโปรตีนเข้มข้นสำหรับตัวอย่างการปรับลดจากโค้งมาตรฐานดูวิธีการเตรียมความพร้อมและใช้โปรตีนโค้งมาตรฐาน.
คอมเมนต์
บ่มนานเพิ่มความไวของการทดสอบ ความร้อนสามารถหยุดก่อนหน้านี้เพื่อป้องกันไม่ให้สีกลายเป็นสีเข้มเกินไป การทดสอบนี้จะสามารถทำงานที่อุณหภูมิห้อง แต่มีความแปรปรวนที่ยิ่งใหญ่ในกลุ่มโปรตีนและทดสอบความไวน้อย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กรด bicinchoninic ( BCA ) โดยสามารถใช้ได้ในชุดรูปแบบจากเพียร์ซ ( Rockford , ป่วย ) ขั้นตอนนี้จะเกี่ยวข้องกับวิธีการมากแผ่นไมโคร . ให้เกิดใช้เหตุผลเดียวกับที่เบสที่ใช้คือ stoscheck ( 1990 ) ได้ชี้ให้เห็นว่า BCA ) จะแทนเบส เพราะมันต้องมีก้าวแรก และ สี สารเคมี มั่นคง ภายใต้สภาวะที่เป็นด่าง
ทั้งมาตรฐานการทดสอบสำหรับโปรตีนเข้มข้นและเจือจางโดยไมโครโซลูชั่นโปรตีนจะถูกอธิบายไว้ด้านล่าง .

แนวคิดหลักการให้บริการวัตถุประสงค์ของ folin รีเอเจนต์ในโลว์รี ( คือ การทำปฏิกิริยากับสารประกอบเชิงซ้อนระหว่างไอออนทองแดงและพันธะเปปไทด์ เพื่อผลิตผลิตภัณฑ์สุดท้ายสีม่วง ประโยชน์ของโปรตีนที่ใช้จะค่อนข้างมั่นคง ภายใต้สภาวะด่างและสามารถรวมอยู่ในสารละลายทองแดงเพื่อให้กระบวนการขั้นตอนเดียว เป็นผลิตภัณฑ์ที่ผลิตทังสเตนโมลิบดีนัม / สีฟ้ากับเบส .

นอกจากอุปกรณ์มาตรฐานการจัดการของเหลววัสดุที่เหมาะสมกับการตั้งค่าแสงที่มองเห็นเป็น 562 นาโนเมตร แก้ว หรือ โพลีสไตรีน ( ราคาถูก ) คิวเวททอาจใช้ ขั้นตอนที่ 1 (
( มาตรฐาน )

10 1 สารเคมี :bicinchoninate โซเดียม 1 กรัม ( BCA ) 2 กรัม โซเดียม คาร์บอเนต , 0.16 กรัมโซเดียมทาร์เทรต , 0.4 กรัม NaOH และ 0.95 กรัมโซเดียมไบคาร์บอเนต , นำ 100 ml ด้วยน้ำกลั่น ปรับ pH 11.25 10 M NaOH .
2 3 B : 0.4 กรัมของทองแดงซัลเฟต ( 5 x hydrated ) ใน 10 มล. น้ำกลั่น .
3 โซลูชั่นการทำงานมาตรฐาน ( ออก ) : 2 เล่ม 3 B .
4 สารเคมีผสม 100 เล่มหุ้นโซลูชั่น มั่นคง โซลูชั่นการทำงานมีเสถียรภาพสำหรับ 1 สัปดาห์ และควรเป็นสีเขียว
3
1 เตรียมตัวอย่างที่มี 0.2 ถึง 50 ไมโครกรัมโปรตีนในตัวเลข .
2 เพิ่ม 1 ml SWR แต่ละ 20 ตัวเลข ตัวอย่าง และ ผสม พัก 30 นาที ที่ 60 องศา C .
3 เย็นตัวอย่างและอ่านที่ 562 นาโนเมตร จะสีที่มั่นคงสำหรับอย่างน้อยหนึ่งชั่วโมง ขั้นตอนที่ 2 ( ไมโคร )
)

10 1 สารเคมี :8 กรัม โซเดียม คาร์บอเนต monohydrate , 1.6 กรัม โซเดียมทาร์เทรต , นำ 100 ml ด้วยน้ำกลั่น ปรับ pH 11.25 10 M NaOH .
2 3 B : 4 กรัมโปรตีนใน 100 มล. น้ำกลั่น .
3 ใช้ C : 0.4 กรัมของทองแดงซัลเฟต ( 5 x hydrated ) 10 ml น้ำ .
4 การแก้ไข : 1 ปริมาณสารเคมีที่ใช้ผสมทำ C 25 เล่ม 3 บี แล้วเพิ่มปริมาณสารเคมีที่ 26 ไป C / B ผสม .
(
1เตรียมตัวอย่างที่มี 0.2 ถึง 50 ไมโครกรัมโปรตีนใน 500 ตัวเลข .
2 เพิ่ม 500 ตัวเลข 500 ตัวเลขการทำงานแก้ปัญหาแต่ละอย่างและผสม บ่ม 60 นาที ที่ 60 องศา C .
3 เย็นตัวอย่างและอ่านที่ 562 nm .

เตรียมการวิเคราะห์เส้นโค้งมาตรฐานของค่าเมื่อเทียบกับไมโครกรัมโปรตีน ( หรือในทางกลับกัน ) และตรวจสอบยอดเงินจากโค้งวัดความเข้มข้นของตัวอย่างต้นฉบับจากปริมาณโปรตีน ปริมาณ / ตัวอย่าง และเจือจางปัจจัย , ถ้าใด ๆ ถ้าคุณไม่คุ้นเคยกับวิธีการที่จะได้รับโปรตีนเพื่อเจือจางตัวอย่างจากเส้นโค้งมาตรฐาน ดูวิธีการเตรียมและใช้โปรตีนมาตรฐาน 1 ความคิดเห็น

โค้ง ยาวเพิ่มความไวของการทดสอบความร้อนสามารถหยุดก่อนหน้านี้เพื่อป้องกันไม่ให้สีเป็นสีเข้มเกินไป แบคทีเรียที่สามารถดำเนินการได้ในอุณหภูมิห้อง แต่มีความแปรปรวนมากขึ้นของโปรตีน และแบคทีเรียมีความไวน้อย