2.5. Gene expression analysisGene e

2.5. Gene expression analysis
Gene expression of several bone-specific markers (Table 1) was
analyzed by semi-quantitative real-time RT-PCR. For this purpose
total mRNA from hFOB 1.19 cells was isolated after 3, 7,
14, 21, and 28 days of culture on the different materials using
the RNeasy MiniKit (Qiagen, Hilden, Germany). Integrity and
concentration of the RNA were determined using a lab on a
chip RNA 6000 Nano Series II kit (Agilent Technologies, Waldbronn,
Germany) that was run on an Agilent 2100 Bioanalyzer
instrument (Agilent Technologies). Reverse transcription was
performed with 5 g total RNA.
The cells cultured on the discs were harvested by
trypsinization and washed with PBS. The primer sequences
of selected genes were determined with the “Universal Probe
Library” software from Roche (http://qpcr.probefinder.com/
organism.jsp). Only intron-spanning sequences were chosen
in order to exclude contamination with genomic DNA. Realtime
RT-PCR was performed in a Light Cycler 489 (Roche, Basel,
Switzerland) in a 384 plate. A 10 l volume with 5 l SYBR
Green I Mastermix (Roche), 50 ng cDNA as template and 0.5 M
of the primer-pairs were used respectively.
Light cycling conditions were as follows: activation (95 ◦C
for 10 s), 40 amplification cycles (95 ◦C for 10 s, 52 ◦C for 5 s,
and 72 ◦C for 12 s). Melting curve analysis was used to ensure
that all transcripts under investigation were represented by a
single peak, indicating specificity. Gene expression was calculated
from the real-time RT-PCR efficiency [44] in relation to
the mean of five housekeeping genes (LMNA, GAPDH, ACTB,
RPS18, and RPLP0). Three independent cultures were used for
real-time RT-PCR measurements.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5 การวิเคราะห์ยีนนิพจน์
ยีนเครื่องหมายเฉพาะกระดูกหลาย (ตาราง 1) ถูก
วิเคราะห์ โดยกึ่งเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ RT-PCR สำหรับวัตถุประสงค์นี้
รวม mRNA จาก hFOB 1.19 เซลล์ถูกแยกหลัง 3, 7,
14, 21 และ 28 วันของวัฒนธรรมบนวัสดุต่าง ๆ ที่ใช้
MiniKit RNeasy (Qiagen, Hilden เยอรมนี) ความสมบูรณ์ และ
ของอาร์เอ็นเอจะถูกกำหนดโดยใช้ห้องปฏิบัติการบน
ชินาโนอาร์เอ็นเอ 6000 ชุดสองชุด (Agilent เทคโนโลยี Waldbronn,
เยอรมนี) ที่ถูกเรียกใช้บนตัว Agilent 2100 Bioanalyzer
ตราสาร (Agilent เทคโนโลยี) Transcription กลับถูก
ทำกับ 5 g รวมอาร์เอ็นเอ
เซลล์อ่างบนดิสก์ถูกเก็บเกี่ยวโดย
trypsinization และล้าง ด้วย PBS ลำดับรองพื้น
ของยีนที่เลือกถูกกำหนดด้วยการ "โพรบสากล
ซอฟต์แวร์ไลบรารี"จากโรช (http://qpcr.probefinder.com/
organism.jsp) ลำดับเฉพาะ intron รัฐถูกเลือก
เพื่อแยกปน ด้วย genomic DNA เรียลไทม์
ทำ RT-PCR ในการแสง Cycler 489 (Roche บาเซิล,
สวิตเซอร์แลนด์) จาน 384 ปริมาตร 10 l กับ 5 l SYBR
I กรี Mastermix (Roche), 50 ng cDNA เป็นแม่แบบและ 0.5 M
คู่รองพื้นใช้ตามลำดับ.
ขี่สภาพแสงมีดังนี้: เปิดใช้งาน (95 ◦C
10 s), วงจรขยาย 40 (95 ◦C 10 s, ◦C 52 สำหรับ 5 s,
◦C 72 สำหรับ 12 และ s) ละลายวิเคราะห์โค้งใช้ให้
ที่ใบแสดงผลทั้งหมดภายใต้การตรวจสอบถูกแสดงโดยการ
ยอดเดียว แสดง specificity ยีนไม่ได้
จากเวลาจริง RT-PCR ประสิทธิภาพ [44] การ
เฉลี่ยของ 5 บริการทำความสะอาด (LMNA, GAPDH, ACTB,
RPS18 และ RPLP0) ใช้วัฒนธรรมสามอิสระสำหรับ
วัดเวลาจริง RT-PCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.5 การวิเคราะห์การแสดงออกของยีน
การแสดงออกของยีนเครื่องหมายกระดูกเฉพาะหลาย (ตารางที่ 1) ได้รับการ
วิเคราะห์โดยกึ่งเชิงปริมาณแบบ real-time RT-PCR เพื่อจุดประสงค์นี้
mRNA รวมจาก hFOB 1.19 เซลล์ที่แยกหลังจาก 3, 7,
14, 21, และ 28 วันของวัฒนธรรมบนวัสดุที่แตกต่างกันโดยใช้
RNeasy minikit (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี) ความซื่อสัตย์และ
ความเข้มข้นของอาร์เอ็นเอได้รับการพิจารณาโดยใช้ห้องปฏิบัติการใน
อาร์เอ็นเอชิป 6000 นาโนซีรีส์ชุดที่สอง (Agilent Technologies, Waldbronn,
เยอรมนี) ที่ถูกเรียกใช้บน Bioanalyzer Agilent 2100
เครื่องดนตรี (Agilent Technologies) ถอดความแบบย้อนกลับได้รับการ
ดำเนินการกับ 5? กรัมอาร์เอ็นเอรวม
เซลล์เพาะเลี้ยงบนแผ่นดิสก์ถูกเก็บเกี่ยวโดย
trypsinization และล้างด้วยพีบีเอส ไพรเมอร์ลำดับ
ของยีนที่เลือกได้รับการพิจารณากับ "ยูนิเวอร์แซ Probe
ซอฟต์แวร์ห้องสมุด "จากโรช (http://qpcr.probefinder.com/
organism.jsp) ลำดับเฉพาะ intron ขยายได้รับเลือก
ในการที่จะไม่รวมการปนเปื้อนด้วยดีเอ็นเอ เรียลไทม์
RT-PCR ได้ดำเนินการในแสง Cycler 489 (โรช, บาเซิล,
วิตเซอร์แลนด์) ในแผ่น 384 ? ปริมาณ 10 ลิตร 5 ลิตร SYBR
? สีเขียวฉัน Mastermix (โรช), 50 ยีน ng เป็นแม่แบบและ 0.5 M
ของไพรเมอร์คู่ถูกนำมาใช้ตามลำดับ
เงื่อนไขการขี่จักรยานแสงมีดังนี้ยืนยันการใช้งาน (95 ◦ C
เป็นเวลา 10 s ) 40 รอบการขยาย (95 ◦ C เป็นเวลา 10 วินาที, 52 ◦ C เป็นเวลา 5 วินาที,
และ 72 ◦ C นาน 12 s) การวิเคราะห์เส้นโค้งละลายถูกนำมาใช้เพื่อให้แน่ใจ
ว่าเทปทั้งหมดภายใต้การตรวจสอบที่ถูกแทนด้วย
จุดสูงสุดเดียวระบุเฉพาะเจาะจง การแสดงออกของยีนที่คำนวณได้
จากเรียลไทม์ RT-PCR ที่มีประสิทธิภาพ [44] ในส่วนที่เกี่ยวกับ
ค่าเฉลี่ยของห้ายีนทำความสะอาด (LMNA, gapdh, ACTB,
RPS18 และ RPLP0) สามวัฒนธรรมที่เป็นอิสระที่ใช้สำหรับ
real-time วัด RT-PCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.5 การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนการแสดงออกของยีนเครื่องหมาย
เฉพาะกระดูกต่าง ๆ ( ตารางที่ 1 ) คือ
แบบกึ่งปริมาณ ครั้งนี้ สำหรับวัตถุประสงค์นี้
ทั้งหมด mRNA จาก hfob 1.19 เซลล์ได้หลังจาก 3 , 7
14 , 21 และ 28 วันของวัฒนธรรมที่แตกต่างกัน วัสดุที่ใช้ rneasy
minikit ( QIAGEN Hilden , เยอรมนี ) ความซื่อสัตย์และความเข้มข้นของ RNA ถูก

ใช้แลปบนชุด 2 ชุดนาโนชิป RNA 6000 ( Agilent Technologies , waldbronn
, เยอรมนี ) ที่วิ่งบน Agilent 2100 bioanalyzer
เครื่องดนตรี Agilent Technologies ) ย้อนกลับการถอดความเป็น
5  กรัมรวม RNA .
เซลล์เพาะเลี้ยงบนดิสก์ถูกเก็บเกี่ยวโดย
trypsinization และล้างด้วย PBS ไพรเมอร์ลำดับของยีนที่กำหนดด้วย

" สอบสวนสากลห้องสมุด " ซอฟต์แวร์จากโรช ( http : / / qpcr . probefinder . com /
สิ่งมีชีวิต . JSP ) เพียงเลือก
iNtRON สแปลำดับในการแยกการปนเปื้อนกับ genomic DNA เรียลไทม์
RT-PCR แสดงในรอบแสง 489 ( โรช บาเซิล , สวิสเซอร์แลนด์ ,
) ในเครื่องจาน 10  L ปริมาณ 5  ฉัน SYBR
สีเขียวผม mastermix ( ยา ) , 50 ของยีนเป็นแม่แบบและ 0.5  M
การใช้ไพรเมอร์คู่ตามลำดับ
สภาพจักรยานเบา ดังนี้ การเปิดใช้งาน ( 95 ◦ C
10 s ) , 40 ( รอบ ( 95 ◦ C 10 , 52 ◦ C 5 S ,
◦ 72 องศาเซลเซียสนาน 12 วินาที ) จุดหลอมเหลวการวิเคราะห์เส้นโค้งถูกใช้เพื่อให้แน่ใจว่ารายงานสอบสวน

ถูกแทนด้วยจุดเดียวที่ระบุเฉพาะเจาะจง . การแสดงออกของยีนหา
จากภาพนี้แบบเรียลไทม์ [ 44 ] ในความสัมพันธ์กับค่าเฉลี่ยของห้า
แม่บ้านยีน ( lmna gapdh พระราชบัญญัติ , , ,
rps18 และ rplp0 ) สามวัฒนธรรมอิสระถูกใช้สำหรับ
วัดนี้ได้แบบเรียลไทม์