SJCRH30 cells were seeded at a dens

SJCRH30 cells were seeded at a density of 5,000 cells/well in BD biocoat poly-D-lysine-coated 96-well plates and incubated at 37 °C overnight. Cells were then treated with 10x solutions of compounds added directly to the growth medium (RPMI 1640 supplemented with 10% FBS) and incubated at 37 °C for the designated time period. Cell nuclei were stained with a 0.1 μg/ml final concentration of Hoechst 33342 (Invitrogen) at the same time as the compound treatment. 10 μl of 10x Hoechst dye in Phosphate Buffered Saline was added directly to the
3 2
growth medium in the wells, and the plate was incubated at 37 °C for the remaining time. Cells had to be stained in two separate steps because Hoechst 33342 is not compatible with the Hands Buffered Saline Solution (HBSS) that is required for the tubulin staining protocol.
To stain microtubules with Tubulin Tracker 488 (TT488), a 500 μM intermediate stock was first prepared by combining 1 mM TT488 (Invitrogen) with an equal volume of 20% Pluronic F-127 in DMSO (Invitrogen). Then a 200 nM TT488 staining solution was prepared from the intermediate stock in HBSS. The growth medium containing the Hoechst dye was removed from the wells, and the cells were rinsed once with warm HBS (100μl per well). The HBSS rinse was replaced with warmed 200 nM TT488 staining solution (100μl per well). The plate was then returned to the 37 °C incubator for 20 minutes before imaging on an Image Xpress Micro system equipped with an enviromental control chamber warmed to 37 °C. Hoeachst 33342 and TT488 staining were visualized using DAPI filter and a FITC filter, respectively. Transmitted light images were also collected to assess cell morphology

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

SJCRH30 เซลล์ถูก seeded ที่ความหนาแน่นของ 5000 เซลล์/ดีใน BD biocoat โพลีดีแอล-ไลซีนเคลือบดี 96 แผ่น และ incubated ที่ 37 ° C ค้างคืน เซลล์ได้แล้วรับการรักษา ด้วยโซลูชั่น x 10 สารเพิ่มตรงกลางเจริญเติบโต (RPMI 1640 เสริม ด้วย 10% FBS) และ incubated ที่ 37 ° C สำหรับรอบระยะเวลาที่กำหนด แอลฟาเซลล์ถูกสี ด้วยสมาธิสุดท้าย μg/ml 0.1 ของอย่างไร Hoechst 33342 (Invitrogen) ในเวลาเดียวกันเป็นการรักษาที่ซับซ้อน 10 μl ของสีย้อมอย่างไร Hoechst x 10 ในฟอสเฟต Buffered Saline เข้ามาโดยตรงไป3 2เชื้อในบ่อ และจานถูก incubated ที่ 37 ° C ในเวลาที่เหลือ เซลล์มีสีสองขั้นตอนแยกต่างหากเนื่องจากไม่เข้ากันกับมือ Buffered Saline โซลูชัน (HBSS) ที่จำเป็นสำหรับ tubulin ย้อมสีโพรโทคอลอย่างไร Hoechst 33342สิบแต้ม microtubules ด้วย Tubulin Tracker 488 (TT488), คลังกลาง 500 μM ถูกก่อนเตรียมโดย 1 mM TT488 (Invitrogen) ด้วยปริมาณเท่ากับ 20% Pluronic F-127 ใน DMSO (Invitrogen) แล้ว 200 nM TT488 โซลูชันการย้อมสีที่เตรียมจากหุ้นใน HBSS ระดับกลาง เชื้อที่ประกอบด้วยสีย้อมอย่างไร Hoechst ถูกเอาออกจากบ่อ และเซลล์ถูก rinsed ครั้ง มี HBS อบอุ่น (100μl ต่อดี) ล้าง HBSS ถูกแทนที่ ด้วย warmed 200 nM TT488 ย้อมสีโซลูชั่น (100μl ต่อดี) จานนั้นได้ถูกกลับไปบ่มเพาะวิสาหกิจ 37 ° C 20 นาทีก่อนภาพในระบบไมโคร Xpress ภาพการมีหอควบคุม enviromental warmed ถึง 37 องศาเซลเซียส Hoeachst 33342 และย้อมสี TT488 มี visualized ใช้กรอง DAPI และตัว FITC ตามลำดับ ภาพแสงนำส่งยังได้ถูกเก็บรวบรวมเพื่อประเมินสัณฐานวิทยาเซลล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เซลล์ SJCRH30 เป็นเมล็ดที่มีความหนาแน่น 5,000 เซลล์ / ดีใน BD Biocoat โพลี-D-ไลซีนเคลือบแผ่น 96 ดีและบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในชั่วข้ามคืน เซลล์ได้รับการรักษาแล้วด้วย 10x โซลูชั่นของสารเพิ่มโดยตรงกับสื่อการเจริญเติบโต (RPMI 1640 เสริมด้วย 10% FBS) และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นช่วงเวลาที่กำหนด นิวเคลียสของเซลล์ที่ถูกย้อมด้วย 0.1 ไมโครกรัม / มลเข้มข้นสุดท้ายของเฮิ 33342 (Invitrogen) ในเวลาเดียวกันกับการรักษาสารประกอบ 10 ไมโครลิตรของ 10x ย้อมเฮิในฟอสเฟต Buffered Saline ถูกเพิ่มโดยตรงกับ
3 2
สื่อการเจริญเติบโตในบ่อและแผ่นถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลาที่เหลือ เซลล์จะต้องมีการย้อมสีในสองขั้นตอนที่แยกจากกันเพราะเฮิ 33342 เข้ากันไม่ได้กับมือ Buffered น้ำเกลือ (HBSS) ที่จำเป็นสำหรับโปรโตคอลการย้อมสี tubulin.
เพื่อ microtubules คราบ tubulin ติดตาม 488 (TT488), 500 ไมครอนหุ้นกลางเป็น จัดทำครั้งแรกโดยการรวม 1 มิลลิ TT488 (Invitrogen) ที่มีปริมาณเท่ากับ 20% Pluronic F-127 ใน DMSO (Invitrogen) แล้ว 200 นาโนเมตรสารละลายสีย้อม TT488 ถูกจัดทำขึ้นจากหุ้นกลางใน HBSS สื่อการเจริญเติบโตที่มีสีย้อมเฮิถูกลบออกจากบ่อและเซลล์ถูกล้างครั้งเดียวกับ HBS อุ่น (100μlต่อกัน) ล้าง HBSS ถูกแทนที่ด้วยความอบอุ่น 200 นาโนเมตรสารละลายสีย้อม TT488 (100μlต่อกัน) จานจากนั้นก็กลับไป 37 องศาเซลเซียสศูนย์บ่มเพาะเป็นเวลา 20 นาทีก่อนที่จะถ่ายภาพในระบบภาพ Xpress ไมโครพร้อมกับห้องควบคุมสิ่งแวดล้อมอุ่นถึง 37 ° C Hoeachst 33342 และการย้อมสี TT488 ถูกมองเห็นใช้ตัวกรองและไส้กรอง DAPI FITC ตามลำดับ ส่งภาพแสงยังถูกเก็บรวบรวมเพื่อประเมินลักษณะทางสัณฐานวิทยาเซลล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

sjcrh30 เซลล์มีเมล็ดในอัตราความหนาแน่น 5 , 000 เซลล์ / ดีใน biocoat poly-d-lysine-coated 96 แผ่น BD ก็บ่มที่ 37 ° C ในชั่วข้ามคืน การรักษาด้วยเซลล์แล้วทำให้โซลูชั่นของสารประกอบเพิ่มโดยตรงกับการเจริญเติบโต ( RPMI 1640 ) เสริมด้วย 10% FBS ) บ่มที่ 37 ° C ในเวลาที่กำหนดระยะเวลา เซลล์นิวเคลียสถูกย้อมด้วยสี 01 μ g / ml ความเข้มข้นสุดท้าย Hoechst 33342 ( Invitrogen ) ในเวลาเดียวกัน เช่น การผสม 10 μผม 10x สี Hoechst เกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่เพิ่มโดยตรงกับ
2
การเจริญเติบโตปานกลาง ในบ่อ และ จาน บ่มที่ 37 ° C เป็นเวลาที่เหลือเซลล์ต้องย้อมในสองขั้นตอนที่แยกต่างหากเพราะ Hoechst 33342 ไม่เข้ากันได้กับมือในน้ำเกลือ ( hbss ) ที่จำเป็นสำหรับทูบูลินชนิดโปรโตคอล .
คราบไมโครทูบูลกับติดตามทิวบูลิน 488 ( tt488 ) , 500 μ M กลางหุ้นเป็นครั้งแรกที่เตรียมไว้ โดยรวม 1 มม. tt488 ( Invitrogen ) กับ ปริมาณเท่ากับ 20 % ชนิด f-127 ใน DMSO ( Invitrogen )แล้ว tt488 200 nm . สารละลายที่เตรียมจากหุ้นระดับกลางใน hbss . การเจริญเติบโตปานกลางที่มี Hoechst สีย้อมจะถูกลบออกจากบ่อ และเซลล์ก็ล้างอีกครั้งกับ HBS อบอุ่น ( 100 μผมต่อด้วย ) การ hbss ล้างถูกแทนที่ด้วยอุ่น 200 nm tt488 staining โซลูชั่น ( 100 μผมต่อด้วย )จานแล้วกลับไปที่ 37 องศา C อบประมาณ 20 นาที ก่อนที่ภาพบนภาพ Xpress ไมโครระบบอุปกรณ์ที่มีการควบคุมสิ่งแวดล้อมห้องอุ่นถึง 37 องศา hoeachst 33342 tt488 staining และมีภาพการใช้ตัวกรองและตัวกรอง dapi fitc ตามลำดับ แสงภาพที่ถูกรวบรวมเพื่อประเมินรูปร่างของเซลล์