2.1. Preparation of the DG-LRELicor

2.1. Preparation of the DG-LRE
Licorice root derived from G. uralensis was purchased from an
herbal drug market (Youngju, Korea). The dried roots were cut
into thin slices, mixed with distilled water (distilled water:dried
root ratio of 20:1 [v/w]) and heated for 2 h in a round bottom
flask. The distilled water was removed and 95% ethanol was
added (95% ethanol:residue ratio of 15:1 [v/w]) to the flask. The
mixture was heated at 78 C for 2 h, and the extract was evaporated.
Next, 99% ethanol was added to the extract (the ethanol
solution). The ethanol solution was filtered using a custom-made
column (6.5 cm  60 cm) filled with Diaion HP-20 adsorbent
(Mitsubishi Chemical Corporation, Minato-ku, Tokyo, Japan). The
column was equilibrated with distilled water, 50% ethanol and
99% ethanol. The final licorice extracts (DG-LRE) were passed
through the column, evaporated, and used for assays (PCT/
KR2012/000766). The extracts were suspended in dimethyl
sulfoxide (DMSO; Sigma, St Louis, MO) at 50 mg/ml for subsequent
assays.
2.2. Chromatographic system
High performance liquid chromatography (HPLC) analysis
was conducted on a Dionex system (Sunnyvale, CA) consisting of
an Ultimate 3000 pump, an Ultimate 3000 autosampler, and an
Ultimate 3000 detector. A Dionex Chromeleon was used to
acquire and integrate data. The analytical column was a Sheseido
Capcellpak C18, 4.6 mm i.d. and 15 cm, which was maintained at
room temperature. The mobile phase was a linear gradient of
0.1% formic acid and acetonitrile (0 min 70:30, 0e5 min 60:40,
5e55 min 20:80, 55e56 min 70:30, 56e60 min 70:30) at
a flow rate of 1 ml/min. DG-LRE and glycyrrhizin were
prepared at 10 mg/ml and 0.1 mg/ml respectively, and 20 ml was
injected into the HPLC system. The column eluent was monitored
at UV 254 nm.
2.3. Determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and
minimum bactericidal concentration (MBC)
The MIC and MBC values were determined using a microdilution
assay according to the National Committee for Clinical
Laboratory Standards [18]. Briefly, S. mutans was grown in brain
heart infusion (BHI) broth at 37 C in a 5% CO2 aerobic atmosphere
to its mid exponential phase (OD600 ¼ 0.5, approximately
6.5  107 colony forming unit/ml) and added to a 96-well plate to
a final concentration of 1  106 CFU/ml. For measuring MIC, DGLRE
was added to each well to final concentrations of 0.5, 1, 2, 4, 8,
16, and 32 mg/ml. The final DMSO concentration in each well was
1%. A well containing ampicillin (final concentration, 100 mg/ml)
was used as the positive control, and culture medium only and
culture medium containing 1% DMSO were used as double
negative controls. After incubating for 24 h under the appropriate
conditions, the lowest DG-LRE concentration that inhibited
visible growth was considered the MIC value. To determine MBC
values, 10 ml of bacterial culture from each well at the MIC value
determined above was diluted 100- through 10,000-fold and
plated onto a BHI agar plate for each bacterial strain. The agar
plate was incubated at 37 C for 24 h and the number of colonies
was then counted. The concentration that killed 99.9% of the
bacteria was considered the MBC value.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.1 การเตรียมการของ LRE กิจรากชะเอมเทศมา uralensis กรัมที่ซื้อจากการตลาดยาสมุนไพร (Youngju เกาหลี) มีตัดรากแห้งเป็นชิ้นบาง ๆ ผสมกับน้ำกลั่น (น้ำกลั่น: แห้งรากอัตราส่วน 20:1 [v/w]) และความร้อนสำหรับ h 2 ล่างรอบหนาว มีเอาน้ำกลั่น และเอทานอล 95% ได้เพิ่ม (95% เอทานอล: สารตกค้างอัตราส่วน 15:1 [v/w]) หนาวนี้ ที่ส่วนผสมมีความร้อนที่ 78 C สำหรับ 2 h และการดึงข้อมูลหายไป, 99% เอทานอลถูกเพิ่มเข้าไป (ในเอทานอลสารสกัดจากการแก้ปัญหา) ใช้ตัวเลือกการแก้ปัญหาเอทานอลถูกกรองคอลัมน์ (6.5 ซม. 60 ซม.) ด้วย adsorbent Diaion HP-20(บริษัทมิตซูบิชิเคมี ย่าน ku โตเกียว ญี่ปุ่น) ที่คอลัมน์ถูก equilibrated กับน้ำกลั่น เอทานอล 50% และเอทานอล 99% สารสกัดจากชะเอมเทศสุดท้าย (กิจ-LRE) ได้ผ่านผ่านคอลัมน์ หายไป และใช้สำหรับ assays (PCT /KR2012/000766) สารสกัดถูกหยุดชั่วคราวใน dimethylsulfoxide (DMSO ซิก St Louis, MO) ที่ 50 mg/ml ในเวลาต่อมาassays2.2. chromatographic ระบบวิเคราะห์ของเหลว chromatography (HPLC) ประสิทธิภาพสูงวิธีการใช้ระบบ Dionex (Sunnyvale, CA) ประกอบด้วยการปั๊ม 3000 สุดยอด สุด 3000 autosampler และเครื่องตรวจจับ 3000 สุดยอด ใช้ Dionex Chromeleonได้รับ และรวมข้อมูล คอลัมน์การวิเคราะห์ถูก Sheseido เป็นCapcellpak C18 ประชาชน 4.6 มม.และ 15 ซม. ซึ่งถูกเก็บรักษาที่ที่อุณหภูมิห้อง เฟสเคลื่อนไล่เส้นของ0.1% กรดและ acetonitrile (0 min 70:30, 0e5 ต่ำสุด 60:405e55 ต่ำสุด 20:80, 55e56 ต่ำสุด 70:30, 56e60 ต่ำสุด 70:30) ที่อัตราไหล 1 มิลลิลิตร/นาที LRE กิจและ glycyrrhizin ถูกเตรียมที่ 10 mg/ml และ 0.1 mg/ml ตามลำดับ และ 20 ml เป็นฉีดเข้าไปในระบบ HPLC Eluent คอลัมน์ถูกตรวจสอบที่ UV 254 nm2.3 การกำหนดความเข้มข้นลิปกลอสไขต่ำสุด (MIC) และเข้มข้น bactericidal ต่ำสุด (ช่อง MBC)ค่า MIC และช่อง MBC ได้ถูกกำหนดโดยใช้การ microdilutionassay ตามคณะกรรมการแห่งชาติสำหรับ Clinicalมาตรฐานห้องปฏิบัติการ [18] สั้น ๆ S. แมงแลงได้เติบโตขึ้นในสมองซุปคอนกรีต (BHI) หัวใจที่ 37 C ในบรรยากาศแอโรบิก 5% CO2ระยะของเอ็กซ์โพเนนเชียกลาง (OD600 ¼ 0.5 ประมาณอาณานิคม 6.5 107 เป็นหน่วย/มล) และเพิ่มจานดี 96 ไปเข้มข้นสุดท้ายของ 1 106 CFU/ml วัด MIC, DGLREได้เพิ่มความเข้มข้นสุดท้ายกันไปแต่ละ 0.5, 1, 2, 4, 816 และ 32 mg/ml มีความเข้มข้น DMSO ขั้นสุดท้ายในแต่ละบ่อ1% ยังดีที่มีแอมพิซิลลิน (ความเข้มข้นสุดท้าย 100 mg/ml)ใช้เป็นควบคุมบวก และวัฒนธรรมขนาดกลางเท่านั้น และวัฒนธรรมสื่อที่มี 1% DMSO ใช้เป็นคู่ควบคุมค่าลบ หลังจาก incubating ใน 24 ชมภายใต้การที่เหมาะสมเงื่อนไข สมาธิกิจ LRE ต่ำสุดที่ห้ามมองเห็นการเจริญเติบโตได้พิจารณาค่า MIC การกำหนดช่อง MBCค่า 10 ml ของแบคทีเรียจากดีแต่ละที่ค่า MICกำหนดข้างต้น ได้แตกออก 100-ผ่าน 10,000-fold และชุบใส่จาน agar BHI สำหรับแต่ละต้องใช้แบคทีเรีย Agarจานถูก incubated ที่ 37 C 24 h และหมายเลขของอาณานิคมถูกแล้วนับ ความเข้มข้นที่ฆ่า 99.9% ของการแบคทีเรียถูกถือว่าเป็นค่าของช่อง MBC

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.1 เตรียม DG-LRE
รากชะเอมมาจาก G. uralensis ซื้อมาจาก
ตลาดยาสมุนไพร (Youngju เกาหลี) รากแห้งถูกตัด
เป็นชิ้นบาง ๆ ผสมกับน้ำกลั่น (น้ำกลั่น: แห้ง
รากของอัตราส่วน 20: 1 [v / w]) และให้ความร้อนเป็นเวลา 2 ชั่วโมงในด้านล่างรอบ
ขวด น้ำกลั่นจะถูกลบออกและ 95% เอทานอลได้รับการ
เพิ่ม (95% เอทานอล: อัตราการตกค้างของ 15: 1 [v w /]) เพื่อขวด
ส่วนผสมที่ถูกความร้อนที่ 78 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 ชั่วโมงและสารสกัดจากได้รับการระเหย
ถัดไป 99% เอทานอลถูกบันทึกอยู่ในสารสกัด (เอทานอล
การแก้ปัญหา) การแก้ปัญหาเอทานอลถูกกรองโดยใช้ที่กำหนดเองทำ
คอลัมน์ (6.5 ซม 60 ซม.) เต็มไปด้วย Diaion HP-20 ตัวดูดซับ
(มิตซูบิชิเคมิคอลคอร์ปอเรชั่น, Minato-ku, โตเกียว, ญี่ปุ่น)
คอลัมน์ equilibrated ด้วยน้ำกลั่น 50% เอทานอลและ
เอทานอล 99% สารสกัดจากชะเอมสุดท้าย (DG-LRE) ถูกส่ง
ผ่านคอลัมน์ระเหยและใช้สำหรับการตรวจ (PCT /
KR2012 / 000766) สารสกัดถูกระงับใน dimethyl
sulfoxide (DMSO; Sigma, เซนต์หลุยส์, MO) ที่ 50 mg / ml สำหรับภายหลัง
การตรวจ
2.2 ระบบโครมา
ประสิทธิภาพสูงของเหลว chromatography (HPLC) การวิเคราะห์
ได้ดำเนินการในระบบ Dionex (ซันนีเวล, แคลิฟอร์เนีย) ประกอบด้วย
สุดยอด 3000 ปั๊มยอด autosampler 3000 และ
สุดยอดเครื่องตรวจจับ 3000 Dionex Chromeleon ถูกใช้ในการ
ได้มาและบูรณาการข้อมูล คอลัมน์วิเคราะห์เป็น Sheseido
Capcellpak C18, 4.6 มม id และ 15 ซม. ซึ่งได้รับการเก็บรักษาไว้ที่
อุณหภูมิห้อง เฟสเคลื่อนที่เป็นลาดเชิงเส้นของ
กรดฟอร์มิ 0.1% และ acetonitrile (0 นาที 70:30 0e5 นาที 60:40
5e55 นาที 20:80, 70:30 55e56 นาที, 56e60 นาที 70:30) ที่
อัตราการไหลของ 1 มิลลิลิตร / นาที DG-LRE glycyrrhizin และได้
เตรียมที่ 10 mg / ml และ 0.1 mg / ml ตามลำดับและ 20 มิลลิลิตรถูก
ฉีดเข้าไปในระบบ HPLC ตัวชะคอลัมน์ที่ได้รับการตรวจสอบ
รังสียูวีที่ 254 นาโนเมตร
2.3 การกำหนดความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้ง (MIC) และ
ความเข้มข้นของแบคทีเรียขั้นต่ำ (MBC)
ค่า MIC และ MBC ได้รับการพิจารณาค่าใช้ microdilution
ทดสอบตามที่คณะกรรมการแห่งชาติคลินิก
ห้องปฏิบัติการมาตรฐาน [18] สั้น ๆ , S. mutans เติบโตเป็นผู้ใหญ่ในสมอง
แช่หัวใจ (BHI) น้ำซุปที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในบรรยากาศ CO2 แอโรบิก 5%
ถึงช่วงของกลางชี้แจง (OD 600 ¼ 0.5 ประมาณ
6.5? 107 โคโลนี / มิลลิลิตร) และเพิ่ม จาน 96 หลุมเป็น
ความเข้มข้นสุดท้ายของ 1? 106 โคโลนี / มิลลิลิตร สำหรับการวัด MIC, DGLRE
ถูกบันทึกอยู่ในแต่ละที่จะมีความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.5, 1, 2, 4, 8,
16 และ 32 mg / ml ความเข้มข้น DMSO สุดท้ายในแต่ละดีเป็น
1% ดีที่มี ampicillin (ความเข้มข้น 100 mg / ml)
ถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวกกลางและวัฒนธรรมเท่านั้นและ
อาหารเลี้ยงเชื้อที่มี DMSO 1% ถูกนำมาใช้เป็นคู่
การควบคุมเชิงลบ หลังจากบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงภายใต้ความเหมาะสม
เงื่อนไขความเข้มข้นต่ำสุดที่ DG-LRE ที่ยับยั้ง
การเจริญเติบโตที่มองเห็นได้รับการพิจารณาค่า MIC การตรวจสอบทางช่อง MBC
ค่า 10 ml ของวัฒนธรรมแบคทีเรียจากกันได้ดีที่ค่า MIC
กำหนดข้างต้นถูกเจือจาง 100 ผ่าน 10,000 เท่าและ
เคลือบลงบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อ BHI สำหรับแต่ละสายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรีย วุ้น
แผ่นถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและจำนวนโคโลนี
นับจากนั้น ความเข้มข้นที่ฆ่า 99.9% ของ
แบคทีเรียที่ได้รับการพิจารณาค่า MBC

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.1 . การเตรียมการของ dg-lre
รากชะเอมได้มาจาก . uralensis ได้ ซื้อจาก
ตลาดยาสมุนไพร ( ยองจู , เกาหลี ) รากแห้งถูกตัด
เป็นชิ้นบาง ๆผสมกับน้ำกลั่น ( น้ำกลั่นแห้ง
รากอัตราส่วน 20 : 01 [ V / w ] 2 H ) และให้ความร้อนในขวดก้นกลม
. กลั่นน้ำจะถูกลบออกและเอทานอล 95%
เพิ่ม ( 95% เอทานอล อัตราส่วน 15 : กาก1 [ 5 w / ] ) ขวด
ส่วนผสมอุ่นที่ 78  C 2 H , และสารสกัดที่นำมาระเหย .
ต่อไปเอทานอล 99% มีเพิ่มให้สารสกัดเอทานอล
แก้ปัญหา ) เอทานอลในสารละลายกรองโดยใช้คอลัมน์ custom-made
( 6.5 ซม.  60 ซม. ) เต็มไปด้วย diaion hp-20 ดูดซับ
( มิตซูบิชิเคมี Corporation , มินาโตะ กุ , โตเกียว , ญี่ปุ่น )
คอลัมน์ equilibrated ด้วยน้ำกลั่นเอทานอล 50%
เอทานอล 99% สารสกัดจากชะเอมเทศสุดท้าย ( dg-lre ) ถูกส่งผ่าน
ผ่านคอลัมน์ ระเหย และใช้สําหรับ assays ( PCT /
kr2012 / 000766 ) สารสกัดในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ถูกระงับ
( DMSO ; Sigma , เซนต์ หลุยส์ โม ) ที่ 50 mg / ml สามารถตามมา
.
2.2 . โครมาโทกราฟีสมรรถนะสูงระบบ
liquid chromatography ( HPLC ) การวิเคราะห์
ดำเนินการบนระบบ DIONEX ( โดยCA ) ประกอบด้วย
สุดท้าย 3000 ปั๊มสุดท้าย 3000 autosampler และ
สูงสุด 3000 เครื่องตรวจจับ เป็น DIONEX chromeleon ใช้
ได้มาและบูรณาการข้อมูล คอลัมน์วิเคราะห์เป็น sheseido
capcellpak c18 4.6 มม. บัตร 15 เซนติเมตร ซึ่งถูกเก็บรักษา
อุณหภูมิห้อง เฟสเคลื่อนที่เป็นลาดเชิงเส้นของ
และ 0.1% กรดแอซิโตไนไตรล์ ( 0 0e5 มินมิน 70 : 30 , 60 : 40 ,
5e55 20 : มิน80 , 55e56 Min 70 : 30 , 56e60 Min 70 : 30 )
อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร / นาที และมี dg-lre glycyrrhizin
เตรียม 10 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรและ 0.1 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ และ 20 ml คือ
ฉีดเข้าไปในระบบ 2 . คอลัมน์นี้ถูกตรวจสอบ
ที่ยูวี 254 nm .
2.3 กำหนดความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้ง ( MIC ) และความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถฆ่าเชื้อ

( MBC )' และ MBC ค่าคำนวณโดยใช้ microdilution
) ตามที่คณะกรรมการแห่งชาติว่าด้วยมาตรฐานห้องปฏิบัติการคลินิก
[ 18 ] สั้น , S . mutans ปลูกในแช่หัวใจสมอง
( BHI ) น้ำซุปที่ 37  C 5% CO2 แอโรบิกบรรยากาศ
เพื่อระยะ exponential ของ MID ( od600 ¼ 0.5 ประมาณ
6.5  107 อาณานิคมสร้าง unit / ml ) และเพิ่มเป็น 96 ดี

จานสุดท้ายเข้มข้น 1  105 CFU / มล. วัดไมค์ , dglre
เพิ่มกันให้ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 , 1 , 2 , 4 , 8 ,
16 และ 32 มก. / มล. ปริมาณ DMSO สุดท้ายในแต่ละดี
1 % ดีที่มีแอมพิซิลลิน ( สุดท้ายความเข้มข้น 100 มก. / มล. )
ถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวกและอาหารเลี้ยงเชื้อเท่านั้น และอาหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบด้วย 1%
DMSO ที่ใช้ควบคุมคู่
ลบหลังจากการแช่ 24 ชั่วโมง ภายใต้สภาวะที่เหมาะสม
dg-lre ความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้งการเจริญเติบโตที่มองเห็นได้ คือถือว่า
ค่า MIC เพื่อตรวจสอบค่า MBC
10 มิลลิลิตรแบคทีเรียวัฒนธรรมแต่ละที่ไมค์ค่า
กำหนดข้างต้นถูกเจือจาง 100 - ผ่าน 10 , 000 พับและ
ชุบลงบนจานวุ้น BHI แต่ละแบคทีเรียสายพันธุ์ อาหารเลี้ยงเชื้อ
จานถูกบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง และ  จำนวนโคโลนี
ก็นับ ความเข้มข้นที่ฆ่า 99.9% ของแบคทีเรียเป็น
ค่า MBC