2. Materials and methods2.1. Clonin

2. Materials and methods
2.1. Cloning, sequencing and expression of EqtIV
The A. equina cDNA library was screened as described (Anderluh et al., 1996).
A cDNA of approximately 0.9 kb was isolated, excised from lDNA with BamHI
and cloned into pUC19. Its nucleotide sequence was determined using a T7
sequencing kit (Pharmacia) and [35S]dATPaS (Amersham).
The coding region of the cDNA was ampli®ed with the oligonucleotide primers
E2.4(+), 5'-GGAATTCATATGAGCGTAGCCGTGGCTGG-3', and E2.2(ÿ),
5'-GCTTAAGCCTAGGATAGTTCGAAACGAGTGCA-3'. The PCR product
was digested with NdeI and EcoRI and inserted into the precleaved pT7±7
expression vector resulting in the plasmid pAG2.2. Plasmids pAG2.1, pAG2.2 and
pAG2.3 were used to express recombinant Eqts II, IV and V, respectively, in E.
coli as described (Anderluh et al., 1996; PungercÏar et al., 1997). Overnight cultures
1392 G. Anderluh et al. / Toxicon 37 (1999) 1391±1401
were used to inoculate 5 ml of LBAT medium and incubated at 378C for one hour
followed by induction by adding IPTG to a ®nal concentration of 1 mM. Bacteria
were grown for an additional 5±6 h and used for activity measurements as
described below.
2.2. Southern blot hybridization of genomic DNA
Genomic DNA was isolated from a single specimen of the sea anemone A.
equina as described (Anderluh et al., 1995). 8 mg of DNA were digested either with
BamHI, HindIII or PstI and run separately with unrestricted DNA as a control
on a 0.4% agarose gel and DNA fragments blotted by capillary transfer. The
cDNA fragment of 540 bp, corresponding to the mature protein coding region of
EqtII, was labelled by random priming with [32P]dGTP (Amersham) using a
Random Primed DNA Labelling Kit (Boehringer Mannheim). The blot was
hybridized with the labelled probe at 428C for 24 h, washed at 608C and
autoradiographed for 20 h at ÿ708C.
2.3. Measurements of hemolytic activity and its inhibition with sphingomyelin
A sample of induced bacteria with an A600 of 1.2 was analyzed for all three
recombinant Eqts. Bacteria were brie¯y centrifuged in Eppendorf tubes and
resuspended in 50 ml of STET bu€er (8% sucrose, 0.1% Triton X-100, 50 mM
EDTA and 50 mM Tris±HCl, pH 8.0). 3 ml of 50 mg/ml lysozyme were added,
incubated at room temperature for 10 min, sonicated and centrifuged for 10 min
in Eppendorf centrifuge at high speed. Hemolytic activity of the supernatant was
measured as described (Anderluh et al., 1996). Each sample of toxin was added to
2 ml of a bovine red blood cell suspension in 0.13 M NaCl, 20 mM Tris±HCl, pH
7.4 with an A700=0.5 and apparent absorbance at 700 nm was monitored
continuously in order to determine the t50, the time in which apparent absorbance
was reduced to 0.25, indicating hemolysis.
A 4 mg/ml stock of sphingomyelin (Sigma) was prepared in distilled water. Just
before use, the suspension of sphingomyelin was sonicated three times for 20 s
and vigorously vortexed. The amount of supernatant corresponding to t50=3 min
was preincubated for 2 min at room temperature with sphingomyelin at a ®nal
concentration of 33 mg/ml and used for hemolysis as described above. Controls
were run with water instead of the sphingomyelin suspension.
2.4. Separation and N-terminal sequencing of EqtI and III
Equinatoxins I and III were isolated as previously described (MacÏek and Lebez,
19

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 การโคลน ลำดับและค่าของ EqtIVห้องสมุด cDNA A. equina ถูกฉายเป็นอธิบาย (Anderluh et al., 1996)CDNA ของประมาณ 0.9 kb ถูกแยก excised จาก lDNA กับ BamHIและโคลนลงใน pUC19 กำหนดลำดับของนิวคลีโอไทด์โดยใช้ T7 เป็นลำดับชุด (Pharmacia) และ dATPaS [35S] (Amersham)รหัสภูมิภาคของ cDNA มี ampli ® ed กับไพรเมอร์ oligonucleotideE2.4(+), 5'-GGAATTCATATGAGCGTAGCCGTGGCTGG-3 ", และ E2.2(ÿ)5'-GCTTAAGCCTAGGATAGTTCGAAACGAGTGCA-3' ผลิตภัณฑ์ PCRเจ่า NdeI ด้วย EcoRI และแทรก precleaved pT7±7เวกเตอร์นิพจน์ใน plasmid pAG2.2 Plasmids pAG2.1, pAG2.2 และใช้แสดง recombinant Eqts II, IV และ V ตามลำดับ ในอี pAG2.3coli เป็นอธิบาย (Anderluh et al., 1996 PungercÏar และ al., 1997) วัฒนธรรมค้างคืน1392 G. Anderluh et al. / Toxicon 37 1391±1401 (1999)ใช้ฉีด 5 ml ของ LBAT กลาง และ incubated ที่ 378C ชั่วโมงหนึ่งตาม ด้วยการเหนี่ยวนำ IPTG เพื่อเพิ่มการ ® nal ความเข้มข้นของ 1 มิลลิเมตร แบคทีเรียได้ปลูกสำหรับ 5±6 เพิ่มเติม h และใช้สำหรับการประเมินกิจกรรมเป็นอธิบายได้ดังนี้2.2. ภาคใต้คืนในตา hybridization ของ genomic DNAGenomic DNA ถูกแยกต่างหากจากตัวอย่างเดียวของซีแอนนีโมนอ.equina เป็นอธิบาย (Anderluh และ al., 1995) 8 มิลลิกรัมของดีเอ็นเอถูกต้องอย่างใดอย่างหนึ่งด้วยBamHI, HindIII หรือ PstI และรันต่างหากกับดีเอ็นเอจำกัดเป็นตัวควบคุมวุ้น agarose 0.4% และชิ้นส่วนดีเอ็นเอ blotted โดยโอนย้ายเส้นเลือดฝอย ที่ส่วน cDNA ของ 540 bp ตรงกับโปรตีนผู้ใหญ่รหัสภูมิภาคของEqtII ถูกมันตามด้วยสุ่ม [32P] dGTP (Amersham) ใช้เป็นสุ่มงเยียฉลากชุด (มันน์ไฮม์ Boehringer) ดีเอ็นเอ คืนในตามีผสมพันธุ์กับโพรบมันที่ 428C ใน 24 h ล้างที่ 608C และสำหรับ h 20 ที่ ÿ708C autoradiographed2.3 การประเมินกิจกรรม hemolytic และการยับยั้ง ด้วย sphingomyelinมีวิเคราะห์ตัวอย่างของแบคทีเรียที่อาจ มีการ A600 1.2 สำหรับทั้งสามrecombinant Eqts แบคทีเรียมี brie¯y centrifuged ใน Eppendorf ท่อ และresuspended ใน 50 ml ของบุ STET เอ้อ (ซูโครส 8%, 0.1% ไตรตั้น X 100, 50 มม.EDTA ก 50 มม. Tris±HCl ค่า pH 8.0) เพิ่ม 3 ml ของ lysozyme 50 mg/mlincubated ที่อุณหภูมิห้องใน 10 นาที sonicated และ centrifuged สำหรับ 10 นาทีใน Eppendorf เครื่องหมุนเหวี่ยงที่ความเร็วสูง กิจกรรม hemolytic ของ supernatant ถูกวัดเป็นอธิบาย (Anderluh et al., 1996) มีเพิ่มแต่ละตัวอย่างของสารพิษมล. 2 การระงับรายย่อยเม็ดเลือดแดงใน 0.13 M NaCl, 20 มม. Tris±HCl ค่า pH7.4 มี A700 ตัว = 0.5 และ absorbance ชัดเจนที่ 700 nm ที่ถูกตรวจสอบอย่างต่อเนื่องเพื่อกำหนด t50 เวลา absorbance ที่ชัดเจนได้ลดลงเป็น 0.25 ระบุ hemolysisคลัง 4 mg/ml sphingomyelin (ซิกมา) เตรียมไว้ในน้ำกลั่น เพียงก่อนใช้ ทุเลา sphingomyelin ถูก sonicated สามครั้งสำหรับ 20 sและโยคะ vortexed ยอดเงินตรงกับ t50 supernatant = 3 นาทีถูก preincubated สำหรับ 2 นาทีที่อุณหภูมิห้องกับ sphingomyelin ที่เป็น ® nalความเข้มข้นของ 33 mg/ml และใช้สำหรับ hemolysis ที่อธิบายข้างต้น ตัวควบคุมถูกเรียกใช้น้ำแทนการระงับ sphingomyelin2.4 การแยกและเทอร์มินัล N ลำดับของ EqtI และ IIIEquinatoxins ฉันและ III ถูกแยกที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (MacÏek และ Lebez19

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . การโคลนและการแสดงออกของการ eqtiv
A equina cDNA ห้องสมุดฉายตามที่อธิบายไว้ ( anderluh et al . , 1996 ) .
สายพันธุ์ประมาณ 0.9 kb คือแยกที่ตัดจาก ldna ด้วย BamHI
และโคลนใน puc19 . ของลำดับนิวคลีโอไทด์ถูกกำหนดโดยใช้ชุดลำดับ * * 3
( มุ่งมั่น ) และ [ 35s ] datpas
( ชาม )รหัสภูมิภาคของ cDNA คือ ampli ®เอ็ดด้วย ซึ่งไพรเมอร์
e2.4 ( ) , 5 - ggaattcatatgagcgtagccgtggctgg-3 ' และ e2.2 ( ÿ )
5 ' - gcttaagcctaggatagttcgaaacgagtgca-3 ' pcr ผลิตภัณฑ์
ถูกย่อยด้วยและ ndei EcoRI และแทรกลงใน precleaved pt7 ±
7 การแสดงออกของเวกเตอร์ที่เกิดใน pag2.2 พลาสมิด pag2.1 ) , และ pag2.2
pag2.3 ใช้แสดงแนนท์ eqts 24 และ 5 ตามลำดับ ใน E .
( ตามที่อธิบายไว้ ( anderluh et al . , 1996 ; pungerc Ï AR et al . , 1997 ) ค้างคืนวัฒนธรรม
397 กรัม anderluh et al . / toxicon 37 ( 1999 ) 1170 ± 1944
เคยฉีดวัคซีน 5 มิลลิลิตร lbat ขนาดกลางและบ่มที่ 378c เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง
ตามด้วยการเหนี่ยวนำโดยการเพิ่มโปรตีนให้®นาล ความเข้มข้น 1 มิล แบคทีเรีย
เติบโตในอีก 5 ± 6 H และใช้สำหรับการวัดกิจกรรม

ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง . . . blot hybridization ภาคใต้ของ genomic DNA
genomic DNA ที่คัดแยกได้จากตัวอย่างเดียวของดอกไม้ทะเล . .
equina ตามที่อธิบายไว้ ( anderluh et al . , 1995 ) 8 มิลลิกรัมของ DNA ที่ถูกย่อยด้วย BamHI -
, หรือโคลนและวิ่งแยกกับไม่จำกัดดีเอ็นเอเป็นตัวควบคุม
บน 04 % เจลและชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เปื้อนโดยโอนฝอย
cDNA fragment 540 BP ที่ผู้ใหญ่โปรตีนรหัสภูมิภาคของ
eqtii ถูกติดป้าย การรองพื้นด้วย [ 32p ] dgtp ( ชาม ) โดยใช้
สุ่มฉลากชุด ( Boehringer Mannheim primed DNA ) blot คือ
) กับป้ายวัดที่ 428c 24 ชั่วโมงและล้างที่ 608c
autoradiographed 20 H ที่ÿ 708c .
2.3การวัดกิจกรรม hemolytic และยับยั้งกับสฟิงโกไมอีลิน
ตัวอย่างจากแบคทีเรียที่มี a600 1.2 ใช้ทั้งสามแบบ eqts
. แบคทีเรียเป็น Brie ¯ Y ระดับในเพนดอร์ฟหลอดและ
resuspended 50 มิลลิลิตร Steady บู€ ER ( 8% ซูโครส 0.1 % Triton X-100 , 50 มม. และ 50 มม. โดย
EDTA ± HCl , pH 8.0 ) 3 ml 50 มก. / มล. และไลโซไซม์
เพิ่มขึ้นบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที sonicated ไฟฟ้า 10 นาที
ในเพนดอร์ฟการหมุนเหวี่ยงที่ความเร็วสูง กิจกรรมหลังของน่านคือ
วัดตามที่อธิบายไว้ ( anderluh et al . , 1996 ) แต่ละตัวอย่างของสารพิษที่ถูกเพิ่มเข้าไปใน
2 ml ของวัวสีแดงเลือดเซลล์แขวนลอยใน 0.2 M NaCl , 20 มม. โดย±กรดไฮโดรคลอริก pH 7.4 มีมาก
= 0.5 และแจ้งค่า 700 nm การ
อย่างต่อเนื่องเพื่อที่จะตรวจสอบ t50 เวลาที่ปรากฏค่า
ลดลง 0.25 , ระบุระดับ .
4 มก. / มล. และหุ้นสฟิงโกไมอีลิน ( Sigma ) ถูกเตรียมไว้ในน้ำกลั่น แค่
ก่อนใช้ ระงับสฟิงโกไมอีลินเป็น sonicated 3 ครั้ง 20 S
ได้อย่าง vortexed . ปริมาณสูงที่สอดคล้องกับ t50 =
3 นาทีคือ preincubated สำหรับ 2 นาทีที่อุณหภูมิห้องกับสฟิงโกไมอีลินที่® Nal
ความเข้มข้นของ 33 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร และใช้สำหรับการตามที่อธิบายไว้ข้างต้น การควบคุม
มีวิ่งด้วยน้ำแทนของ สฟิงโกไมอีลินช่วงล่าง
2.4 . การแยกและการจัดลำดับกรดอะมิโนของ eqti และ 3
equinatoxins I และ III แยกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( Mac Ï EK และ lebez
19 ,