As shown in รูป 22, both ไคเมริก ฮิ

As shown in รูป 22, both ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K and IgG1K แอนติ-ฮิวเมน

CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3, and ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 20E5 demonstrated binding characteristics
against various truncated ฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ on transfected cells, which
were identical to binding characteristics of their corresponding parental mouse 25 แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 20E5 counterparts (see Example 8
(b) above; for comparison, see รูป 22 vs รูป 21).


(b). เอพิโทป mapping of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 using ฮิวเมน CD134-derived peptide ELISA
30 In order to further analyze the fine specificity of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K
แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3, the location of the เอพิโทป recognized by ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 was determined by เอพิโทป mapping. The ability of ไคเมริก ฮิวเมน
IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 to bind with a ฮิวเมน CD134-derived peptide, which corresponded to amino acid sequence of truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain Al-module (according to definition of Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683), was determined by ELISA.
5 Ninety six-wells flat-bottom ELISA plates (Corning) were coated with 10
ng/well ฮิวเมน CD134-derived peptide (synthesized by Pepscan Presto, Lelystad, The Netherlands), which corresponded to amino acid sequence of truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain Al module (see SEQ ID NO. 38) หรือ with 10 ng/well
ฮิวเมน fibronectin-derived control peptide (synthesized by Pepscan Presto,
10 Lelystad, The Netherlands), which corresponded to amino acid sequence of extra
type III structural domain (see SEQ ID NO. 37) in PBS o/n at 4°C. After extensive washing in PBS/0.05% Tween 20, plates were blocked in PBS/0.05% Tween 20/1% BSA fraction V (Roche) for 1 hour at RT. Subsequently, plates were incubated with
0, 0.00005 - 50.0 (10-fold dilution steps in block buffer) gg/mL ไคเมริก ฮิวเมน 15 IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 หรือ control ฮิวเมน
IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD40 antibody (Biocult) for 1 hour at RT. After extensive
washing in PBS/0.05% Tween 20, การยึดเกาะของ antibodies was determined with
1:5000 diluted horseradish peroxidase-conjugated goat แอนติ-ฮิวเมน IgG Fey-specific
antibodies (Jackson ImmunoResearch) for 1 hour at RT, followed by a ready-to-use 20 สารละลาย of TMB substrate (Invitrogen) for colorimetric detection. After adding 1 M
112SO4, optical densities was measured at a wavelength of 450 nm (reference
wavelength of 655 nm) using a microplate reader (BioRad).
As shown in รูป 23B (n=1), ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 dose-dependently and specifically bound ฮิวเมน 25 CD134-derived peptide, whereas control ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD40 antibody
demonstrated no binding to ฮิวเมน CD134-derived peptide. Both ไคเมริก ฮิวเมน
IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 and control ฮิวเมน
IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD40 antibody demonstrated no binding to ฮิวเมน fibronectin-
derived control peptide.
30 These results demonstrated that ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 specifically recognized an เอพิโทป on ฮิวเมน
CD134 (comparison of ฮิวเมน CD134-derived peptide vs ฮิวเมน fibronectin-derived control peptide). Furthermore, these results demonstrated that ไคเมริก ฮิวเมน
IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 seemed to recognize a linear หรือ non-linear/conformational เอพิโทป in truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain Al-module (according to definition of Latza et al. Eur J Immunol 1994;
24: 677-683) with amino acid sequence 108-146 (i.e., 39-meric peptide
5 RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN; see SEQ ID NO: 38)
on ภายนอกเซลล์ ฮิวเมน CD134.

Example 10. Generation of ฮิวเมไนซ์ IgG4/kappa แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 20E5 and 12H3
10
Based on determined murine V-regions (see Example 2 (b) above) of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 20E5 and 12H3, ฮิวเมไนซ์ antibody
versions were generated.
ฮิวเมไนซ์ variable สายเบา sequences and ฮิวเมไนซ์ variable heavy 15 chain sequences of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibodies clones 20E5 and 12H3
were obtained using PDL technology (performed by Panaroma Research Institute,
Sunnyvale, CA, USA). For ฮิวเมไนซ์ variable สายเบา and variable heavy
chain amino acid sequences, see SEQ ID NO: 62 (20E5-VL1), 63 (20E5-VL2), 64
(20E5-V111), 65 (20E5-VI12), 66 (20E5-V113), and SEQ ID NO. 67 (12H3- VL1), 68 20 (12H3-VL2), 69 (12H3-VH1), 70 (12H3-V112), 71 (12H3
After this design, Cricetulus griseus-optimized cDNA sequences (see SEQ ID NO: 72, 73, 74 (coding for full length ฮิวเมไนซ์ heavy IgG4 chain clone 20E5 versions, i.e., V111, VH2, VH3, ตามลำดับ), SEQ ID NO. 75, 76 (coding for full
length ฮิวเมไนซ์ light lc chain clone 20E5 versions, i.e., 20E5_VL1, 20E5_VL2,
25 ตามลำดับ), SEQ ID NO: 77, 78, 79 (coding for full length ฮิวเมไนซ์ heavy IgG4
chain clone 12H3 versions, i.e., VI11, VH2, VH3, resp.), and SEQ ID NO. 80, 81
(coding for full length ฮิวเมไนซ์ light lc chain clone 12H3 versions, i.e., VL1, VL2,
resp.)), were ordered at GENEART (Regensburg, Germany), which codes for a
signal peptide followed by either the ฮิวเมไนซ์ variable สายหนัก linked to
30 ฮิวเมน IgG4 บิบิคงที่ หรือ followed by the ฮิวเมไนซ์ variable สายเบา
linked to ฮิวเมน kappa บิบิคงที่: (1) for expression of ฮิวเมไนซ์ แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 versions, a mouse immunoglobulin สายหนัก
signal peptide was used for both ฮิวเมไนซ์ heavy and สายเบาs, and (2) for


expression of ฮิวเมไนซ์ แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 versions, a
ฮิวเมน immunoglobulin สายหนัก signal peptide was used for ฮิวเมไนซ์ heavy
chains and a ฮิวเมน immunoglobulin kappa chain signal peptide for ฮิวเมไนซ์
สายเบาs. Furthermore, all ฮิวเมไนซ์ antibodies were expressed as stabilized 5 ฮิวเมน IgG4 molecules according to Angal et al. (Mol. Immunol., Vol. 30, No. 1, pp.
105-108, 1993). Using suitable restriction enzymes, generated cDNAs were
โคลนย่อย in pcDNA3.1-derived expression plasmids.
ฮิวเมไนซ์ แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 versions were
expressed using the FreeStyleTM MAX CHO Expression System (Life Technologies). 10 ฮิวเมไนซ์ แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 versions were expressed using
the FreeStyleTM 293 Expression System (Life Technologies). Generated ฮิวเมไนซ์
antibodies were purified using affinity chromatography protein A columns (GE
Healthcare). In this manner, six purified ฮิวเมไนซ์ versions of antibody clone
20E5 were generated, i.e.,20E5_VL1VH1, 20E5_VL1V112, 2-E5_VL1VH3,
15 20E5 VL2VH1, 20E5 VL2VH2 and 20E5_VL2VH3, and six purified ฮิวเมไนซ์
versions of antibody clone 12H3 were generated, i.e., 12H3_VL1VH1,
12H3_VL1VH2, 12H3 VL1VH3, 12H3_VL2VH1, 12H3_VL2VH2 and
12H3 VL2VH3.
For ฮิวเมไนซ์ amino acid sequences, see SEQ ID NO: 82, 83, 84 (coding 20 for full length ฮิวเมไนซ์ heavy IgG4 chain clone 20E5 versions, i.e., V111, V112,
VH3, resp.), SEQ ID NO. 85, 86 (coding for full length ฮิวเมไนซ์ light lc chain
clone 20E5 versions, i.e., VL1, VL2, resp.), SEQ ID NO. 87, 88, 89 (coding for full
length ฮิวเมไนซ์ heavy IgG4 chain clone 12H3 versions, i.e., V111, VH2, V113,
resp.), and SEQ ID NO. 90, 91 (coding for full length ฮิวเมไนซ์ light lc chain clone
25 12H3 versions, i.e., VL1, VL2, resp.).

Example 11. Binding characterization of ฮิวเมไนซ์ IgG4/kappa แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 20E5 an 12H3


30 (a). การยึดเกาะของ ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clones
20E5 and 12H3 with รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein (ELISA)
Ninety six-wells flat-bottom ELISA plates (Corning) were coated with 50
ng/well รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fey (IgG1) fusion protein (R&D
Systems) in PBS o/n at 4°C. After extensive washing in PBS/0.05% Tween 20,
plates were blocked in PBS/0.05% Tween 20/1% BSA fraction V (Roche) for 1 hour 5 at RT. Subsequently, plates were incubated with 0, 0.0003 - 20.0 (3-fold dilution
steps in block buffer) gg/mL parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone
120E5 หรือ 12H3, ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 หรือ
12H3, and six versions of ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone
20E5 หรือ 12H3 for 1 hour at RT. After extensive washing in PBS/0.05% Tween 20,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ดังแสดงในรูปที่ 22 ทั้งไคเมริกฮิวเมน IgG4K และ IgG1K แอนติ-ฮิวเมนCD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 และไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 แสดงลักษณะผูก ต่อต้านต่าง ๆ ตัดฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์บนเซลล์ transfected ซึ่ง ก็เหมือนกับผูกลักษณะของตนที่สอดคล้องกันแอนตี้ CD134 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์ปกครอง 25 clones 12H 3 และคู่ 20E5 (ดูตัวอย่าง 8(ข) ข้างต้น สำหรับการเปรียบเทียบ ดูรูปเทียบกับ 22 รูป 21)(ข) การแม็ปเอพิโทปไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ใช้เพปไทด์ CD134 มาฮิวเมน ELISA30 เพื่อไปวิเคราะห์ specificity ดีของไคเมริกฮิวเมน IgG4Kแอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ที่ตั้งของเอพิโทปที่รู้จักไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ถูกกำหนด โดยเอพิโทปแมป ความสามารถของไคเมริกฮิวเมนIgG4K แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ผูกกับตัวฮิวเมนมา CD134 เพปไทด์ ที่ corresponded กับกรดอะมิโนลำดับของโดเมนย่อย CRD3 A1-โม-CRD4 ตัดโมดูอัล (ตามคำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24:677-683), ถูกกำหนด โดย ELISA5 6 90 บ่อล่างแบน ELISA แผ่น (คอร์นทำ) ถูกเคลือบ ด้วย 10ng/ดี ฮิวเมนมา CD134 เพปไทด์ (สังเคราะห์ โดย Pepscan Presto, Lelystad ประเทศเนเธอร์แลนด์), ที่ corresponded กับกรดอะมิโนลำดับของโดเมนย่อย CRD3 A1-โม-CRD4 ตัดโมดูอัล (ดูรหัสลำดับหมายเลข 38) หรือกับ ng ดี 10ฮิวเมนเพปไทด์ fibronectin มาควบคุม (สังเคราะห์ โดย Pepscan Presto10 Lelystad ประเทศเนเธอร์แลนด์), ที่ corresponded ลำดับกรดอะมิโนพิเศษชนิด III โครงสร้างโดเมน (ดูลำดับรหัสหมายเลข 37) ใน PBS o/n ที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS/0.05% Tween 20 แผ่นถูกบล็อกในเศษ PBS/0.05% Tween 20/1% บีเอสเอวี (Roche) 1 ชั่วโมงที่ RT. ในเวลาต่อมา แผ่นก็ incubated ด้วย0, 0.00005 - 50.0 (10-fold เจือจางขั้นตอนในบัฟเฟอร์บล็อก) gg/mL ไคเมริกฮิวเมน 15 IgG4K แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 หรือควบคุมฮิวเมนแอนติบอดี CD40 แอนติ-ฮิวเมน IgG4K (Biocult) 1 ชั่วโมงที่ RT. หลังจากอ่านรีวิวซักผ้าใน PBS/0.05% Tween 20 แอนตี้การยึดเกาะของกำหนดด้วย1:5000 ผสม horseradish peroxidase กลวงแพะแอนติ-ฮิวเมน IgG Fey เฉพาะ แอนตี้ (Jackson ImmunoResearch) 1 ชั่วโมงที่ RT ตาม ด้วยสารละลายพร้อมใช้ 20 ของพื้นผิวของทหารไทย (Invitrogen) สำหรับตรวจสอบเทียบเคียง หลังจากเพิ่ม 1 M 112SO4 ความหนาแน่นออปติคัลได้วัดที่ความยาวคลื่นของ 450 nm (อ้างอิง ความยาวคลื่นของ 655 นาโนเมตร) ใช้อ่าน microplate (BioRad)ดังแสดงในรูปที่ 23B (n = 1), ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ยา dependently และโดยเฉพาะผูกฮิวเมน 25 มา CD134 เพปไทด์ ในขณะที่ควบคุมฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD40 แอนติบอดี สาธิตไม่ผูกกับเพปไทด์ CD134 มาฮิวเมน ทั้งสองฮิวเมนไคเมริก IgG4k แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 และควบคุมฮิวเมน IgG4K แอนติฮิวเมน CD40 แอนติบอดีสาธิตผูกไม่ให้ fibronectin ฮิวเมน- เพปไทด์ควบคุมได้รับการ30 ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าที่ฮิวเมนไคเมริก IgG4K แอนติฮิวเมน CD134โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 รู้จักการเอพิโทปบนฮิวเมนโดยเฉพาะCD134 (เปรียบเทียบฮิวเมนเพปไทด์ CD134 มาเทียบกับฮิวเมนมา fibronectin ควบคุมเพปไทด์) นอกจากนี้ ผลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าที่ฮิวเมนไคเมริกIgG4k แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ดูเหมือนจะ รู้จักเอพิโทปเป็นเชิงเส้นหรือไม่เชิง เส้น/conformational ในตัดโดเมนย่อย CRD3 A1-โม-CRD4 อัล-โมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 199424:677-683) กับกรดอะมิโนลำดับ 108-146 (เช่น 39 meric เพปไทด์5 RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN ดูเลขลำดับ ID: 38)ในภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134ตัวอย่างที่ 10 รุ่นฮิวเมไนซ์ IgG4/แค ปปาแอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนตี้ clones 20E5 และ 12H 310ตามกำหนด murine V-ภูมิภาค (ดูตัวอย่าง 2 (b) ด้านบนของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนตี้โคลน 20E5) และ 12H 3 แอนติบอดีฮิวเมไนซ์ มีสร้างรุ่นลำดับตัวแปรสายเบาฮิวเมไนซ์และฮิวเมไนซ์ตัวแปร 15 หนักโซ่ลำดับของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนตี้โคลน 20E5 และ 12H 3 ได้รับโดยใช้เทคโนโลยี PDL (ดำเนินการ โดย สถาบันวิจัย Panaroma Sunnyvale, CA สหรัฐอเมริกา) ฮิวเมไนซ์สายเบาตัวแปรและตัวแปรหนัก ลำดับกรดอะมิโนโซ่ ดูเลขลำดับ ID: 62 (20E5-VL1) 64, 63 (20E5-VL2) (20E5-V111), 65 (20E5-VI12), 66 (20E5-V113), และหมายเลข ID ลำดับ 67 (12H 3-VL1), 68 20 (12H 3-VL2), 69 (12H 3-VH1), 70 (12H 3-V112) 71 (12H 3หลังนี้ออกแบบ ลำดับ cDNA griseus เหมาะ Cricetulus (ดูเลขลำดับ ID: 72, 73, 74 (รหัสแบบยาวฮิวเมไนซ์หนัก IgG4 โซ่โคลน 20E5 รุ่น เช่น V111, VH2, VH3 ตามลำดับ), ลำดับรหัสหมายเลข 75, 76 (เขียนโค้ดเต็มความยาวฮิวเมไนซ์ lc สีโซ่โคลน 20E5 รุ่น เช่น 20E5_VL1, 20E5_VL225 ตามลำดับ), เลขลำดับ ID: 77, 78, 79 (รหัสสำหรับฮิวเมไนซ์ความยาวเต็ม IgG4 หนักเชนโคลน 12 H 3 รุ่น เช่น VI11, VH2, VH3 ความรับผิดชอบ), และลำดับรหัสหมายเลข 80, 81(รหัสสำหรับแบบยาวฮิวเมไนซ์ lc สีโคลนโซ่ 12H 3 รุ่น เช่น VL1, VL2 ความรับผิดชอบ)), ที่สั่งที่ GENEART (Regensburg เยอรมนี), สำหรับรหัสที่เป็น เพปไทด์สัญญาณตาม ด้วยการสายหนักตัวแปรฮิวเมไนซ์เชื่อมโยงกับ ตาม ด้วยสายเบาตัวแปรฮิวเมไนซ์หรือบิบิคงที่ของ IgG4 30 ฮิวเมน เชื่อมโยงกับฮิวเมนแคปปาบิบิคงที่: (1) สำหรับค่าของฮิวเมไนซ์แอนติ - ฮิวเมนรุ่น 20E5 CD134 แอนติบอดีโคลน สายหนัก immunoglobulin เมาส์ เพปไทด์สัญญาณใช้หนักฮิวเมไนซ์ และ สายเบาs และ (2) สำหรับของฮิวเมไนซ์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H รุ่น 3 การเพปไทด์ส่งสัญญาณฮิวเมน immunoglobulin สายหนักใช้สำหรับฮิวเมไนซ์หนัก การฮิวเมน immunoglobulin กัปปะโซ่เพปไทด์ส่งสัญญาณสำหรับฮิวเมไนซ์และโซ่ สายเบาs นอกจากนี้ แอนตี้ฮิวเมไนซ์ทั้งหมดถูกแสดงเป็นเสถียร 5 ฮิวเมน IgG4 โมเลกุลตาม Angal et al. (Mol. Immunol, 30 ปี หมายเลข 1, pp 105-108, 1993) ใช้เอนไซม์จำกัดเหมาะ cDNAs สร้างขึ้นได้ โคลนย่อยใน plasmids นิพจน์ที่มา pcDNA3.1ฮิวเมไนซ์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 ไม่ได้แสดงโดยใช้ FreeStyleTM สูงสุดช่อนิพจน์ระบบ (ชีวิตเทคโนโลยี) 10 ฮิวเมไนซ์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดี 12H โคลนรุ่น 3 ได้แสดงการใช้ FreeStyleTM 293 นิพจน์ระบบ (ชีวิตเทคโนโลยี) สร้างฮิวเมไนซ์ แอนตี้ได้บริสุทธิ์โดยใช้ความสัมพันธ์ chromatography โปรตีน A คอลัมน์ (GE แพทย์) ในลักษณะนี้ 6 บริสุทธิ์รุ่นฮิวเมไนซ์ของแอนติบอดีโคลน สร้าง 20E5, i.e.,20E5_VL1VH1, 20E5_VL1V112, 2 E5_VL1VH3 15 20E5 VL2VH1, 20E5 VL2VH2 and 20E5_VL2VH3, and six purified ฮิวเมไนซ์ versions of antibody clone 12H3 were generated, i.e., 12H3_VL1VH1, 12H3_VL1VH2, 12H3 VL1VH3, 12H3_VL2VH1, 12H3_VL2VH2 and 12H3 VL2VH3.For ฮิวเมไนซ์ amino acid sequences, see SEQ ID NO: 82, 83, 84 (coding 20 for full length ฮิวเมไนซ์ heavy IgG4 chain clone 20E5 versions, i.e., V111, V112, VH3, resp.), SEQ ID NO. 85, 86 (coding for full length ฮิวเมไนซ์ light lc chain clone 20E5 versions, i.e., VL1, VL2, resp.), SEQ ID NO. 87, 88, 89 (coding for full length ฮิวเมไนซ์ heavy IgG4 chain clone 12H3 versions, i.e., V111, VH2, V113, resp.), and SEQ ID NO. 90, 91 (coding for full length ฮิวเมไนซ์ light lc chain clone25 12H3 versions, i.e., VL1, VL2, resp.).Example 11. Binding characterization of ฮิวเมไนซ์ IgG4/kappa แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 20E5 an 12H330 (a). การยึดเกาะของ ฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clones20E5 and 12H3 with รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fcy fusion protein (ELISA)Ninety six-wells flat-bottom ELISA plates (Corning) were coated with 50 ng/well รีคอมบิแนนต์ ฮิวเมน CD134:ฮิวเมน Fey (IgG1) fusion protein (R&D Systems) in PBS o/n at 4°C. After extensive washing in PBS/0.05% Tween 20, plates were blocked in PBS/0.05% Tween 20/1% BSA fraction V (Roche) for 1 hour 5 at RT. Subsequently, plates were incubated with 0, 0.0003 - 20.0 (3-fold dilution steps in block buffer) gg/mL parental mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 120E5 หรือ 12H3, ไคเมริก ฮิวเมน IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 หรือ 12H3, and six versions of ฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 หรือ 12H3 for 1 hour at RT. After extensive washing in PBS/0.05% Tween 20,

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดังแสดงในรูปที่ 22 ทั้งไคเมริกฮิวเมน IgG4K และ IgG1K แอนติ - ฮิวเมนCD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนCD134 โมโนโคลน อลโคลนแอนติบอดี 20E5 แสดงให้เห็นถึงลักษณะที่มีผลผูกพันกับต่างๆ ที่ถูกตัดทอนฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ต่อเซลล์ transfected ซึ่งเหมือนกับลักษณะที่มีผลผูกพันเมาส์ของผู้ปกครองที่สอดคล้องกันของพวกเขา25 แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 และคู่ 20E5 (ดูตัวอย่างที่ 8 (ข) ข้างต้นสำหรับการเปรียบเทียบให้ดูรูป 22 รูปเทียบกับ 21). (ข) เอพิโทปทำแผนที่ของไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 ใช้ฮิวเมน CD134 ที่ได้มาจากวิธี ELISA เปปไทด์ที่30 ในการสั่งซื้อเพื่อวิเคราะห์ความจำเพาะที่ดีของไคเมริก ฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3, สถานที่ตั้งของเอพิโทปที่ยอมรับโดยไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - การฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดี โคลน 12H3 ถูกกำหนดโดยเอพิโทปการทำแผนที่ ความสามารถของไคเมริกฮิวเมนIgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 การผูกกับฮิวเมน CD134 เปปไทด์ที่ได้มาซึ่งตรงกับอะมิโนลำดับกรดของ CRD3 ตัด A1-module- CRD4 ย่อยอัลโมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al, Eur J Immunol 1994; 24:. 677-683). ถูกกำหนดโดยวิธี ELISA 5 เก้าสิบหกหลุมจาน ELISA แบนด้านล่าง (Corning) ถูกเคลือบด้วย 10 ng / ดีฮิวเมนเปปไทด์ CD134 มา (สังเคราะห์โดย Pepscan Presto, Lelystad, เนเธอร์แลนด์) ซึ่งตรงกับอะมิโนลำดับกรดของตัด CRD3 A1-โมดูล CRD4 โมดูลอัลโดเมนย่อย (ดูรหัส SEQ NO. 38) หรือ 10 ng / ดีฮิวเมนเปปไทด์ควบคุมfibronectin มา (สังเคราะห์โดย Pepscan Presto, 10 Lelystad, เนเธอร์แลนด์) ซึ่งตรงกับอะมิโนลำดับกรดของพิเศษประเภทที่สามโดเมนโครงสร้าง(ดูรหัส SEQ NO. 37) ในพีบีเอส o / n ที่ 4 ° ซี หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / 0.05% Tween 20 แผ่นถูกบล็อกในพีบีเอส / 0.05% Tween 20/1% ส่วนบีเอสเอวี (Roche) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ RT ต่อมาแผ่นถูกบ่มกับ0, .00005-50.0 (ขั้นตอนการเจือจาง 10 เท่าในบัฟเฟอร์บล็อก) GG / mL ไคเมริกฮิวเมน 15 IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอแอนติบอดีลโคลน 12H3 หรือควบคุมฮิ วเมนIgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD40 (Biocult) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ RT หลังจากที่กว้างขวางซักผ้าในพีบีเอส / 0.05% Tween 20 การยึดเกาะของแอนติบอดีถูกกำหนดด้วย 1: 5000 มะรุมเจือจางแพะ peroxidase-ผันแอนติ - ฮิวเมน IgG ชอบกลเฉพาะแอนติบอดี(แจ็คสัน ImmunoResearch) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ RT, ตามมาด้วยความพร้อมต่อการใช้งาน 20 สารละลายของพื้นผิวทหารไทย (Invitrogen) สำหรับการตรวจสอบสี หลังจากเพิ่ม 1 M 112SO4 ความหนาแน่นแสงวัดที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร (อ้างอิงความยาวคลื่น655 นาโนเมตร) โดยใช้เครื่องอ่าน microplate (BioRad). ดังแสดงในรูป 23B (n = 1) ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอ นติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอแอนติบอดีโคลนล 12H3 ยา dependently และผูกพันเฉพาะฮิวเมน 25 เปปไทด์ CD134 มาในขณะที่การควบคุมฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD40 แสดงให้เห็นไม่ผูกพันกับฮิว เปปไทด์เมน CD134 มา ทั้งไคเมริกฮิวเมนIgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และการควบคุมฮิวเมนIgG4K แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD40 แสดงให้เห็นถึงไม่มีผลผูกพันให้กับฮิวเมน fibronectin- เปปไทด์ที่ได้รับการควบคุม . 30 ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าไคเมริกฮิวเมน IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนได้รับการยอมรับโดยเฉพาะ 12H3 เอพิโทปในฮิวเมนCD134 (เปรียบเทียบฮิวเมนเปปไทด์ CD134 มา เทียบกับฮิวเมนควบคุม fibronectin เปปไทด์ที่ได้มา) นอกจากนี้ผลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าไคเมริกฮิวเมนIgG4k แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 ดูเหมือนจะรับรู้เชิงเส้นหรือไม่เชิงเส้น / โครงสร้างเอพิโทปใน CRD3 ตัด A1-module- CRD4 ย่อยอัลโมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al, Eur J Immunol 1994. 24: 677-683) ที่มีลำดับกรดอะมิโน 108-146 (เช่น 39 Meric เปปไทด์5 RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN ดู SEQ ID NO: 38) เมื่อวันที่ ภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134. ตัวอย่าง 10 รุ่นของฮิวเมไนซ์ IgG4 / คัปปาแอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 และ 12H3 10 จากความมุ่งมั่นที่หมา V-ภูมิภาค (ดูตัวอย่างที่ 2 ( ข) ข้างต้น) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 20E5 และ 12H3, ฮิวเมไนซ์แอนติบอดี้รุ่นถูกสร้างขึ้น. ฮิวเมไนซ์ตัวแปรสายเบาลำดับและฮิวเมไนซ์ตัวแปรหนัก 15 ลำดับห่วงโซ่ เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โคลนแอนติบอดี 20E5 12H3 และได้รับการใช้เทคโนโลยีPDL (แสดงโดย Panaroma สถาบันวิจัยซันนีเวล, CA, USA) สำหรับฮิวเมไนซ์สายตัวแปรเบาและหนักตัวแปรห่วงโซ่ลำดับกรดอะมิโนให้ดู ID SEQ NO: 62 (20E5-VL1), 63 (20E5-VL2), 64 (20E5-V111), 65 (20E5-VI12) 66 (20E5-V113) และ SEQ ID NO 67 (12H3- VL1) 68 20 (12H3-VL2), 69 (12H3-VH1), 70 (12H3-V112), 71 (12H3 หลังจากการออกแบบนี้ Cricetulus griseus ที่ดีที่สุดลำดับยีน (ดู SEQ ID NO: 72, 73, 74 (การเข้ารหัสสำหรับความยาวเต็มรูปแบบฮิวเมไนซ์โซ่ IgG4 หนักโคลนรุ่น 20E5 คือ V111, VH2, VH3, ตามลำดับ) ID SEQ NO. 75, 76 (การเข้ารหัสเต็มความยาวของฮิวเมไนซ์แสงห่วงโซ่โคลน LC รุ่น 20E5 คือ 20E5_VL1, 20E5_VL2, 25 ตามลำดับ) SEQ ID NO: 77, 78, 79 (การเข้ารหัสสำหรับความยาวเต็มรูปแบบฮิวเมไนซ์ IgG4 หนักห่วงโซ่โคลน12H3 รุ่นคือ VI11, VH2, VH3 , resp.) และ SEQ ID NO. 80, 81 (การเข้ารหัสสำหรับความยาวเต็มรูปแบบฮิวเมไนซ์แสงห่วงโซ่โคลน LC 12H3 รุ่นคือ VL1, VL2, resp.)) ได้รับคำสั่งที่ GENEART (Regensburg, เยอรมนี) ซึ่งรหัสสำหรับเปปไทด์สัญญาณตามมาด้วยทั้งฮิวเมไนซ์ตัวแปรสายหนักที่เชื่อมโยงกับวันที่30 ฮิวเมน IgG4 บิบิคงที่หรือตามด้วยฮิวเมไนซ์ตัวแปรสายเบาเชื่อมโยงกับฮิวเมนคัปปาบิบิคงที่ (1) สำหรับการแสดงออกของฮิวเมไนซ์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 รุ่น 20E5 เป็นอิมมูโนเมาส์สายหนักเปปไทด์สัญญาณที่ใช้สำหรับทั้งฮิวเมไนซ์หนักและสายเบาs และ (2) สำหรับการแสดงออกของฮิวเมไนซ์แอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 12H3 รุ่นที่ฮิวเมนอิมมูโนสายหนักเปปไทด์สัญญาณที่ใช้สำหรับฮิวเมไนซ์หนักโซ่และฮิวเมนคัปปาอิมมูโนเปปไทด์สัญญาณสำหรับห่วงโซ่วเมฮิไนซ์สายเบา s นอกจากนี้ทั้งหมดฮิวเมไนซ์แอนติบอดี้ที่ถูกแสดงเป็นมีเสถียรภาพ 5 ฮิวเมนโมเลกุล IgG4 ตาม Angal et al, (Mol. Immunol. ฉบับ. 30, ฉบับที่ 1, PP. 105-108, 1993) ข้อ จำกัด การใช้เอนไซม์ที่เหมาะสม cDNAs สร้างเป็นโคลนย่อยในพลาสมิดpcDNA3.1 แสดงออกมา. ฮิวเมไนซ์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 รุ่น 20E5 ถูกแสดงโดยใช้FreeStyleTM MAX CHO ระบบการแสดงออก (เทคโนโลยีชีวิต) 10 ฮิวเมไนซ์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 รุ่นถูกใช้แสดงFreeStyleTM 293 ระบบการแสดงออก (เทคโนโลยีชีวิต) สร้างฮิวเมไนซ์แอนติบอดี้ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้โปรตีนโคสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดคอลัมน์ A (จีอีเฮลธ์แคร์) ในลักษณะนี้หกบริสุทธิ์ฮิวเมไนซ์รุ่นแอนติบอดีโคลน20E5 ถูกสร้างขึ้นเช่น 20E5_VL1VH1, 20E5_VL1V112 2 E5_VL1VH3, 15 20E5 VL2VH1, 20E5 VL2VH2 และ 20E5_VL2VH3 หกบริสุทธิ์ฮิวเมไนซ์รุ่นโคลนแอนติบอดี12H3 ถูกสร้างขึ้นเช่น 12H3_VL1VH1, 12H3_VL1VH2, 12H3 VL1VH3, 12H3_VL2VH1, 12H3_VL2VH2 และ12H3 VL2VH3. สำหรับฮิวเมไนซ์ลำดับกรดอะมิโนให้ดู SEQ ID NO: 82, 83, 84 (การเข้ารหัส 20 สำหรับความยาวเต็มฮิวเมไน โคลนซ์โซ่ IgG4 หนักรุ่น 20E5 คือ V111, V112, VH3, resp.) ID SEQ NO 85, 86 (การเข้ารหัสสำหรับความยาวเต็มรูปแบบฮิวเมไนซ์โซ่แสง LC โคลนรุ่น 20E5 คือ VL1, VL2, resp.) ID SEQ NO 87, 88, 89 (การเข้ารหัสเต็มความยาวของฮิวเมไนซ์โซ่IgG4 หนักโคลน 12H3 รุ่นคือ V111, VH2, V113, resp.) และรหัส SEQ NO 90, 91 (การเข้ารหัสสำหรับความยาวเต็มรูปแบบฮิวเมไนซ์โซ่แสงโคลน LC 25 12H3 รุ่นคือ VL1, VL2, resp.). ตัวอย่าง 11. ลักษณะการผูกของฮิวเมไนซ์ IgG4 / คัปปาแอนติ - ฮิ วเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20E5 12H3 30 (ก) การยึดเกาะของฮิวเมไนซ์ IgG4K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี20E5 และ 12H3 กับรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134: ฮิวเมนโปรตีนฟิวชั่น FCY (ELISA) เก้าสิบหก -wells แผ่นวิธี ELISA แบนด้านล่าง (Corning) ถูกเคลือบด้วย 50 ng / ดีรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน CD134: ฮิวเมนชอบกล (IgG1) โปรตีนฟิวชั่น (R & D Systems) ในพีบีเอส o / n ที่ 4 ° C . หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / 0.05% Tween 20 แผ่นถูกบล็อกในพีบีเอส / 0.05% Tween 20/1% ส่วนบีเอสเอวี (Roche) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง 5 RT ต่อมาแผ่นถูกบ่มกับ 0, .0003-20.0 (3 เท่าเจือจางขั้นตอนในบัฟเฟอร์บล็อก) GG / mL เมาส์ของผู้ปกครองแอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน120E5 หรือ 12H3, ไคเมริกฮิวเมน IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5 หรือ12H3 หกรุ่นฮิวเมไนซ์ IgG4k แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน20E5 หรือ 12H3 1 ชั่วโมงที่ RT หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / 0.05% Tween 20

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตามที่แสดงใน 22 รูปทั้งไคเมริกและฮิวเมน igg4k igg1k แอนติ - ฮิวเมน

cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 และไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน
cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 20e5 แสดงลักษณะต่าง ๆตัดกับปก
ฮิวเมน cd134 คอนสตรัคต์บน transfected เซลล์ซึ่ง
เป็นเหมือนกันกับลักษณะการจับที่สอดคล้องกันของเมาส์ 25 แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลนและ 12h3 20e5 คู่ ( เห็นตัวอย่าง 8
( ข ) ข้างต้น สำหรับการเปรียบเทียบ เห็นรูป 22 และ 21 รูป )


( B ) เอพิโทปแผนที่ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134
โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 ใช้ฮิวเมน cd134 ได้มาเปปไทด์ ELISA
30 เพื่อที่จะช่วยวิเคราะห์วิธีปรับไคเมริกฮิวเมน igg4k
แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอล 12h3 แอนติบอดีโคลน ,สถานที่ตั้งของเอพิโทปรู้จักไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 ถูกกำหนดโดยการทำแผนที่เอพิโทป . ความสามารถของไคเมริกฮิวเมน
igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 ผูกกับฮิวเมน cd134 ได้มาเปปไทด์ซึ่งสอดคล้องกับลำดับกรดอะมิโนของการสื่อสาร crd3 a1-module-crd4 ซับโดเมน อัล โม ( ตามคำนิยามของ latza et al . Eur J immunol 1994 ; 24 : 677-683 ) , ถูกกำหนดโดยวิธี ELISA .
5 เก้าสิบหกหลุมด้านล่างแบน 3 แผ่น ( คอร์น ) ถูกเคลือบด้วย 10
กรัม / ดีฮิวเมน cd134 ได้มาเปปไทด์ ( สังเคราะห์จาก pepscan presto Lelystad , เนเธอร์แลนด์ ) ,ซึ่งสอดคล้องกับลำดับกรดอะมิโนของการสื่อสาร crd3 a1-module-crd4 ซับโดเมน อัล โม ( เห็น seq id หมายเลข 38 ) ค็อค 10 ng / ดี
ฮิวเมนไฟโบรเนกตินได้มาเปปไทด์ควบคุม ( สังเคราะห์จาก pepscan presto
10 Lelystad , เนเธอร์แลนด์ ) ซึ่งสอดคล้องกับลำดับกรดอะมิโนของโดเมนโครงสร้างชนิดพิเศษ
3 ( ดู seq id ไม่ 37 ) ใน PBS O / N ที่อุณหภูมิ 4 องศาหลังจากอย่างละเอียดซักใน PBS / 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 20 , จานที่ถูกบล็อกใน PBS / 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 20 / 1 % ( ส่วน V ( โรช ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงใน RT . ต่อมา แผ่นถูกบ่มด้วย
0 0.00005 - 50.0 ( 10 เท่า ( ขั้นตอนในบล็อกบัฟเฟอร์ ) GG / ml ไคเมริกฮิวเมน 15 igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 ค็อคควบคุมฮิวเมน
igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd40 แอนติบอดี ( biocult ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงใน RT . หลังจากล้างอย่างละเอียด
PBS / 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 20 , การยึดเกาะของแอนติบอดีถูกกำหนดด้วย
1:5000 peroxidase เจือจาง . แอนติฮิวเมน IgG conjugated แพะ - เฟย์ เฉพาะ
แอนติบอดี ( แจ็คสัน immunoresearch ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงใน RT ,ตามด้วยพร้อมที่จะใช้สิทธิ 20 สารละลายพื้นผิว ( Invitrogen ) 7.4 การตรวจหา หลังจากเพิ่ม 1 M
112so4 แสงความหนาแน่นวัดที่ความยาวคลื่น 450 nm ( อ้างอิง
ความยาวคลื่น 655 นาโนเมตร ) โดยใช้พื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่าน biorad ) .
ดังแสดงในรูป 23B ( n = 1 ) ไคเมริกฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134
โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 dose dependently และโดยเฉพาะผูกฮิวเมน 25 cd134 ได้มาเปปไทด์ ในขณะที่การควบคุมฮิวเมน igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd40 )
) ไม่ผูกฮิวเมน cd134 ได้มาเปปไทด์ . ทั้งไคเมริกฮิวเมน
igg4k แอนติ - ฮิวเมน cd134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12h3 และควบคุมฮิวเมน