2. Material and methods2.1. Collect

2. Material and methods
2.1. Collection of earthworm cultures
The earthworms E. foetida and P. excavatus were obtained from the vermicomposting shed of the Animal Genetics Division, Indian Veterinary Research Institute, Izatnagar, Bareilly, India (latitude and longitude – 28.40◦ N, 79.43◦ E) and maintained on the lignocellulolytic biomass based feed at the Division of Microbiol ogy, ICAR-Indian Agricultural Research Institute (latitude 28◦40 N; longitude 77◦12 E), New Delhi. Analyses were undertaken after 30 d of growth.

2.2. Extraction of total DNA from earthworm gut, amplification of 16S rRNA gene, construction of library and sequence analysis
DNA extraction from E. foetida and P. excavatus gut (10 per earthworm species) was performed using the Power Soil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories Inc., Carlsbad, USA) according to the manufacturer’s protocol. Amplification of 16S rRNA employing two universal primers, forward pA (5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 ) and reverse pH (5 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 3 ) (Edwards et al.1989) was undertaken. Amplification was carried out in a 100 l reaction volume containing 50–100 ng of template DNA, primers pA and pH (100 ng each), dATP, dCTP, dTTP and dGTP (200 M each),
Taq Polymerase reaction buffer (10×) 10 l and 1.0 U Taq Polymerase. Conditions used for amplification were as follows: initial denaturation for 5 min at 95 ◦C, followed by 30 cycles of denaturation at 95 ◦C for 30 s, annealing at 52 ◦C for 40 s and extension at 72 ◦C for 1 min and a final extension at 72 ◦C for 10 min. PCR products were resolved by electrophoresis at 60 V for 1 h in 1.2% agarose gel in 1× TAE buffer.Clone libraries of PCR products were constructed using a TA Cloning Kit (Invitrogen) with vector pGMTT Easy Vector. Successful transformants were inoculated into Luria-Bertani broth containing ampicillin and allowed to grow overnight. One library each for the two gut samples was prepared. Plasmids from the libraries were extracted using a QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Clones con- taining putative 16S rRNA genes were screened by amplification of the isolated plasmids with M13F and M13R primers. Products were visualized on a 1% agarose gel to ensure the presence of inserts of the expected size. Clones which exhibited no insert or inserts much larger or smaller than expected were excluded from sequencing. Sequencing was done by employing a dideoxy cycle with fluores- cent terminators and run in a 3130xl Applied Biosystems ABI prism automated DNA sequencer. Vector-based sequences were eliminated using the VecScreen tool of the NCBI (Johnson et al. 2008), and chimaeras were screened by the MALLARD software (Ashelford et al., 2006). Chimaera free sequences were then submitted to NCBI Genbank and Accession numbers acquired.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 การรวบรวมวัฒนธรรมของไส้เดือนดินโหมไส้เดือน E. P. excavatus ได้รับจากโรง vermicomposting ของสัตว์พันธุศาสตร์ฝ่าย อินเดียสัตวแพทย์ สถาบันวิจัย Izatnagar แบร์ไรล์ลี่ อินเดีย (ละติจูดและลองจิจูด-28.40◦ N, 79.43◦ E) และอยู่ใน lignocellulolytic ชีวมวลตามอาหารที่ ogy ส่วน Microbiol สถาบันวิจัยเกษตร ICAR อินเดีย (28◦40 ละติจูดลองจิจูด N 77◦12 E), นิวเดลี มีดำเนินการวิเคราะห์หลัง d 30 เจริญเติบโต2.2 การสกัดดีเอ็นเอทั้งหมดจากลำไส้ของไส้เดือนดิน amplification ของยีน 16S rRNA ก่อสร้างไลบรารีและลำดับวิเคราะห์สกัดดีเอ็นเอจากโหม E. P. excavatus ไส้ (10 ต่อไส้เดือนดินพันธุ์) ที่ดำเนินการโดยใช้การไฟฟ้าดินดีเอ็นเอแยกชุด (MoBio Laboratories Inc. คาร์ลส สหรัฐอเมริกา) ตามโพรโทคอของผู้ผลิต Amplification ของ 16S rRNA ใช้ไพรเมอร์สากลสอง ป่า (5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3) ไปข้างหน้า และกลับค่า pH (5 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 3) (เอ็ดเวิร์ด et al.1989) ดำเนินการ Amplification ได้รับการดำเนินการปริมาณปฏิกิริยา 100 l 50 – 100 ng ของแม่แบบดีเอ็นเอ ป่าไพรเมอร์ และค่า pH (100 ng แต่ละ), dATP, dCTP, dTTP และ dGTP (200 M แต่ละ),บัฟเฟอร์ปฏิกิริยาพอลิเมอเรส Taq (10 ราย) 10 l และ 1.0 U Taq พอลิเมอเรส เงื่อนไขที่ใช้สำหรับ amplification มีดังนี้: denaturation เริ่มต้นใน 5 นาทีที่ 95 ◦C ตามวงจร 30 การ denaturation ที่ 95 ◦C สำหรับ 30 s การอบเหนียวที่ ◦C 52 40 s และส่วนขยายที่ ◦C 72 1 นาทีและ final ส่วนขยายที่ ◦C 72 10 นาทีผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการแก้ไข โดย electrophoresis ที่ 60 V สำหรับ h 1 ในเจล 1.2% agarose ในบัฟเฟอร์เต้ซื้อ 1ไลบรารีโคลนผลิตภัณฑ์ PCR ได้สร้างชุดสินค้าโคลน TA (Invitrogen) ด้วย pGMTT เวกเตอร์เวกเตอร์กลาย Transformants สำเร็จได้ inoculated เป็นซุป Luria Bertani ประกอบด้วยแอมพิซิลลิน และสามารถเติบโตข้ามคืน ไลบรารีหนึ่งที่แต่ละตัวอย่างสองไส้เตรียมไว้ Plasmids จากไลบรารีถูกสกัดโดยใช้ QIAprep หมุน Miniprep ชุด (Qiagen) ยีนโคลนคอน-taining putative 16S rRNA ที่ฉาย โดย amplification plasmids แยกกับไพรเมอร์ M13F และ M13R ผลิตภัณฑ์มี visualized ในเจ 1% agarose ให้สถานะของการแทรกขนาดคาดไว้ โคลนซึ่งจัดแสดงการแทรกหรือการแทรกขนาดใหญ่มาก หรือเล็กลงกว่าที่คาดไว้ไม่ ถูกแยกออกจากการจัดลำดับ จัดลำดับโดยใช้วงจร dideoxy กับร้อยละ fluores ต่อ และเรียกใช้การ 3130xl ABI Biosystems ใช้ปริซึมอัตโนมัติ DNA sequencer เวกเตอร์ตามลำดับถูกตัดออกโดยใช้เครื่องมือ VecScreen ของ NCBI (Johnson et al. 2008), และ chimaeras ได้ฉาย โดยซอฟต์แวร์เป็ดมัลลาร์ด (Ashelford และ al., 2006) ลำดับ Chimaera ฟรีแล้วส่งมาที่ NCBI Genbank และหมายเลขทะเบียนมา

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 คอลเลกชันของวัฒนธรรมไส้เดือน
ไส้เดือนอี foetida และพี excavatus ที่ได้รับจากโรงไส้เดือนของกองพันธุศาสตร์สัตว์, อินเดียสัตวแพทย์สถาบันวิจัย Izatnagar, Bareilly, อินเดีย (ละติจูดและลองจิจูด - 28.40◦ไนโตรเจน79.43◦ E) และการบำรุงรักษา ในชีวมวล lignocellulolytic ฟีอยู่ที่กอง ogy Microbiol, ICAR อินเดียสถาบันวิจัยเกษตร (ละติจูด28◦40ไม่มี; ลองจิจูด77◦12 E), นิวเดลี การวิเคราะห์ได้ดำเนินการหลังจาก 30 วันของการเจริญเติบโต. 2.2 การสกัดดีเอ็นเอจากทั้งหมดลำไส้ไส้เดือน, ไอออนบวก Fi Ampli ของยีน 16S rRNA การก่อสร้างห้องสมุดและการวิเคราะห์ลำดับการสกัดดีเอ็นเอจากอี foetida และพี excavatus ลำไส้ (10 ต่อสายพันธุ์ไส้เดือน) ได้รับการดำเนินการโดยใช้ดีเอ็นเอดินเพาเวอร์แยก Kit (Mobio ห้องปฏิบัติการ Inc . คาร์ลส, ประเทศสหรัฐอเมริกา) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ไอออนบวก Fi Ampli ของ 16S rRNA จ้างสองไพรสากลไปข้างหน้า PA (5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3) และค่า pH ย้อนกลับ (5 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 3) (เอ็ดเวิร์ดและ al.1989) กำลังดำเนินการ ไอออนบวก Fi Ampli ได้ดำเนินการในปริมาณปฏิกิริยา 100 ลิตรที่มี 50-100 ศึกษาของดีเอ็นเอแม่แบบไพรป่าและพีเอช (100 ng แต่ละ), dATP, dCTP, Dttp และ DGTP (200 M แต่ละ), Taq โพลิเมอร์บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา (10 ×) 10 ลิตรและ 1.0 U Taq โพลิเมอร์ เงื่อนไขที่ใช้ในการประจุบวก Fi Ampli มีดังนี้ denaturation เริ่มต้นเวลา 5 นาทีที่ 95 ◦Cตามด้วย 30 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 95 ◦Cเป็นเวลา 30 วินาที, การอบที่ 52 ◦C 40 และนามสกุลที่ 72 ◦Cเป็นเวลา 1 นาทีและ ขยาย NAL ในสายที่ 72 ◦Cเป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ได้รับการแก้ไขโดย electrophoresis ที่ 60 V เป็นเวลา 1 ชั่วโมงใน 1.2% agarose เจลใน 1 ×ห้องสมุด TAE buffer.Clone ของผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ TA โคลน Kit (Invitrogen) กับเวกเตอร์ pGMTT ง่ายเวกเตอร์ transformant ที่ประสบความสำเร็จได้รับเชื้อเข้าไปในน้ำซุป Luria-Bertani มี ampicillin และได้รับอนุญาตที่จะเติบโตในชั่วข้ามคืน หนึ่งห้องสมุดแต่ละสองตัวอย่างลำไส้ถูกจัดทำขึ้น พลาสมิดจากห้องสมุดถูกสกัดโดยใช้ QIAprep ปั่น miniprep Kit (Qiagen) โคลนนิ่งซีก 16S สมมุติยีน rRNA ถูกคัดกรองโดยไอออนบวก Fi Ampli ของพลาสมิดที่แยกกับ M13F และไพร M13R ผลิตภัณฑ์ที่ได้รับการมองเห็นใน 1% agarose เจลเพื่อให้แน่ใจว่าการปรากฏตัวของเม็ดมีดที่มีขนาดที่คาดว่าจะ โคลนซึ่งแสดงแทรกหรือแทรกมีขนาดใหญ่ขึ้นหรือเล็กลงกว่าที่คาดได้รับการยกเว้นจากการเรียงลำดับ ลำดับที่ได้กระทำโดยการใช้วงจร dideoxy กับชั้น uores- Terminators ร้อยและทำงานใน 3130xl Applied Biosystems ปริซึม ABI ซีเควนดีเอ็นเออัตโนมัติ ลำดับเวกเตอร์ที่ใช้ถูกกำจัดโดยใช้เครื่องมือ VecScreen ของ NCBI (จอห์นสัน et al. 2008) และ chimaeras ถูกคัดกรองโดยซอฟต์แวร์เป็ด (Ashelford et al., 2006) Chimaera ลำดับฟรีถูกส่งไปยัง NCBI Genbank และตัวเลขการเข้าซื้อกิจการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . คอลเลกชันของไส้เดือนวัฒนธรรม
ไส้เดือน . . excavatus เฟติดาได้จาก vermicomposting หลั่งของสัตว์ พันธุกรรม ส่วนอินเดียสัตวแพทย์สถาบันวิจัย izatnagar แบร์ไรล์ลี่ , อินเดีย ( ละติจูดและลองจิจูด– 28.40 ◦ N , 79.43 ◦ E ) และรักษามวล lignocellulolytic ตามอาหารที่กอง ธนิดา เหรียญทอง B Sc ogy ,อินเดียสถาบันด้านวิจัยการเกษตร ( ละติจูด 28 ◦ 40 n ; ลองจิจูด 77 ◦ 12 E ) , นิวเดลี การวิจัยครั้งนี้ดำเนินการหลังจาก 30 D ของการเจริญเติบโต .

. . การสกัดดีเอ็นเอทั้งหมดจากไส้เดือนออกมา ampli ไอออนบวกของ 16S rRNA ยีนถ่ายทอด การสร้างห้องสมุดและลำดับการวิเคราะห์
การสกัดดีเอ็นเอจาก E เฟติดา .excavatus ไส้ ( 10 ต่อไส้เดือนดินสายพันธุ์ ) คือการใช้พลังดินการสกัดดีเอ็นเอ Kit ( mobio ห้องปฏิบัติการอิงค์ , คาร์ลสแบด , USA ) ตามขั้นตอนของผู้ผลิต จึง ampli ไอออนบวกของเบส 16S rRNA โดยใช้ไพรเมอร์ 2 สากลส่ง PA ( 5 agagtttgatcctggctcag 3 ) และกลับ ( pH 5 aaggaggtgatccagccgca 3 ) ( Edwards et al . 1989 ) ได้ดำเนินการการ ampli จึงได้ดำเนินการใน 100 ชั้นปฏิกิริยา ปริมาณ 50 – 100 กรัมประกอบด้วยดีเอ็นเอแม่แบบจาก PA และ pH ( 100 ของแต่ละคน ) datp dctp dttp , และ , dgtp ( 200 เมตรแต่ละ ) ,
แทคโดยปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ ( 10 × 10 ลิตรและ 1.0 U ได้ดีโดย . เงื่อนไขการใช้ ampli จึงเป็นดังนี้ : ครั้งแรก ( สำหรับ 5 นาทีที่ 95 ◦ C ตามด้วย 30 รอบ ( 95 ◦เป็นเวลา 30 วินาทีการอบอ่อนที่ 52 ◦ C 40 และส่วนขยายที่ 72 ◦องศาเซลเซียสนาน 1 นาที และจึง นาล ส่วนขยายที่ 72 ◦ C 10 นาทีผลิตภัณฑ์ที่ถูกแก้ไขโดยวิธี PCR ที่ 60 V เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ใน 1.2 % เจลในบัฟเฟอร์เท 1 × โคลนห้องสมุดของผลิตภัณฑ์ PCR ถูกสร้างโดยใช้ทาโคลน ชุด ( Invitrogen ) กับ pgmtt เวกเตอร์ง่าย