2.2. PCR analysisFor DNA extraction

2.2. PCR analysis
For DNA extraction, the fungus was grown in 100 mL of PD liquid
media for 48 h at 28 C. Fungal genomic DNA was extracted
from lyophilized mycelia using CTAB method (Sambrook and Fritsch,
1998). In order to confirm hph gene containing plasmid integration
into the host chromosome, transformants’ chromosomal
DNA was used as a template. Two pairs of PCR primers were used
to detect the insertion of the selective markers, hph gene (expected
with 650 bp) and amp gene (expected with 830 bp) in the mutants.
The forward primer 50-CAGGGTGTCACGTTGCAA-30 and reverse
primer 50-CTTCTGCGGGCGATTTGT-30 were designed and used
for hph. Whereas, forward primer: 50-CTTATTCCCTTCT TTGCG-30 ,
and reverse primer 50-CAATGCTTAATCAGTGAG-30 were used
for amp. Specific PCR fragments were amplified as follows: 95 C
for 3 min; 35 cycles of 94 C for 1 min, 56 C for 1 min; and
72 C for 1 min; then 72 C for 10 min. The PCR mix contained
1.0 lL of DNA template (1.0 lg lL1), 2.5 lL of 10 Taq buffer,
2.0 lL of dNTPs (10.0 mmol L1), 1.0 lL of each primer
(10.0 lmol L1), and 1.0 lL of Taq polymerase (5.0 Units lL1)
and topped to 25 lL volume by sterile super pure water
(Millipore, US).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. PCR วิเคราะห์การสกัดดีเอ็นเอ เชื้อราถูกปลูกใน 100 มิลลิลิตรของ PD ของเหลวสื่อสำหรับ 48 ชั่วโมงที่ 28 เซลเซียสเชื้อราออกดีเอ็นเอที่ถูกแยกจาก mycelia lyophilized ใช้วิธี CTAB (Sambrook และ Fritsch1998) . เพื่อยืนยันรวม plasmid ที่ประกอบด้วยยีนของ hphในการโฮสต์โครโมโซม transformants ของโครโมโซมดีเอ็นเอถูกใช้เป็นแม่แบบ คู่ที่สองของไพรเมอร์ PCR ถูกนำมาใช้การตรวจสอบการแทรกเครื่องหมาย selective, hph ยีน (คาดว่ามี 650 bp) และแอมป์ยีน (ที่คาดไว้กับ 830 bp) ในสายพันธุ์รองพื้นไปข้างหน้า 50-CAGGGTGTCACGTTGCAA-30 และย้อนกลับออกแบบ และใช้สีรองพื้น 50-CTTCTGCGGGCGATTTGT-30สำหรับ hph ในขณะที่ รองพื้นไปข้างหน้า: 50-CTTATTCCCTTCT TTGCG-30และใช้รองพื้นกลับ 50-CAATGCTTAATCAGTGAG-30สำหรับแอมป์ เศษเฉพาะ PCR ถูกขยายเป็นดังนี้: 95 C3 นาที รอบ 35 ของ 94 C สำหรับ 1 นาที 56 C 1 นาที และC 72 1 นาที แล้ว 72 C 10 นาที ผสม PCR อยู่1.0 ของดีเอ็นเอต้นแบบ (1.0 lg lL 1), 2.5 lL lL 10 Taq บัฟเฟอร์2.0 ของ dNTPs (10.0 mmol L 1), 1.0 lL lL ของรองพื้นแต่ละ(10.0 lmol L 1), และ 1.0 lL ของ Taq พอลิเมอเรส (5.0 หน่วย lL 1)และบุการไดรฟ์ข้อมูล lL 25 โดยน้ำบริสุทธิ์พิเศษที่ผ่านการฆ่าเชื้อ(มิลลิพอร์ สหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 วิเคราะห์ PCR
สำหรับการสกัดดีเอ็นเอเชื้อราที่ถูกปลูกใน 100 มลของของเหลว PD
สื่อเป็นเวลา 48 ชั่วโมงวันที่ 28 องศาเซลเซียส ดีเอ็นเอของเชื้อราเป็นสารสกัด
จากเส้นใยแห้งโดยใช้วิธี CTAB (Sambrook และ Fritsch,
1998) เพื่อยืนยันยีน HPH ที่มีพลาสมิดบูรณาการ
เข้าไปในโครโมโซมโฮสต์โครโมโซม transformants '
ดีเอ็นเอถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบ คู่ที่สองของไพรเมอร์ PCR ถูกนำมาใช้
ในการตรวจสอบการแทรกของเครื่องหมายเลือกยีน HPH (คาดว่า
มี 650 bp) และยีนแอมป์ (คาดว่าจะมี 830 BP) ในการกลายพันธุ์.
ไปข้างหน้าไพรเมอร์ 50 CAGGGTGTCACGTTGCAA-30 และย้อนกลับ
ไพรเมอร์ 50 CTTCTGCGGGCGATTTGT-30 ได้รับการออกแบบและใช้
สำหรับ HPH ขณะที่ไพรเมอร์ไปข้างหน้า: 50-CTTATTCCCTTCT TTGCG-30,
และย้อนกลับไพรเมอร์ 50 CAATGCTTAATCAGTGAG-30 ถูกนำมาใช้
สำหรับแอมป์ โดยเฉพาะเศษ PCR ถูกขยายดังนี้ 95 C
เป็นเวลา 3 นาที; 35 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 56 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที?; และ
72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที; จากนั้น 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ผสม PCR ที่มีอยู่
1.0 LL ดีเอ็นเอของแม่แบบ (1.0 LG ll? 1) 2.5 LL 10? Taq บัฟเฟอร์
2.0 LL ของ dNTPs (10.0 มิลลิโมล L? 1) 1.0 LL ของแต่ละไพรเมอร์
(10.0 lmol L? 1) และ 1.0 LL ของ Taq โพลิเมอร์ (5.0 หน่วย ll? 1)
และมีวงเงินถึง 25 ปริมาณ LL โดยผ่านการฆ่าเชื้อซุปเปอร์ น้ำบริสุทธิ์
(คสหรัฐ)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . การวิเคราะห์ดีเอ็นเอการสกัดดีเอ็นเอ เชื้อรา ที่ปลูกในน้ำ 100 มิลลิลิตร ของผู้กำกับสื่อสำหรับ 48 H ที่ 28 C . เชื้อราจีโนมดีเอ็นเอจากโปรตีนเส้นใยโดยใช้วิธีการ ctab ( sambrook Fritsch และ ,1998 ) เพื่อยืนยันการ hph ยีนที่มีพลาสมิดเป็นเจ้าภาพ transformants " โครโมโซมโครโมโซมดีเอ็นเอถูกใช้เป็นแม่แบบ ของ PCR ไพรเมอร์ 2 คู่ใช้เพื่อตรวจหาการแทรกของยีนเครื่องหมายการ hph ( คาดว่ากับ 650 BP ) และยีนแอมป์ ( คาดหวังกับ 830 bp ) มนุษย์กลายพันธุ์ส่งต่อรองพื้น 50-cagggtgtcacgttgcaa-30 และย้อนกลับรองพื้น 50-cttctgcgggcgatttgt-30 ถูกออกแบบและใช้สำหรับ hph . ส่วน forward primer : ttgcg-30 50-cttattcccttct ,และกลับ 50-caatgcttaatcagtgag-30 ใช้ไพรเมอร์สำหรับแอมป์ ซึ่งเป็นชิ้นส่วนเฉพาะของ 95 C ดังนี้3 นาที ; 35 รอบ 94 องศาเซลเซียสนาน 1 นาที 56 องศาเซลเซียสนาน 1 นาที และ72 องศาเซลเซียสนาน 1 นาที แล้ว 72 C 10 นาที ร่วมผสม ประกอบด้วยสำหรับจะของแม่แบบดีเอ็นเอ ( สำหรับ LG ll1 ) 2.5 จะ 10 ทัค บัฟเฟอร์2.0 จะ dntps ( 10.0 มิลลิโมล L1 ) , 1.0 จะแต่ละไพรเมอร์( 10.0 lmol L1 ) และจะใช้สำหรับแท็ก ( 5.0 หน่วย ll1 )และราด 25 จะเป็นหมันน้ำบริสุทธิ์ปริมาตรซูเปอร์( มิลลิ , เรา )