6. Lysis of Gram-positive bacteria

6. Lysis of Gram-positive bacteria with lysostaphin (Crosa et al., 1994), modified
- Centrifuge 10 ml of culture and resuspend the pellet in 0.5 ml of 7.5 mM NaCl, 0.05 M EDTA,
pH 7.0
- Add lysostaphin to a final concentration of 15 µg/ml (double enzyme concentration might be
necessary for some strains), incubate at 37°C for 30 min with gentle agitation, cool on ice
- For cell lysis add 0.75 ml of 0.4% deoxycholate, 1% Brij 58, 0.3 M EDTA, pH 8.0, mix gently
and incubate on ice for 30 min
- Centrifuge at 23.000 x g for 20 min at 4°C, transfer supernatant into new tube, add 1.25 ml of
H2O (addition of water might be superfluous)
- Add 4 µl of boiled RNase solution (1 mg/ml), incubate at 37°C for 1 hr; if necessary, for
further purification perform a phenol/chloroform extraction (see Method 2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

6. lysis ของแบคทีเรียกับ lysostaphin (Crosa et al. 1994), แก้ไข -เครื่องหมุนเหวี่ยง 10 มล.ของวัฒนธรรม และ resuspend เม็ดใน 0.5 ml 7.5 มม. NaCl, 0.05 M EDTA pH 7.0 -เพิ่ม lysostaphin เข้มข้นสุดท้าย 15 µg/ml (ความเข้มข้นของเอนไซม์คู่อาจ สิ่งจำเป็นสำหรับบางสายพันธุ์), ฟักที่ 37 ° C เป็นเวลา 30 นาทีกับปั่นป่วนอ่อนโยน เย็นน้ำแข็ง -สำหรับเซลล์ lysis เพิ่ม 0.75 มล. deoxycholate 0.4%, 1% Brij 58, 0.3 M EDTA ค่า pH 8.0 ผสมเบา ๆ และฟักในน้ำแข็ง 30 นาที -เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ 23.000 x g 20 นาทีที่อุณหภูมิ 4° C, supernatant โอนเข้าหลอดใหม่ เพิ่ม 1.25 มล. H2O (นอกจากนี้น้ำอาจไม่จำเป็น) -เพิ่ม µl 4 ต้ม RNase โซลูชัน (1 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร) ฟักที่อุณหภูมิ 37° C 1 ชั่วโมง ถ้าจำเป็น สำหรับ เพิ่มเติม ฟอกทำการสกัดสารฟีนอล/คลอโรฟอร์ม (ดูวิธีที่ 2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

(. Crosa, et al, 1994) 6. สลายของแบคทีเรียแกรมบวกกับ lysostaphin แก้ไข
- เครื่องปั่นเหวี่ยง 10 มล. ของวัฒนธรรมและ resuspend เม็ดใน 0.5 มล. 7.5 มิลลิโซเดียมคลอไรด์, 0.05 M EDTA,
ค่า pH 7.0
- เพิ่ม lysostaphin จะเป็นครั้งสุดท้าย ความเข้มข้น 15 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร (ความเข้มข้นของเอนไซม์คู่อาจจะเป็น
สิ่งที่จำเป็นสำหรับบางสายพันธุ์) บ่มเพาะที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีด้วยการกวนอ่อนโยนเย็นบนน้ำแข็ง
- สำหรับการสลายเซลล์เพิ่ม 0.75 มิลลิลิตร Deoxycholate 0.4%, 1% Brij 58, 0.3 M EDTA, ค่า pH 8.0 ผสมเบา ๆ
และฟักบนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาที
- เครื่องปั่นเหวี่ยงที่ 23.000 XG 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียสโอนใสลงในหลอดใหม่เพิ่ม 1.25 มล. ของ
H2O (เติมน้ำอาจจะฟุ่มเฟือย)
- เพิ่ม 4 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหา RNase ต้ม (1 mg / ml) บ่มเพาะที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง; ถ้ามีความจำเป็นสำหรับ
การทำให้บริสุทธิ์ต่อไปดำเนินการสกัดฟีนอล / คลอโรฟอร์ม (ดูวิธีที่ 2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

6 . การสลายของแบคทีเรียแกรมบวกกับไลโซ ตฟิน ( crosa et al . , 1994 ) , แก้ไข- เครื่อง 10 ml ของวัฒนธรรมและ resuspend เม็ด 0.5 มิลลิลิตร ขนาด 7.5 มม. 0.05 M EDTA ,พีเอช 7.0- เพิ่มไลโซ ตฟินกับความเข้มข้นสุดท้าย 15 µ g / ml ( ดับเบิ้ล ความเข้มข้นของเอนไซม์อาจเป็นที่จำเป็นสำหรับบางสายพันธุ์ ) , บ่มเพาะที่อุณหภูมิ 37 องศา C นาน 30 นาทีกับอ่อนโยนกวนเย็นบนน้ำแข็ง- สำหรับการสลายเซลล์เพิ่ม 0.75 มิลลิลิตร 0.4% ดี กซีโชเลต 1% บริดจ์ 58 , 0.3 M EDTA pH 8.0 , ผสมเบา ๆและที่พักในน้ำแข็ง ประมาณ 30 นาที- เครื่อง 23.000 x G สำหรับ 20 นาทีที่ 4 ° C ในการนำหลอดใหม่เพิ่ม 1.25 มิลลิลิตรH2O ( เพิ่มน้ำอาจไม่จำเป็น )- เพิ่ม 4 µลิตรต้มเลส โซลูชั่น ( 1 mg / ml ) บ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ถ้าจำเป็น สำหรับบริสุทธิ์เพิ่มเติมแสดงฟีนอล / คลอโรฟอร์มสกัด ( วิธีที่ 2 )