RAPD markers have been used for pro

RAPD markers have been used for prompt genetic characterization of a great number of plant species (Fernandes de Souza et al., 2012; Liu et al., 2012; Chhipi Shrestha et al., 2013; Inoue et al., 2013). Although the method is limited by the dominant nature of RAPD markers and by the difficulties in technique reproducibility, RAPD markers are usually the most practical alternative for the analysis of the numerous poorly studied tropical tree species, for which codominant markers are not yet available (Fernandes de Souza et al., 2012). In addition, this technique can simultaneously examine multiple genome loci. Therefore, the RAPD technique has the advantage of being able to quickly screen a wide proportion of the DNA without prior sequence knowledge of the genome under study (Allendorf et al., 2013; Babu et al., 2014).


We hypothesized that these Argentinean C. brasiliense populations belonged in the past to a continuum of large forest which underwent a profound fragmentation process that resulted in genetic differentiation of the Argentinean C. brasiliense populations. Our overall goals were to contribute to understanding of this process and achieve a rapid genetic characterization of the local at-risk and fragmented population. Specific objectives were 1) to characterize the distribution of genetic variation within and between the two C. brasiliense populations from Northeast Argentina, and 2) to evaluate the existence of spatial genetic structure autocorrelation.


Materials and Methods Study Area Misiones and Corrientes are Argentinean provinces bordered by the Paraná and Uruguay rivers in the Northeast of the country. Misiones contains the largest remaining tract of Paraná Atlantic Forest ecoregion and it was historically 90–95% covered with Upper Paraná Atlantic Forest. Both provinces are characterized by humid, subtropical climate with no distinct dry season. Argentinean populations of C. brasiliense analyzed are both in remnants of riparian forest on the Argentinean side of the Paraná River. One of them is located at the Private Reserve Luis Jorge Velázquez in San Ignacio (SI-Misiones-ARG; 27º16’34.4’’S, 55º34’11.9’’W) and the other one is downstream, at Rincón Ombú Refuge in Ituzaingó (RO-Corrientes-ARG; 27º24’54.42”S, 56º29’43”W). The geographical distance between these populations is approximately 100 km (Fig. 1).


Plant Material Grids of plots (10 m × 10 m) were outlined for SI and RO populations that covered 0.21 ha and 0.14 ha, respectively. Each individual was identified with a number written on a piece of sheet metal and the label was attached to the tree bark with a nail, or a seal in the case of young trees. For each individual, spatial coordinates were registered using a GPS (GARMIN 60CSX).


Leaves of 30 individuals separated by a distance of at least 10 m were collected, cleaned, and placed in small ziplock plastic bags with silica gel until they were completely dry for the DNA extraction.


Genetic Analysis Total genomic DNA extraction was carried out based on the protocol described by Stange (1998), modified to include the incorporation of 2% polyvinylpyrrolidone (PVP), 5 mM ascorbic acid, 4 mM sodium diethyldithiocarbamate trihydrate (DIECA), and 1.2% β-mercaptoethanol into the digestion buffer in a 2 ml plastic tube to improve the homogenization (Percuoco, 2007). Extractions were carried out in a room separated from the one in which polymerase chain reaction (PCR) amplifications were conducted to prevent cross contamination of samples.


The PCR amplifications were conducted in a final volume of 40 μl containing 10 ng of genomic DNA; 200 μM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP; 1X buffer; 2.5 mM MgCl2; 1.25 units of FlexiTaq (Promega-Biodynamics); and 0.2 μM of each primer. Samples were amplified in a DNA thermal cycler TechnePHC-3 programmed to perform 40 cycles of 94 ˚C for 1 min, 36 ˚C for 1 min, and 72 ˚C for 2 min. A negative control (no DNA added) was included in each PCR run to test for contamination. The amplifications were carried out in triplicate to assess profile reproducibility. Two series of 10 primers each were screened (Table 1) in order to select those that generated reproducible and clear profiles for the analysis. Nonspecific bands that appeared in negative controls and in each sample, due to the low stringency of the reaction, were excluded from the sample profiles in subsequent analysis (Thormann et al., 1994; Casas et al., 1999). The amplicons were resolved in 1.4 % agarose gels with BrEt (Promega) and visualized in a UVP-TM-20 transilluminator. Images were captured for the next analysis step using a Kodak Easy Share B102-1 Camera.


Table 1. Details of the RAPDs primers assayed (Biodynamics Series A and B).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การใช้เครื่องหมายอาร์เอพีดีสำหรับคุณสมบัติทางพันธุกรรมพร้อมของจำนวนมากของสปีชีส์พืช (Fernandes de Souza et al., 2012 หลิว al. et, 2012 Al. et Chhipi Shrestha, 2013 โนะอุเอะ et al., 2013) แม้ว่าวิธีการจะจำกัด โดยลักษณะโดดเด่นของเครื่องหมายอาร์เอพีดี และความยากลำบากในเทคนิค reproducibility เครื่องหมายอาร์เอพีดีเป็นปกติทางเลือกที่สุดสำหรับการวิเคราะห์ชนิดงานศึกษาต้นไม้เขตร้อนมากมาย ซึ่งเครื่องหมาย codominant ยังไม่ว่าง (Fernandes de Souza et al., 2012) นอกจากนี้ เทคนิคนี้สามารถพร้อมตรวจสอบหลาย loci จีโนม ดังนั้น เทคนิคอาร์เอพีดีมีประโยชน์จากความสามารถในการสัดส่วนกว้างของดีเอ็นเอไม่รู้ทราบลำดับของกลุ่มภายใต้การศึกษา (Allendorf et al., 2013 ที่หน้าจออย่างรวดเร็ว Babu et al., 2014)เราตั้งสมมติฐานว่าที่เหล่านี้เชี่ยว C. brasiliense ประชากรอยู่ในอดีตเพื่อความต่อเนื่องของป่าใหญ่ซึ่งแต่ละกระบวนการกระจายตัวที่ลึกซึ้งที่ทำให้เกิดการสร้างความแตกต่างทางพันธุกรรมของประชากร brasiliense C. เชี่ยว เป้าหมายของเราโดยรวมเพื่อ นำไปสู่ความเข้าใจของกระบวนการนี้ และให้มีคุณสมบัติทางพันธุกรรมอย่างรวดเร็วของอุทกภัย และมีการกระจายตัวประชากรในท้องถิ่นได้ วัตถุประสงค์เฉพาะได้ 1) ลักษณะการแจกแจงของความผันแปรทางพันธุกรรมภายใน และ ระหว่างประชากร brasiliense C. สองจากตะวันออกเฉียงเหนือของอาร์เจนตินา และ 2 ประเมินการดำรงอยู่ของโครงสร้างพันธุกรรมปริภูมิ autocorrelationวัสดุ และวิธีการศึกษาที่ตั้งมีซีโอเนส และ Corrientes เชี่ยวจังหวัดล้อมรอบ ด้วยแม่น้ำ Paraná และอุรุกวัยในภาคอีสานของประเทศ มีซีโอเนสประกอบด้วยทางเดินเหลือที่ใหญ่ที่สุดของป่าแอตแลนติก Paraná ecoregion และก็ประวัติ 90 – 95% ปกคลุม ด้วยป่าบน Paraná แอตแลนติก ทั้งจังหวัดมีลักษณะ โดยสภาพภูมิอากาศชื้น สำรองกับแล้งไม่แตกต่างกัน ประชากรเชี่ยวของ C. brasiliense วิเคราะห์ได้ทั้งในเศษของป่า riparian ด้านเชี่ยวของแม่น้ำ Paraná หนึ่งในนั้นอยู่ที่จิตรกร Jorge Luis สำรองใน San Ignacio ส่วนตัว (ซีมีซีโอเนสอาร์กิวเมนต์ของค่า 27º16'34.4 '' S, 55º34'11.9 '' W) และอีกหนึ่งเป็นปลายน้ำ หลบ Ombú Rincón Ituzaingó (RO-Corrientes อาร์กิวเมนต์ของค่า 27º24'54.42 "S, 56º29'43" W) ระยะทางทางภูมิศาสตร์ระหว่างประชากรเหล่านี้มีประมาณ 100 กม. (Fig. 1)พืชวัสดุกริดของที่ดิน (10 × 10 เมตร) ถูกทำเค้าร่างสำหรับประชากรศรีและ RO ที่ครอบคลุม 0.21 ฮา และ 0.14 ฮา ตามลำดับ ระบุแต่ละคน มีหมายเลขเขียนบนแผ่นโลหะ และป้ายชื่อที่แนบกับเปลือกกับตะปู หรือตราในกรณีของหนุ่มต้น สำหรับแต่ละบุคคล พิกัดปริภูมิได้ลงทะเบียนใช้ GPS (GARMIN 60CSX)ใบ 30 บุคคลแยกจากกัน โดยระยะทาง 10 เมตรได้รวบรวม สะอาด และวางในถุง ziplock เล็กพลาสติกเจลจนกว่าพวกเขาแห้งสนิทการสกัดดีเอ็นเอGenetic Analysis Total genomic DNA extraction was carried out based on the protocol described by Stange (1998), modified to include the incorporation of 2% polyvinylpyrrolidone (PVP), 5 mM ascorbic acid, 4 mM sodium diethyldithiocarbamate trihydrate (DIECA), and 1.2% β-mercaptoethanol into the digestion buffer in a 2 ml plastic tube to improve the homogenization (Percuoco, 2007). Extractions were carried out in a room separated from the one in which polymerase chain reaction (PCR) amplifications were conducted to prevent cross contamination of samples.The PCR amplifications were conducted in a final volume of 40 μl containing 10 ng of genomic DNA; 200 μM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP; 1X buffer; 2.5 mM MgCl2; 1.25 units of FlexiTaq (Promega-Biodynamics); and 0.2 μM of each primer. Samples were amplified in a DNA thermal cycler TechnePHC-3 programmed to perform 40 cycles of 94 ˚C for 1 min, 36 ˚C for 1 min, and 72 ˚C for 2 min. A negative control (no DNA added) was included in each PCR run to test for contamination. The amplifications were carried out in triplicate to assess profile reproducibility. Two series of 10 primers each were screened (Table 1) in order to select those that generated reproducible and clear profiles for the analysis. Nonspecific bands that appeared in negative controls and in each sample, due to the low stringency of the reaction, were excluded from the sample profiles in subsequent analysis (Thormann et al., 1994; Casas et al., 1999). The amplicons were resolved in 1.4 % agarose gels with BrEt (Promega) and visualized in a UVP-TM-20 transilluminator. Images were captured for the next analysis step using a Kodak Easy Share B102-1 Camera.Table 1. Details of the RAPDs primers assayed (Biodynamics Series A and B).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เครื่องหมาย RAPD มีการใช้ลักษณะทางพันธุกรรมที่พรอมต์ของจำนวนมากของสายพันธุ์พืช (เฟอร์นันเด de Souza et al, 2012;. หลิว et al, 2012;. Chhipi Shrestha et al, 2013;.. อิโนอุเอะ et al, 2013) แม้ว่าวิธีการที่ถูก จำกัด โดยธรรมชาติที่โดดเด่นของเครื่องหมาย RAPD และความยากลำบากในการทำสำเนาเทคนิคเครื่องหมาย RAPD มักจะเป็นทางเลือกที่ปฏิบัติมากที่สุดสำหรับการวิเคราะห์ของหลายการศึกษาไม่ดีพันธุ์ไม้เขตร้อนซึ่ง codominant เครื่องหมายยังไม่พร้อม (เฟอร์นันเด de Souza et al., 2012) นอกจากนี้เทคนิคนี้ไปพร้อม ๆ กันสามารถตรวจสอบตำแหน่งหลายจีโนม ดังนั้นเทคนิคอาร์เอพีมีความได้เปรียบของความสามารถในการได้อย่างรวดเร็วหน้าจอสัดส่วนกว้างของดีเอ็นเอโดยไม่ต้องรู้ก่อนลำดับของจีโนมภายใต้การศึกษา (Allendorf et al, 2013;.. นาย et al, 2014). เราตั้งสมมติฐานว่าสิ่งเหล่านี้อาร์เจนตินา ซีประชากร Brasiliense เป็นในอดีตเพื่อความต่อเนื่องของป่าขนาดใหญ่ที่ได้รับการกระบวนการการกระจายตัวที่ลึกซึ้งที่ทำให้เกิดความแตกต่างทางพันธุกรรมของประชากรอาร์เจนตินาซี Brasiliense เป้าหมายโดยรวมของเราก็จะนำไปสู่ความเข้าใจในขั้นตอนนี้และบรรลุลักษณะทางพันธุกรรมอย่างรวดเร็วของท้องถิ่นที่มีความเสี่ยงและมีการกระจายตัวของประชากร วัตถุประสงค์เฉพาะ 1) ลักษณะการกระจายของการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมภายในและระหว่างสองซีประชากร Brasiliense จากภาคตะวันออกเฉียงเหนืออาร์เจนตินาและ 2) การประเมินการดำรงอยู่ของอัตโครงสร้างทางพันธุกรรมเชิงพื้นที่. วัสดุและวิธีการศึกษาพื้นที่ Misiones และคอร์รีนเป็นจังหวัดที่ติดกับอาร์เจนตินา โดยปารานาและแม่น้ำอุรุกวัยในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศ Misiones มีทางเดินที่เหลือที่ใหญ่ที่สุดของปารานาอีโครีเจียนแอตแลนติกป่าและมันก็เป็นอดีต 90-95% ปกคลุมด้วยมหาสมุทรแอตแลนติกตอนบนปารานาป่า จังหวัดทั้งสองมีลักษณะชื้นอากาศค่อนข้างร้อนที่ไม่มีฤดูแล้งที่แตกต่างกัน ประชากรอาร์เจนตินาซี Brasiliense วิเคราะห์จะมีทั้งเศษของป่าชายฝั่งทางด้านอาร์เจนตินาของแม่น้ำปารานา หนึ่งของพวกเขาตั้งอยู่ที่ภาคเอกชนสำรองหลุยส์อร์เฆVelázquezในซานอิกนาซิโอ (SI-Misiones-หาเรื่อง; 27º16'34.4 ''S, 55º34'11.9''W) และคนอื่น ๆ ที่เป็นปลายน้ำที่RincónOmbúที่หลบภัยในItuzaingó ( RO-Corrientes-หาเรื่อง; 27º24'54.42 "S, 56º29'43" W) ระยะทางระหว่างทางประชากรเหล่านี้จะอยู่ที่ประมาณ 100 กิโลเมตร (รูปที่ 1).. พืชวัสดุกริดแปลง (10 เมตร x 10 เมตร) ที่ถูกระบุไว้สำหรับประชากร SI และ RO ที่ปกคลุม 0.21 ไร่และ 0.14 ฮ่าตามลำดับ แต่ละคนที่ถูกระบุว่ามีจำนวนที่เขียนบนแผ่นโลหะแผ่นและป้ายชื่อติดอยู่กับเปลือกไม้ที่มีตะปูหรือตราประทับในกรณีของต้นไม้ที่ สำหรับแต่ละบุคคลพิกัดเชิงพื้นที่ได้รับการจดทะเบียนโดยใช้จีพีเอส (GARMIN 60CSx). ใบ 30 บุคคลที่แยกจากกันโดยระยะห่างอย่างน้อย 10 เมตรถูกเก็บทำความสะอาดและวางไว้ในถุงพลาสติก ziplock ขนาดเล็กที่มีซิลิกาเจลจนกว่าพวกเขาจะสมบูรณ์แห้ง การสกัดดีเอ็นเอ. ทางพันธุกรรมการวิเคราะห์รวมสกัดดีเอ็นเอได้ดำเนินการบนพื้นฐานของโปรโตคอลอธิบายโดย Stange (1998), ปรับเปลี่ยนเพื่อรวมรวมตัวกันของ polyvinylpyrrolidone 2% นี้ (PVP) 5 มิลลิวิตามินซี 4 มิลลิโซเดียม diethyldithiocarbamate trihydrate (DIECA) และ 1.2% β-mercaptoethanol ลงในบัฟเฟอร์การย่อยอาหารใน 2 มิลลิลิตรหลอดพลาสติกเพื่อปรับปรุงเนื้อเดียวกัน (Percuoco 2007) สกัดได้ดำเนินการในห้องที่แยกออกมาจากหนึ่งในการเกิดปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (PCR) เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการเพื่อป้องกันการปนเปื้อนของตัวอย่าง. เครื่องขยายเสียง PCR ได้ดำเนินการในปริมาณสุดท้ายของ 40 ไมโครลิตรมี 10 มณฑลของดีเอ็นเอ; 200 ไมครอนแต่ละ dATP, dCTP, dGTP และ dTTP; บัฟเฟอร์ 1X; 2.5 มิลลิ MgCl2; 1.25 หน่วย FlexiTaq (Promega-Biodynamics); และ 0.2 ไมครอนของแต่ละไพรเมอร์ ตัวอย่างถูกขยายในดีเอ็นเอความร้อน Cycler TechnePHC-3 โปรแกรมที่จะดำเนินการ 40 รอบจาก 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 36 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที การควบคุมเชิงลบ (DNA ไม่มีการเพิ่ม) ถูกรวมอยู่ในการทำงานแต่ละวิธี PCR ในการทดสอบการปนเปื้อน เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่าในการประเมินการทำสำเนารายละเอียด สองชุดของ 10 ไพรเมอร์แต่ละคนถูกคัดกรอง (ตารางที่ 1) ในการที่จะเลือกผู้ที่สร้างเลียนแบบรูปแบบและชัดเจนสำหรับการวิเคราะห์ เชิญชมวงดนตรีที่ปรากฏในเชิงลบและการควบคุมในแต่ละตัวอย่างเนื่องจากการเข้มงวดต่ำของปฏิกิริยาที่ได้รับการยกเว้นจากรูปตัวอย่างในการวิเคราะห์ที่ตามมา (Thormann et al, 1994;.. เสซ, et al, 1999) amplicons ได้รับการแก้ไขใน 1.4% agarose เจลกับเบร็ท (Promega) และมองเห็นใน UVP-TM-20 transilluminator ภาพที่ถูกจับสำหรับขั้นตอนการวิเคราะห์ต่อไปโดยใช้กล้อง Kodak ง่ายแบ่งปัน B102-1. ตารางที่ 1 รายละเอียดของไพรเมอร์ RAPDs assayed (Biodynamics ชุด A และ B)