We examined the protein levels of C

We examined the protein levels of CB1 and CB2 receptors in 4 different glioma cell lines (U343, U251, U87, T98) and in normal human astrocytes (NHA) as their normal counterpart. The results showed that protein expression of CB1 receptor was up-regulated in all glioma cell lines tested compared with normal astrocytes. Conversely, CB2 immunoreactivity varied without a specific trend between normal and malignant cells (Fig. ​(Fig.1A).1A). The altered expression of CB1 in glioma cells allowed them to be selectively targeted by CB1 receptor antagonist SR141716, whose pharmacological and biological effects we sought to explore. First, all glioma cell lines and NHA were incubated with increasing concentrations of SR141716 (0.3–40 μM) in time course. Specifically after 72 h-treatment, SR141716-exposed glioma cells showed a dose-dependent inhibition of proliferation compared with untreated cells (Fig. ​(Fig.1B).1B). In particular, a clear reduction of proliferative rate became more apparent at a concentration of 20 μM, as demonstrated by the BrdU incorporation assay. Of note, SR141716 elicited no significant reduction of NHA proliferation as compared to cancer cells in the same condition. To gain better insight into the biological processes modulated by SR141716 treatment in glioma cells, U251 cell line was used as a model system for further studies, as this cell line is one of the most aggressive glioblastoma cell lines with a considerable expression of CB1. SR141716 was used in the subsequent experiments at the efficacious concentrations of 10 and 20 μM. At first, we investigated cell cycle distribution following SR141716 treatment for 72 h. As shown in Fig. ​Fig.1C,1C, the percentage of cells in G1 phase was significantly higher in U251 glioma cells treated with SR141716 (10–20 μM) than in untreated cells. Furthermore, a marked reduction of the cell population in the S phase was observed after SR141716 treatment, reaching its significance only at the highest dose of 20 μM. However, no significant differences in G2/M population were found. These results suggested that the antiproliferative effects of SR141716 in U251 cells can be related to a G1/S transition inhibition. Indeed, in SR141716-treated cells the protein levels of G1/S-specific Cyclin D1 were selectively reduced compared to control, with no detectable effect on the cyclin-dependent kinase inhibitor p27kip1 (Fig. ​(Fig.1D).1D). To assess whether the inhibition of cell proliferation by SR141716 was also associated to the induction of apoptosis, we performed a cytofluorimetric cell death analysis by Annexin-V and propidium iodide staining. We observed a slight increase in apoptosis induction in glioma cells treated with SR141716 20 μM (Fig. ​(Fig.1E,1E, upper panel). Accordingly, in control glioma cells and U251 treated with the lowest dose of SR141716 (10 μM), we didn't detect processed caspase-3. On the contrary, in response to SR141716 20 μM, caspase 3 was cleaved into the intermediated p20 form and its active p17 subunit after 48 h of treatment and sustained until 72 h (Fig. ​(Fig.1E,1E, lower panel). As expected the broad spectrum caspase inhibitor z-VAD-fmk completely inhibited apoptosis induction (Fig. ​(Fig.1F,1F, left panel) and caspase activation (Fig. ​(Fig.1F,1F, right panel) in response to 72 h treatment with SR141716 20 μM. Taken together, the results illustrate that SR141716 affects glioma cell growth through the inhibition of cell-cycle progression and the induction of caspase-dependent apoptosis at the highest concentrations

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เราสามารถตรวจสอบระดับโปรตีนของ CB1 และ CB2 รับ ใน 4 สายเซลล์อื่น glioma (U343, U251, U87, T98) และ astrocytes มนุษย์ปกติ (ญา) เป็นของคู่กันปกติ ผลลัพธ์ที่แสดงให้เห็นว่า การแสดงออกของโปรตีนของ CB1 รับค่าควบคุมในทั้งหมด glioma เซลล์เส้นทดสอบเปรียบเทียบกับปกติ astrocytes ในทางกลับกัน CB2 immunoreactivity หลากหลาย โดยเฉพาะแนวโน้มระหว่างเซลล์ปกติ และมะเร็ง (มะเดื่อ (Fig.1A).1A) นิพจน์ที่มีการเปลี่ยนแปลงของ CB1 ใน glioma เซลล์อนุญาตให้พวกเขาที่จะเลือกกำหนดเป้าหมาย โดย CB1 นิสต์ SR141716 ที่มีผลกระทบทางชีวภาพ และเภสัชวิทยาที่เราพยายามที่จะสำรวจ ครั้งแรก และทั้งหมด glioma เซลล์เส้นญาได้รับการกกกับเพิ่มความเข้มข้นของ SR141716 (0.3-40 ไมครอน) ในหลักสูตรของเวลา โดยเฉพาะหลังจาก 72 ชั่วโมง-การรักษา สัมผัส SR141716 glioma เซลล์พบว่ายับยั้งการขึ้นอยู่กับปริมาณการเจริญเติบโตเมื่อเทียบกับเซลล์บำบัด (มะเดื่อ (Fig.1B).1B) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง proliferative ราคาลดล้างเป็นความชัดเจนที่ความเข้มข้น 20 ไมครอน โดยทดสอบการประสาน BrdU ของเหตุ SR141716 เกิดไม่ลดลงที่สำคัญญาเจริญเติบโตเมื่อเทียบกับเซลล์มะเร็งในเงื่อนไขเดียวกัน การเข้าใจดีขึ้นเป็นกระบวนการทางชีวภาพที่สันทัด โดยการรักษา SR141716 ใน glioma เซลล์ U251 เซลล์บรรทัดใช้เป็นระบบแบบสำหรับศึกษาต่อไป เป็นบรรทัดนี้เซลล์หนึ่งเซลล์เส้นสูงสุดของ glioblastoma กับนิพจน์ที่มากของ CB1 SR141716 มาใช้ในการทดลองต่อมาที่ความเข้มข้นทรีทเม้นต์ของμ m 10 และ 20 ครั้งแรก เราตรวจสอบรอบเซลล์กระจายต่อ SR141716 รักษา 72 ชม ดังแสดงในรูป Fig.1C,1C เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ในระยะ G1 เป็นนัยสำคัญใน U251 glioma เซลล์รักษา ด้วย SR141716 (10-20 ไมครอน) กว่าในเซลล์ที่ไม่ถูกรักษา นอกจากนี้ การลดประชากรเซลล์ในระยะ S หมายที่สังเกตหลังการรักษา SR141716 ถึงความสำคัญที่ปริมาณสูงสุดของ 20 ไมครอนเท่านั้น อย่างไรก็ตาม ไม่มีความแตกต่างกันในประชากร G2/M พบ ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำว่า ผลยับยั้งของ SR141716 ใน U251 เซลล์สามารถเกี่ยวข้องกับการยับยั้งการเปลี่ยนแปลง G1/S จริง ในถือว่า SR141716 เซลล์ระดับโปรตีนของเฉพาะ G1/S Cyclin D1 เลือกลดลงเมื่อเทียบกับการควบคุม มี p27kip1 การยับยั้งไคเนสรี cyclin ขึ้นอยู่กับการตรวจจับได้ (มะเดื่อ (Fig.1D).1D) เพื่อประเมินว่าการยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์โดย SR141716 ก็ยังเกี่ยวข้องกับการเหนี่ยวนำการตาย เราทำการวิเคราะห์ cytofluorimetric เซลล์ตาย โดย Annexin V และย้อมสี propidium ไอโอไดด์ เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นเล็กน้อยในการเหนี่ยวนำการตายใน glioma เซลล์รักษา ด้วย SR141716 20 ไมครอน (มะเดื่อ (Fig.1E,1E แผงด้านบน) ตาม ควบคุม glioma เซลล์และ U251 รักษา ด้วยขนาดยาต่ำที่สุดของ SR141716 (10 ไมครอน), เราไม่ได้ตรวจสอบประมวลผล caspase-3 การ์ตูน ในการตอบสนอง SR141716 20 μ m, caspase 3 แหวกลงในแบบฟอร์ม intermediated p20 และ p17 ห่างงานย่อยของหลังจาก 48 ชั่วโมงของการรักษา และยั่งยืนจนถึง 72 ชม. (มะเดื่อ (Fig.1E,1E แผงล่าง) ตามที่คาดการยับยั้ง caspase สเปกตรัม z-วีเจย์ VAD-fmk สมบูรณ์ยับยั้งเหนี่ยวนำตาย (มะเดื่อ (Fig.1F,1F แผงด้านซ้าย) และเปิดใช้งาน caspase (มะเดื่อ (Fig.1F,1F แผงขวา) ตอบสนองต่อการรักษา 72 ชั่วโมงด้วย SR141716 20 ไมครอน นำมารวมกัน ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า SR141716 มีผลต่อ glioma เซลล์เจริญเติบโตผ่านการยับยั้งของโรครอบเซลล์และการเหนี่ยวนำขึ้นอยู่กับ caspase ตายที่ความเข้มข้นสูงสุด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เราตรวจสอบระดับโปรตีนของ CB1 และ CB2 ผู้รับใน 4 สายพันธุ์เซลล์ Glioma แตกต่างกัน (U343, U251, U87, T98) และ astrocytes มนุษย์ปกติ (กคช.) ในฐานะคู่ปกติของพวกเขา ผลการศึกษาพบว่าการแสดงออกของโปรตีน CB1 รับได้รับการขึ้นควบคุมในทุกเซลล์ Glioma ทดสอบเมื่อเทียบกับ astrocytes ปกติ ตรงกันข้าม CB2 ภูมิคุ้มกันจะแตกต่างกันโดยไม่ต้องมีแนวโน้มที่เฉพาะเจาะจงระหว่างเซลล์ปกติและมะเร็ง (รูป. (Fig.1A) .1A) การแสดงออกเปลี่ยนแปลงของ CB1 ในเซลล์ Glioma ได้รับอนุญาตให้มีการกำหนดเป้าหมายการคัดเลือกโดย SR141716 CB1 รับศัตรูซึ่งทางเภสัชวิทยาและผลกระทบทางชีวภาพที่เราพยายามที่จะสำรวจ ครั้งแรกที่ทุกเซลล์ Glioma และกคช. ถูกบ่มที่มีความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของ SR141716 (0.3-40 ไมครอน) ในเวลาที่แน่นอน โดยเฉพาะหลังจากที่ 72 H-รักษา SR141716 สัมผัสเซลล์ Glioma แสดงให้เห็นว่าการยับยั้งปริมาณขึ้นอยู่กับการแพร่กระจายเมื่อเทียบกับเซลล์ได้รับการรักษา (รูป. (Fig.1B) .1B) โดยเฉพาะอย่างยิ่งการลดความชัดเจนของอัตราการเจริญก็เห็นได้ชัดมากขึ้นที่ความเข้มข้น 20 ไมครอนเป็นแสดงให้เห็นโดยการทดสอบ BrdU การรวมตัวกัน โน้ต SR141716 ออกมาไม่มีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของกคช. การแพร่กระจายเมื่อเทียบกับเซลล์มะเร็งอยู่ในสภาพเดิม เพื่อให้ได้รับความเข้าใจที่ดีขึ้นในกระบวนการทางชีวภาพ modulated โดย SR141716 รักษาในเซลล์ Glioma สายมือถือ U251 ถูกนำมาใช้เป็นระบบแบบจำลองสำหรับการศึกษาต่อไปเป็นสายพันธุ์ของเซลล์นี้เป็นหนึ่งในสายพันธุ์เซลล์ glioblastoma ก้าวร้าวมากที่สุดด้วยการแสดงออกที่มากของ CB1 SR141716 ถูกใช้ในการทดลองที่ตามมาที่ความเข้มข้นที่มีประสิทธิภาพของ 10 และ 20 ไมครอน ตอนแรกเราตรวจสอบการกระจายวงจรมือถือต่อไปนี้การรักษา SR141716 สำหรับ 72 ชั่วโมง ดังแสดงในรูป Fig.1C, 1C ร้อยละของเซลล์ในระยะ G1 สูงอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ Glioma U251 รับการรักษาด้วย SR141716 (10-20 ไมครอน) กว่าในเซลล์ได้รับการรักษา นอกจากลดการทำเครื่องหมายของประชากรเซลล์ในระยะ S พบว่าหลังจากการรักษา SR141716 ถึงความสำคัญของมันเท่านั้นที่ปริมาณสูงสุด 20 ไมครอน แต่ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญใน G2 / M ประชากรถูกพบ ผลการศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่าผลกระทบของการยับยั้งในเซลล์ SR141716 U251 สามารถที่เกี่ยวข้องกับ G1 / S ยับยั้งการเปลี่ยนแปลง อันที่จริงในเซลล์ SR141716 รับการรักษาระดับของโปรตีน G1 / S เฉพาะ Cyclin D1 ลดลงเมื่อเทียบกับการคัดเลือกควบคุมซึ่งไม่มีผลกระทบที่ตรวจพบใน cyclin ขึ้นอยู่กับไคเนสยับยั้ง p27kip1 (รูป. (Fig.1D) .1D) เพื่อประเมินว่าการยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์โดย SR141716 ก็เกี่ยวข้องกับการชักนำของ apoptosis ที่เราดำเนินการวิเคราะห์การตายของเซลล์ cytofluorimetric โดย Annexin V และ propidium ไอโอไดด์การย้อมสี เราสังเกตเห็นเพิ่มขึ้นเล็กน้อยในการเหนี่ยวนำการตายของเซลล์ในเซลล์ Glioma รับการรักษาด้วย SR141716 20 ไมครอน (รูป. (Fig.1E, 1E แผงบน). ดังนั้นในเซลล์ Glioma ควบคุมและ U251 รับการรักษาด้วยยาที่ต่ำสุดของ SR141716 (10 ไมครอน) เราไม่ได้ตรวจสอบการประมวลผล caspase-3. ในทางตรงกันข้ามในการตอบสนองต่อ SR141716 20 ไมโครเมตร caspase 3 ถูกตัดลงในแบบฟอร์มการ P20 คนกลางและ subunit P17 มันใช้งานได้หลังจาก 48 ชั่วโมงของการรักษาและยั่งยืนจนถึง 72 ชั่วโมง (รูปที่ (Fig.1E, 1E แผงล่าง). ในฐานะที่เป็นที่คาดหวังในวงกว้างสเปกตรัม caspase ยับยั้ง Z-VAD-FMK สมบูรณ์ยับยั้ง apoptosis เหนี่ยวนำ (รูป. (Fig.1F, 1F แผงซ้าย) และเปิดใช้งาน caspase (รูป. (รูปที่ .1f, 1F แผงขวา) ในการตอบสนองต่อการรักษา 72 ชั่วโมงกับ SR141716 20 ไมครอน. ที่ร่วมกันแสดงให้เห็นถึงผลที่ SR141716 ส่งผลกระทบต่อการเจริญเติบโตของเซลล์ Glioma ผ่านการยับยั้งการลุกลามของเซลล์วงจรและการชักนำของ apoptosis caspase ขึ้นอยู่กับที่สูงที่สุด ความเข้มข้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เราตรวจสอบระดับโปรตีนของ cb1 และ CB2 ตัวรับในเซลล์ต่าง ๆ 4 เซลส์ ( u343 u251 u87 , , , t98 ) และในความรู้สึกมนุษย์ปกติ ( ฮา ) เป็นคู่ปกติของพวกเขา ผลการศึกษาพบว่า การแสดงออกของโปรตีนของ cb1 ตัวรับในเซลล์เซลส์สามารถทดสอบเปรียบเทียบกับความรู้สึกที่ปกติ ในทางกลับกัน การ CB2 หลากหลายโดยเฉพาะแนวโน้มระหว่างปกติและเซลล์มะเร็ง ( รูปที่​ ( fig.1a ) 1A ) การเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ cb1 เซลส์ในเซลล์ที่อนุญาตให้พวกเขาที่จะกำหนดเป้าหมายโดย cb1 แอนตาโกนิสต์ sr141716 ที่มีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาและผลกระทบทางชีวภาพที่เราพยายามที่จะสำรวจ ครั้งแรกของทุกเซลล์ซึ่งเป็นเซลส์และแยกและเพิ่มความเข้มข้นของ sr141716 ( 0.3 ) 40 μ M ) ในหลักสูตรเวลา โดยเฉพาะหลังจาก 72 h-treatment sr141716 เซลส์ , สัมผัสเซลล์แสดงรายงานการเปรียบเทียบกับสารยับยั้งเซลล์ ( รูปที่​ ( fig.1b ) 1B ) โดยเฉพาะการลดอัตราที่ชัดเจนของ proliferative กลายเป็นที่ชัดเจนมากขึ้นที่ระดับความเข้มข้น 20 μ M , แสดงให้เห็น โดย brdu ประสาน ตามลำดับ บันทึก sr141716 ได้มาอย่างไม่มีการลดระดับเมื่อเทียบกับเซลล์มะเร็งในเงื่อนไขเดียวกัน ที่จะได้รับความเข้าใจที่ดีขึ้นในกระบวนการทางชีวภาพ โดยการปรับ sr141716 เซลส์ในเซลล์ เซลล์ u251 บรรทัดถูกใช้เป็นแบบจำลองระบบศึกษาเพิ่มเติม เป็นเซลล์นี้เป็นเซลล์เซลส์ที่ก้าวร้าวมากที่สุดด้วยสีหน้าที่ยังคง cb1 . sr141716 ถูกใช้ในการทดลองต่อมาที่ความเข้มข้น 10 และ 20 เมตรได้μตอนแรก เราศึกษาวัฏจักรเซลล์กระจายตาม sr141716 รักษา 72 ชั่วโมง ดังแสดงในรูปที่​ fig.1c 1C , ร้อยละ , เซลล์ในเฟส G1 สูงกว่าในเซลล์ u251 เซลส์ได้รับ sr141716 ( 10 – 20 μ M ) กว่าในการรักษาเซลล์ นอกจากนี้ การลดลงของประชากรในการทำเครื่องหมายเซลล์ S พบว่าหลังการรักษาระยะ sr141716 ถึงความสำคัญของมันเท่านั้นที่ปริมาณสูงสุดของ 20 μเมตร อย่างไรก็ตาม ไม่มีความแตกต่างใน G2 / M ประชากร พบว่า ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า ผลของการเกิดอนุมูลอิสระในเซลล์ sr141716 u251 สามารถเกี่ยวข้องกับ G1 / S ผ่านการยับยั้ง แน่นอน ใน sr141716 รักษาเซลล์ระดับโปรตีนของ G1 / s-specific ที่มี D1 ถูกเลือกลดลงเมื่อเทียบกับการควบคุม ไม่ได้ผลในลักษณะขึ้นอยู่กับ kinase ยับยั้ง p27kip1 ( รูปที่​ ( fig.1d ) 1D ) เพื่อประเมินว่าการยับยั้งเซลล์ proliferation โดย sr141716 คือยังเกี่ยวข้องกับการเกิด เราได้ทำการวิเคราะห์และ cytofluorimetric การตายของเซลล์โดย annexin-v propidium ไอโอไดด์ staining เราพบเพิ่มขึ้นเล็กน้อยใน apoptosis ในเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วยการเซลส์ sr141716 20 μ M ( รูปที่​ ( fig.1e 1E , แผงด้านบน ) ดังนั้นในการควบคุมเซลล์ และ u251 เซลส์ได้รับปริมาณต่ำสุดของ sr141716 ( 10 μ m ) เราไม่ได้ตรวจสอบประมวลผลการศึกษาลักษณะ . ในทางตรงกันข้าม , ในการตอบสนองต่อ sr141716 20 μ M แคสเปส 3 ถูกแหวกเป็นคนกลาง p20 รูปแบบและชนิดของ p17 ปราดเปรียวหลังจากชั่วโมง 48 ของการรักษาและยั่งยืนจนถึง 72 ชั่วโมง ( รูปที่​ ( fig.1e 1E , แผงล่าง ) ตามที่คาดไว้ในวงกว้างสเปกตรัมแคสเปสยับยั้ง z-vad-fmk ยับยั้ง apoptosis ชักนำ ( รูปที่​ ( fig.1f 1f , ซ้าย , แผง ) และแคสเปสด้วย ( รูปที่​ ( fig.1f 1f , แผงด้านขวา ) ในการตอบสนองต่อ 72 ชั่วโมง การรักษาด้วย sr141716 20 μเมตร ถ่ายด้วยกัน ผลลัพธ์ที่แสดงให้เห็นว่า sr141716 มีผลต่อเซลส์เจริญเติบโตของเซลล์ผ่านการยับยั้ง วัฏจักรของเซลล์และความก้าวหน้าการแคสเปสขึ้นอยู่กับเซลล์ความเข้มข้นสูงสุด